一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜判別癌細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜判別癌細(xì)胞的方法。該方法，采用超聲波快速預(yù)處理冰浴條件下孵育的SERS活性納米材料和多種不同類型細(xì)胞后，利用電穿孔方法分別將SERS活性納米材料快速導(dǎo)入不同類型細(xì)胞內(nèi)部，利用拉曼光譜儀檢測獲取癌細(xì)胞的表面增強(qiáng)拉曼光譜，建立多種不同類型細(xì)胞表面增強(qiáng)拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，經(jīng)多變量統(tǒng)計分析進(jìn)行聚類分析，獲得正常細(xì)胞與癌細(xì)胞的表面增強(qiáng)拉曼光譜對應(yīng)的判別散點(diǎn)分布圖，據(jù)此實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的判別。本發(fā)明方法具有快速、易于操作、通用性好及成本低廉、無閃爍的細(xì)胞SERS光譜等特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的癌細(xì)胞檢測，適于在藥物篩選、疾病診斷等【技術(shù)領(lǐng)域】廣泛應(yīng)用。
【專利說明】—種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜判別癌細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種癌細(xì)胞表面增強(qiáng)拉曼光譜判別方法，具體說是將癌細(xì)胞與具有SERS活性的納米材料用脈沖電場進(jìn)行預(yù)處理，檢測癌細(xì)胞的表面增強(qiáng)拉曼光譜信號，最后利用多變量分析技術(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和判別的方法。屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]拉曼光譜(Raman spectroscopy)是一種基于拉曼散射效應(yīng)而發(fā)展起來的分子光譜技術(shù)，采用拉曼光譜技術(shù)可以從分子水平上探測組織細(xì)胞內(nèi)的蛋白、核酸、脂類以及糖類等生物分子的精細(xì)結(jié)構(gòu)和信息。在腫瘤生長和發(fā)展過程中，上述分子的物質(zhì)結(jié)構(gòu)、構(gòu)象和數(shù)量會發(fā)生明顯變化，通過對比研究癌變和正常生物樣本(組織、細(xì)胞或相關(guān)生物分子)的拉曼光譜，從二者的差異可發(fā)現(xiàn)能反映癌變信息的特征光譜，從而可應(yīng)用于癌癥診斷研究。與常規(guī)檢測技術(shù)相比，拉曼光譜技術(shù)具有樣本預(yù)處理簡單、無損、快速等優(yōu)點(diǎn)，然而，拉曼光譜信號非常微弱(約為熒光的萬分之一)，一些與癌癥相關(guān)的指紋信號易被熒光等背景噪聲所掩蓋。因此，如能對拉曼信號進(jìn)行增強(qiáng)，同時抑制熒光等背景信號，將顯著提高癌癥檢測的靈敏度。1974年,Fleishmann等人發(fā)現(xiàn),當(dāng)卩比唳分子吸附在粗糙銀表面上，其拉曼散射信號比溶液中吡啶分子的拉曼散射信號增強(qiáng)約6個數(shù)量級，這種增強(qiáng)效應(yīng)被稱為表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface enhanced Raman scattering, SERS)效應(yīng)，因此表面增強(qiáng)拉曼光譜可簡稱為SERS。最近發(fā)現(xiàn)具有SERS活性的銀納米粒子還能有效地猝滅熒光，進(jìn)一步提高了 SERS檢測的靈敏度，目前SERS增強(qiáng)效應(yīng)最高可達(dá)到IO14-1O15數(shù)量級，實(shí)現(xiàn)了某種意義上可稱之為最高靈敏度的單分子檢測。SERS技術(shù)保留了拉曼光譜的原有優(yōu)點(diǎn)，檢測靈敏度通過SERS和熒光猝滅效應(yīng)得到顯著提高。當(dāng)前將SERS技術(shù)應(yīng)用于癌細(xì)胞檢測已成為國際上拉曼光譜領(lǐng)域的一個研究熱點(diǎn)。如能利用SERS技術(shù)實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的判別，對癌癥的臨床診斷具有重要的意義。為了實(shí)現(xiàn)這一研究目標(biāo)，首先要解決以下兩個技術(shù)難點(diǎn)。
[0003]第一，需發(fā)展一種快速的細(xì)胞SERS檢測方法，這是實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞大規(guī)模篩選的一個必要前提。第二，獲得的細(xì)胞SERS光譜要穩(wěn)定不能出現(xiàn)“閃爍”等現(xiàn)象，這是實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞判別的一個基本保障。然而，現(xiàn)有的癌細(xì)胞SERS檢測方法除有“閃爍”現(xiàn)象外，還存在耗時較長或操作繁復(fù)等問題，如直接孵育方法是一種利用細(xì)胞內(nèi)吞生理功能，即“被動吸收”入具SERS活性的納米材料后實(shí)現(xiàn)細(xì)胞SERS檢測的方法，該方法耗時較長(>20小時)。免疫結(jié)合方法需要制備特異性的免疫SERS探針，即檢測不同種類癌細(xì)胞需要合成不同種類的免疫SERS探針，探針不具備通用性且成本較高。微注射方法操作繁復(fù)，難以實(shí)現(xiàn)批量癌細(xì)胞的SERS檢測。2009年， 申請人:首次提出一種電穿孔細(xì)胞SERS檢測方法，利用該方法能夠在30分鐘內(nèi)獲得癌細(xì)胞的SERS光譜，實(shí)現(xiàn)了癌細(xì)胞的快速SERS檢測。初步解決了第一個技術(shù)難點(diǎn)。
[0004]然而，和其他細(xì)胞SERS檢測方法一樣，利用電穿孔細(xì)胞SERS檢測方法獲得的細(xì)胞SERS光譜也同樣存在“閃爍”現(xiàn)象，即在一定的時間段內(nèi)，連續(xù)對同一細(xì)胞進(jìn)行多次SERS檢測，獲得的多個SERS光譜譜型在峰位、峰強(qiáng)及峰數(shù)上均出現(xiàn)較大的波動。因此，第二個技術(shù)難點(diǎn)還有待解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于提出一種利用電穿孔方法將具有SERS活性的納米材料快速導(dǎo)入癌細(xì)胞，結(jié)合超聲波等方法獲得穩(wěn)定、無閃爍的細(xì)胞SERS光譜，并采用多變量統(tǒng)計分析實(shí)現(xiàn)了癌細(xì)胞判別的方法。該方法具有快速、易于操作、通用性好及成本低廉等特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的癌細(xì)胞檢測，從而克服了現(xiàn)有技術(shù)中的不足。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜判別癌細(xì)胞的方法，其特征在于，采用超聲波快速預(yù)處理冰浴條件下孵育的SERS活性納米材料和多種不同類型細(xì)胞后，利用電穿孔方法分別將SERS活性納米材料快速導(dǎo)入不同類型細(xì)胞內(nèi)部，利用拉曼光譜儀檢測獲取癌細(xì)胞的表面增強(qiáng)拉曼光譜，建立多種不同類型細(xì)胞表面增強(qiáng)拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，經(jīng)多變量統(tǒng)計分析進(jìn)行聚類分析，獲得正常細(xì)胞與癌細(xì)胞的表面增強(qiáng)拉曼光譜對應(yīng)的判別散點(diǎn)分布圖，據(jù)此實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的判別。
[0007]所述的細(xì)胞是指市售的標(biāo)準(zhǔn)癌細(xì)胞和正常細(xì)胞。
[0008]所述的癌細(xì)胞為經(jīng)過體外培養(yǎng)并處于貼壁或懸浮狀的癌細(xì)胞。
[0009]所述的SERS活性納米材料是指銀溶膠或金溶膠。
[0010]該方法包括如下步驟: (I)細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品制備
用市售的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液分別將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，然后通過血球記數(shù)板計算細(xì)胞的含量，調(diào)整細(xì)胞密度至IO4個/ml。
[0011]所述細(xì)胞包括市售的標(biāo)準(zhǔn)癌細(xì)胞和正常細(xì)胞。
[0012](2)拉曼光譜檢測
將銀溶膠或金溶膠與細(xì)胞懸液混合，利用200μ I的移液器通過反復(fù)抽吸的方式混勻，混合均勻后轉(zhuǎn)入電擊杯中，先冰浴5~10分鐘后，再超聲波預(yù)處理30-60秒，立即將電擊杯置電脈沖發(fā)生器的電擊基架上進(jìn)行電脈沖處理，取出電擊杯立即冰浴5~10分鐘，然后轉(zhuǎn)移到預(yù)熱后的培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)10分鐘，最后利用共焦拉曼光譜儀檢測樣品以獲得樣品細(xì)胞的表面增強(qiáng)拉曼光譜。
[0013]所述的銀溶膠或金溶膠使用的摩爾量與細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量比為50毫摩爾:100~20000細(xì)胞數(shù)量比。
[0014]所述的電擊杯電極間隙范圍為I~4mm，電壓在350V~1000V之間，持續(xù)電擊時間100 μ s~50ms。
[0015]所述銀溶膠的制備方法為:
取9~12 mg的固體硝酸銀溶于50 ml去離子水中，加熱至100°C，然后將I ml含有1%~3%的檸橄酸三鈉的水溶液逐滴加入，在加入過程中快速攪拌硝酸銀溶液，滴加完后繼續(xù)保持沸騰2小時~6小時，得到銀溶膠的粗制品，待銀溶膠自然冷卻后，用離心機(jī)離心分層，將上清液丟棄，取下層濃縮的銀溶膠在室溫下避光密封備用。
[0016]所述金溶膠的制備方法為:
取10 mg的氯金酸溶于100ml去離子水中加熱至100°C使之沸騰，然后將2 ml濃度為1%的檸橄酸三鈉逐滴加入，并快速攪拌，滴加完后繼續(xù)保持沸騰15分鐘得到金溶膠。待此金溶膠自然冷卻后，用離心機(jī)離心分層，將上層清液丟棄，取下層濃縮的金溶膠在室溫下避光密封存放備用。
[0017](3)細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品表面增強(qiáng)拉曼光譜數(shù)據(jù)庫的建立
參照步驟(2)的操作，檢測獲得400~4000CHT1波數(shù)范圍內(nèi)不同種已知細(xì)胞種類的表面增強(qiáng)拉曼光譜，利用origin軟件(8.0以上版本)對不同種細(xì)胞表面增強(qiáng)拉曼光譜統(tǒng)一進(jìn)行歸一化處理，以去除儀器系統(tǒng)誤差和環(huán)境變化造成的影響。最后對歸一化處理后的細(xì)胞表面增強(qiáng)拉曼光譜進(jìn)行聚類分析，建立用于判別和區(qū)分細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品表面增強(qiáng)拉曼光譜數(shù)據(jù)庫。
[0018](4)癌細(xì)胞判別
取一種未知的癌細(xì)胞，采用步驟(1)和(2)的操作，得到細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品表面增強(qiáng)拉曼光譜數(shù)據(jù)；將該數(shù)據(jù)與步驟(3)建立的細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品表面增強(qiáng)拉曼光譜數(shù)據(jù)庫相對比，判別出未知癌細(xì)胞的種類。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是本發(fā)明對正常鼻咽NP69細(xì)胞和鼻咽癌C666細(xì)胞表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測譜線圖。
[0020]圖2是本發(fā)明對正常鼻咽NP69細(xì)胞和鼻咽癌C666細(xì)胞的表面增強(qiáng)拉曼光譜PCA分析散點(diǎn)圖。
[0021]圖3是本發(fā)明對正常肝HL7702細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測譜線圖。`
[0022]圖4是本發(fā)明對正常肝HL7702細(xì)胞和肝癌!fepG2細(xì)胞的表面增強(qiáng)拉曼光譜PCA分析散點(diǎn)圖。
[0023]圖1和圖3中縱坐標(biāo)為譜線的強(qiáng)度，單位為任意單位(a.u)橫坐標(biāo)為各特征譜線的峰位置，以波數(shù)(cnT1)表示。
【具體實(shí)施方式】
[0024]本發(fā)明的具體實(shí)施細(xì)節(jié)闡述如下:
(I)細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品制備
取液氮凍存的細(xì)胞通過水浴搖床復(fù)蘇，然后接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，3天后胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，PBS緩沖液洗細(xì)胞三次，最后用市售的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液制成細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品。
[0025]前述步驟可優(yōu)化為:
細(xì)胞接種密度為I X 1Vcm2，血清含量為10%~20%，細(xì)胞接種24小時后大部分貼壁，3天后細(xì)胞生長狀態(tài)最佳時，用PH7.2的PBS緩沖液將細(xì)胞洗3次，再加入0.25%胰酶，覆蓋細(xì)胞約30s后吸去胰酶，37°C放置2~3 min，即可完全消化好細(xì)胞。
[0026](2)拉曼光譜檢測
將電脈沖處理后的細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品滴加在氟化鎂晶片上，待細(xì)胞自然沉積在晶片表面后，利用拉曼光譜儀檢測細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品，拉曼光譜儀測量參數(shù)設(shè)定為:激光波長785nm，采樣時間10s，激發(fā)光功率約3.5mw。
[0027](3)數(shù)據(jù)分析處理
將細(xì)胞表面增強(qiáng)拉曼光譜數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS軟件分析工具欄中的PCA方法進(jìn)行計算，具體步驟如下:①計算歸一化后各波數(shù)的協(xié)方差矩陣；②計算矩陣的本征值和本征向量；③利用T檢驗(yàn)獲得最有顯著性差異的PCA得分。最后根據(jù)選出的主成份建立相應(yīng)的分析散點(diǎn)圖，從而獲得表面增強(qiáng)拉曼光譜分析模型。
[0028]實(shí)施例1
利用表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測判別正常鼻咽NP69細(xì)胞和鼻咽癌C666細(xì)胞取銀溶膠與正常鼻咽NP69細(xì)胞或鼻咽癌C666細(xì)胞100 μ I和400 μ 1，室溫下混合后轉(zhuǎn)入一電擊杯中，電擊杯電極間隙為1mm，其中細(xì)胞數(shù)量約為4000個。將電擊杯冰浴5分鐘，超聲波預(yù)處理30秒，然后置于電穿孔儀內(nèi)，選擇手動控制，加電壓350V，持續(xù)時間100ms，電穿孔后，立即使用400 μ I RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞沖洗出樣品池，置冰浴中5min后，轉(zhuǎn)移到預(yù)熱后的培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)10分鐘，然后利用共焦拉曼光譜儀進(jìn)行單細(xì)胞表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測。檢測樣品時采用的激光波長為785nm，功率為3.75mW，收集波長范圍450 cm—1~1800cm-1，正常鼻咽NP69細(xì)胞和鼻咽癌C666細(xì)胞表面增強(qiáng)拉曼光譜如圖1所示。將獲得正常鼻咽NP69細(xì)胞和鼻咽癌C666細(xì)胞表面增強(qiáng)拉曼光譜對應(yīng)的數(shù)據(jù)列表輸入SPSS軟件，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)置建立樣本矩陣，應(yīng)用SPSS軟件分析工具欄中的PCA方法進(jìn)行計算，建立相應(yīng)的分析散點(diǎn)圖如圖2所示，從而實(shí)現(xiàn)鼻咽癌C666細(xì)胞的判別。
[0029]實(shí)施例2 利用表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測判別正常肝HL7702細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞取金溶膠與正常肝HL7702細(xì)胞和肝癌H印G2細(xì)胞250 μ I和650 μ 1，室溫下混合后轉(zhuǎn)入一電擊杯中，電擊杯電極間隙為4mm，其中細(xì)胞數(shù)量約為6000個。將電擊杯冰浴8分鐘，超聲波預(yù)處理60秒，然后置于電穿孔儀內(nèi)，選擇手動控制，加電壓880V，持續(xù)時間50 ms,電穿孔后，立即使用800μ1 RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞沖洗出樣品池，置冰浴中8min后，轉(zhuǎn)移到預(yù)熱后的培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)15分鐘，然后利用共焦拉曼光譜儀進(jìn)行單細(xì)胞表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測。檢測樣品時采用的激光波長為785nm，功率為0.1mff,取譜范圍為400 cm—1~1750 cnT1，正常肝HL7702細(xì)胞和肝癌!fepG2細(xì)胞表面增強(qiáng)拉曼光譜如圖3所示。PCA分析同實(shí)施例1。建立的分析散點(diǎn)圖如圖4所示，從而實(shí)現(xiàn)肝癌HepG2細(xì)胞的判別。
【權(quán)利要求】
1.一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜判別癌細(xì)胞的方法，其特征在于:采用超聲波快速預(yù)處理冰浴條件下孵育的SERS活性納米材料和多種不同類型細(xì)胞后，利用電穿孔方法分別將SERS活性納米材料快速導(dǎo)入不同類型細(xì)胞內(nèi)部，利用拉曼光譜儀檢測獲取細(xì)胞的表面增強(qiáng)拉曼光譜，建立多種不同類型細(xì)胞表面增強(qiáng)拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，經(jīng)多變量統(tǒng)計分析進(jìn)行聚類分析，獲得正常細(xì)胞與癌細(xì)胞的表面增強(qiáng)拉曼光譜對應(yīng)的判別散點(diǎn)分布圖，據(jù)此實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的判別。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜判別癌細(xì)胞的方法，其特征在于該方法包括如下步驟: (1)細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品制備 用市售的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液分別將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，然后通過血球記數(shù)板計算細(xì)胞的含量，調(diào)整細(xì)胞密度至I X IO4個/ml ； (2)拉曼光譜檢測 將預(yù)制好的銀溶膠或金溶膠分別與不同類型細(xì)胞懸液混合，混合均勻后轉(zhuǎn)入電擊杯中；先后經(jīng)冰浴5~10分鐘、超聲波預(yù)處理后，立即將電擊杯置電脈沖發(fā)生器的電擊基架上進(jìn)行電脈沖處理，取出電擊杯立即冰浴5~10分鐘，然后轉(zhuǎn)移到預(yù)熱后的培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)10分鐘，最后利用共焦拉曼光譜儀檢測樣品以獲得不同類型樣品細(xì)胞的表面增強(qiáng)拉曼光譜； (3)細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品表面增強(qiáng)拉曼光譜數(shù)據(jù)庫的建立 參照步驟(2)的操作，檢測獲得400~4000CHT1波數(shù)范圍內(nèi)不同種已知細(xì)胞種類的表面增強(qiáng)拉曼光譜，利 用8.0以上版本的origin軟件對不同種細(xì)胞表面增強(qiáng)拉曼光譜進(jìn)行聚類分析和數(shù)據(jù)分析處理，建立用于判別和區(qū)分細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品表面增強(qiáng)拉曼光譜數(shù)據(jù)庫； (4)癌細(xì)胞判別 取一種未知的癌細(xì)胞，采用步驟(1)和(2)的操作，得到細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品表面增強(qiáng)拉曼光譜數(shù)據(jù)；將該數(shù)據(jù)與步驟(3)建立的細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品表面增強(qiáng)拉曼光譜數(shù)據(jù)庫相對比，判別出未知癌細(xì)胞的種類。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜判別癌細(xì)胞的方法，其特征在于所述細(xì)胞包括市售的標(biāo)準(zhǔn)癌細(xì)胞和正常細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜判別癌細(xì)胞的方法，其特征在于所述的銀溶膠或金溶膠使用的摩爾量與細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量比為50毫摩爾:100~20000細(xì)胞數(shù)量比。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜判別癌細(xì)胞的方法，其特征在于所述的電擊杯電極間隙范圍為I~4mm，電壓在350V~1000V之間，持續(xù)電擊時間100 μ s ~50ms。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜判別癌細(xì)胞的方法，其特征在于所述的細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品制備，其過程是細(xì)胞接種24小時~72小時后，用pH值為7.2的PBS緩沖液將細(xì)胞洗3次，再加入0.25%胰酶，覆蓋細(xì)胞約30s后吸去胰酶，37°C放置2~3 min即可。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜判別癌細(xì)胞的方法，其特征在于所述的拉曼光譜儀測量，參數(shù)設(shè)定為:激光波長785nm，采樣時間10s，激發(fā)光功率約.3.5~3.75麗，收集波長范圍450 cm 1~1800cm 1O
8.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜判別癌細(xì)胞的方法，其特征在于所述的超聲波預(yù)處理，處理時間30~60秒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜判別癌細(xì)胞的方法，其特征在于所述的數(shù)據(jù)分析處理，是指將細(xì)胞表面增強(qiáng)拉曼光譜數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS軟件分析工具欄中的PCA方法進(jìn)行計算，具體步驟如下:①計算歸一化后各波數(shù)的協(xié)方差矩陣；②計算矩陣的本征值和本征向量；③利用T檢驗(yàn)獲得最有顯著性差異的PCA得分；最后根據(jù)選出的主成份建立相應(yīng)的分析散點(diǎn)圖，從而獲得表面增強(qiáng)拉曼光譜分析模型。
【文檔編號】G01N21/65GK103487425SQ201310413243
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】林居強(qiáng), 陳榮, 馮尚源, 陳冠楠, 黃祖芳, 俞允, 陸鵬 申請人:福建師范大學(xué)