專利名稱：一種結(jié)核分枝桿菌cfp10抗原蛋白串聯(lián)重組表達(dá)方法及其在結(jié)核檢測中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域及醫(yī)學(xué)免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及結(jié)核病病人和結(jié)核桿菌感染者的快速、早期特異的檢測方法，具體的涉及一種結(jié)核分枝桿菌CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白及其應(yīng)用，特別是一種結(jié)核病抗原CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白特異的全血IFN- Y結(jié)核診斷試劑盒及TCELL-SP0T結(jié)核感染診斷試劑盒的制作方法和應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染所致的人類疾病，主要通過呼吸道傳播，且疫情發(fā)展日趨嚴(yán)重。結(jié)核病的預(yù)防、早期診斷和及時治療意義重大。MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv被廣泛應(yīng)用于TB相關(guān)的生物醫(yī)藥研究，其特異性抗原的制備備受關(guān)注。目前常用的結(jié)核特異抗原可以通過基因工程方法大量制備，是結(jié)核診斷的基礎(chǔ)。但是目前多集中于單獨一種抗原的表達(dá)、單獨抗原表位的表達(dá)、多種抗原聯(lián)合表達(dá)的方法獲得結(jié)核特異抗原，少有單一抗原串聯(lián)重組表達(dá)的研究，且結(jié)核特異性抗原多直接用血清學(xué)方法檢測結(jié)核感染，靈敏度低、特異性差。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種用基因工程方法生產(chǎn)的結(jié)核CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白作為抗原，特異性強(qiáng)且易于純化，用其作為特異抗原制備了全血IFN-Y結(jié)核診斷試劑盒及TCELL-SP0T結(jié)核感染診斷試劑盒，為結(jié)核病感染的檢測提供更為特異、靈敏、準(zhǔn)確的工具。一種編碼結(jié)核分枝桿菌CFPlO的密碼子優(yōu)化基因序列，其單拷貝核昔酸序列CFPIOcI如SEQ ID N0.1所示，2次拷貝串聯(lián)核苷酸序列CFP10c2如SEQ ID N0.2所示，3次拷貝串聯(lián)核苷酸序列CFP10 c3如SEQ ID N0.3所示，4次拷貝串聯(lián)核苷酸序列CFP10c4如SEQ ID N0.4所示，5次拷貝串聯(lián)核苷酸序列CFP10c5如SEQ ID N0.5所示，6次拷貝串聯(lián)核苷酸序列CFP10c6如SEQ ID N0.6所示，CFPlO基因串聯(lián)次數(shù)包括但不限于I 一 6次。結(jié)核分枝桿菌CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白，它由所述的密碼子優(yōu)化基因序列編碼，其單拷貝氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示，2次拷貝氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示，3次拷貝氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示，4次拷貝氨基酸序列如SEQ ID N0.10所示，5次拷貝氨基酸序列如SEQ ID N0.11所示，6次拷貝氨基酸序列如SEQ ID N0.12所示，CFPlO蛋白串聯(lián)次數(shù)包括但不限于I 一 6次。結(jié)核分枝桿菌CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白的表達(dá)載體，其將上述的密碼子優(yōu)化基因序列分別插入到質(zhì)粒pET-16b上，得到重組質(zhì)粒CFP10cl-pET16b、CFP10c2_pET16b、CFP10c3-pET16b、CFP10c4_pET16b、CFP10c5_pET16b 或 CFP10c6_pET16b，載體包括但不限于 pET16b。一種表達(dá)結(jié)核分枝桿菌CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白的工程菌株，它含有上述的表達(dá)載體，其宿主菌為大腸桿菌{Escherichia coli) 一種基于所述結(jié)核分枝桿菌CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白建立的體外檢測結(jié)核桿菌感染的化學(xué)發(fā)光法試劑盒，其利用上述的結(jié)核分枝桿菌CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白，刺激受檢者的外周血釋放Y-干擾素，并通過化學(xué)發(fā)光方法測定Y-干擾素的變化，診斷是否感染結(jié)核分枝桿菌。一種基于所述結(jié)核分枝桿菌CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白建立的體外檢測結(jié)核桿菌感染的TCELL-SP0T試劑盒，其上述的結(jié)核分枝桿菌CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白，刺激受檢者的外周血T淋巴細(xì)胞，并通過ELISPOT方法測定斑點形成的多少，診斷是否感染結(jié)核分枝桿菌。所述的結(jié)核分枝桿菌CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白在制備單抗、多抗、檢測試劑盒及蛋白芯片中的應(yīng)用。


圖1重組質(zhì)粒CFP10cl-pET16b的構(gòu)建示意 圖2重組質(zhì)粒CFP10c2-pET16b的構(gòu)建示意 圖3重組質(zhì)粒CFP10c3-pET 16b的構(gòu)建示意 圖4重組質(zhì)粒CFP10c4-pET16b的構(gòu)建示意 圖5重組質(zhì)粒CFP10c5-pET16b的構(gòu)建示意 圖6重組質(zhì)粒CFP10c6-pET16b的構(gòu)建示意 圖7 CFPIOcI重組融合蛋白的純化圖，圖中泳道1，2，3 =CFPIOcI純化帶；泳道4:CFPIOcI純化前；泳道5 =CFPIOcI純化后；泳道6:NEB蛋白Marker ；
圖8 CFP10c2重組融合蛋白的純化圖，圖中泳道1，2，3，4:CFP10c2純化帶；泳道:5:CFP10c2純化后；泳道6:CFP10c2純化前；泳道7 =NEB蛋白Marker ；
圖9 CFP10c3重組融合蛋白的純化圖，圖中泳道1:NEB蛋白Marker ;泳道2:CFP10c3純化前；泳道3:CFP10c3純化后；泳道4，5，6，7:CFP10c3純化帶；
圖10 CFP10c4重組融合蛋白的純化圖，圖中泳道1: NEB蛋白Marker ;泳道2:CFP10c4純化前；泳道3:CFP10c4純化后；泳道4，5，6，7:CFP10c4純化帶；
圖11 CFP10c5重組融合蛋白的純化圖，圖中泳道1，2，3:CFP10c5純化帶；泳道4:CFP10c5純化前；泳道5:CFP10c5純化后；泳道6 =NEB蛋白Marker ；
圖12 CFP10c6重組融合蛋白的純化圖，圖中泳道1:CFP10c6純化后；泳道2:CFP10c6純化前；泳道3，4，5，6，7:CFP10c6純化帶；泳道8 =NEB蛋白Marker ；
圖13為:TCELL-SP0T的檢測結(jié)果圖，圖中a為結(jié)核感染者陽性對照孔；b為結(jié)核感染者CFPIOcI檢測孔；c為結(jié)核感染者CFP10c2檢測孔；d為結(jié)核感染者CFP10c3檢測孔；e為結(jié)核感染者CFP10c4檢測孔；f為結(jié)核感染者CFP10c5檢測孔；g為結(jié)核感染者CFP10c6檢測孔；h為結(jié)核感染者陰性對照孔。
具體實施例方式以下以通過優(yōu)選實施例對本發(fā)明工藝作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。
具體實施例方式下面對本發(fā)明進(jìn)一步說明。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例1結(jié)核分枝桿菌CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白的制備
分析編碼結(jié)核特異性抗原CFPlO的核苷酸序列，并結(jié)合疋coli的密碼子偏好性，對CFPlO的核苷酸進(jìn)行同義密碼子的優(yōu)化，并在其編碼序列的兩端加入設(shè)計好的限制性酶切位點，從而實現(xiàn)序列的串聯(lián)表達(dá)。經(jīng)過優(yōu)化的核苷酸序列如下:
catatgggaattcccatggaggatccgatggcagagatgaagaccgatgccgctaccctggcgcaggaggcaggtaatttcgagcgtatctccggcgacctgaaaacccagatcgaccaggtggagtctacggcaggttcgttgcagggtcagtggcgcggtgcagcaggtacggcagcacaggcagcagtggtgcgcttccaagaagcagccaataagcagaagcaggaactcgacgaaatctcgacgaatattcgtcaggccggcgtccaatactctcgtgccgacgaggagcagcagcaggcgctgtcctcgcaaatgggcttcgcagatctggctaagcttcccgggtcgactcgagcggccgc
序列上游加入NdeI, NcoI和BamHl ;在序列下游加入HindIII, BglII和XhoI等限制性酶切位點。并將上述序列委托大連寶生物通過基因合成的方式連入PMD-19T simple，命名為 CFP10cl-19T simple。1.堿小量法質(zhì)粒提取
a.將含有CFP10cl-19T simple的大腸桿菌培養(yǎng)過夜后離心。向細(xì)菌沉淀中加入200μ L Solution I (GTE: 50 mmol/L 葡萄糖；25 mmol/L pH 8.0 Tris.HCl ; 10 mmol/LEDTA)，充分混勻，直至菌體完全重懸。b.再向離心管加入新配制的 200 μ LSolutionI 1(1% SDS ; 0.2 mo I/L NaOH)，立即輕緩倒置數(shù)次，直至混合均勻溶液澄清。c.加入 200 M-L SolutionIII ( 5mol/L 乙酸鉀 60mL ;冰乙酸 11.5mL ;水28.5mL)，立即輕緩倒置數(shù)次，有大量白色沉淀出現(xiàn)，冰水浴中放置5 min。d.2，000 r/min離心5 min,取上清,加入等體積的氯仿/異戍醇充分混勻。e.12, 000 r/min離心10 min,取上清,加入2倍體積無水乙醇沉淀。f.12, 000 r/min離心10 min,棄上清,加入500 70%乙醇洗漆沉淀。g.12, 000 r/min離心5 min,棄上清,烘干后加入100 ρΗ8.0的TE緩沖液或無菌水，置于-20°C保存?zhèn)溆谩?.酶切
用BamH I和Hind III 37°C過夜雙酶切對CFP10cl_19T simple，獲得帶粘性末端的CFP10目的基因。酶切體系如下:
BamH I2ul
Hind III2ul
Buffer4ul
CFP10cl-19T simple20ul
水12ul
用Bgl II和HindIII 37°C過夜 雙酶切CFP10cl_19T simple，獲得帶同樣粘性末端的CFP10cl-19T’ simple片段。酶切體系如下:
Bgl II2ul
Hind III2ul
Buffer4ul
CFP10cl-19T simple20ul
水12ul
3.膠回收
a.對酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外條件下切除含有目的帶的膠塊，稱重后加入3倍的Binding Buffer, 55°C水浴使膠完全溶解。b.將DNA溶液轉(zhuǎn)入DNA結(jié)合柱，套入到一個2 mL的收集管中室溫10000 rpmin離心I min。c.棄廢液,用Wash Buffer洗柱兩邊后烘干。d.將DNA結(jié)合住套入新的無菌離心管中，加入50 μ L無菌水，室溫放置I min，大于13000 r/min離心I min。即得到目的基因的膠回收產(chǎn)物。4.連接
16°C條件下用T4連接酶，連接過夜。反應(yīng)體系如下:
CFP10cl-19T’ simple1.5ul
CFPlO5.5ul
BufferIul
T4 LigaseIul
5.^.coli感受態(tài)細(xì)胞的制備
a.挑取平板上的大腸桿菌DH5 α單菌落接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩(約150rpm)培養(yǎng)過夜。b.取該過夜菌體培養(yǎng)液以1:100的比例接種于100 mL新鮮LB培養(yǎng)液中，37°C劇烈振蕩(約150 rpm)培養(yǎng)至OD6tltl = 0.4 - 0.6 (約2.5 h)，放置冰浴中停止培養(yǎng)。c.將b中新培養(yǎng)的菌液分裝于已滅菌的離心管中，ImL/管，1，500 g，4°C離心5min,棄去上清(盡量除盡上清)。d.在每個離心管加入100 μ L冰中預(yù)冷的solution A，輕輕彈動離心管使沉淀
懸浮，禁止劇烈震蕩。e.1, 500 g,4°C離心5 min,棄去上清(盡量除盡上清)。f.在每個離心管加入100 μ L冰中預(yù)冷的solution B，輕輕彈動離心管使沉淀懸浮。6.轉(zhuǎn)化
b.于每管感受態(tài)細(xì)胞中加入5 μ L連接反應(yīng)物(體積比2 - 5%)，輕輕轉(zhuǎn)動混勻后冰浴中放置30 min。c.42°C熱擊60 sec后，迅速置冰上2 min。d.每個離心管中加入900 yL37 °C預(yù)溫的LB培養(yǎng)基。e.37°C震蕩(100 r/min)培養(yǎng) I h。f.取400 μ L上述菌液,涂布于含氨節(jié)青霉素(Amp, 100 μ g/mL)的LB平板上，37 °C倒置培養(yǎng)過夜。7.重組質(zhì)粒鑒定
將挑取轉(zhuǎn)化后的平板單菌落過夜培養(yǎng)后，取Iml進(jìn)行DNA測序，測序結(jié)果與所預(yù)期的結(jié)果一致，無突變，編碼框正確無移碼，命名為CFP10c2-19T simple。提取測序正確的重組質(zhì)粒，用BamH I和Hind III雙酶切，酶切后電泳檢測為710bp左右，與CFP10c2大小一致。Bgl II和Hind III雙酶切，以CFP10cl_19T為參照，電泳顯示CFP10c2-19T用Bgl II和Hind III雙酶切后片段大于CFP10cl_19T用Bgl II和Hind III雙酶切后的片段，與預(yù)期結(jié)果一致。8.目的基因三次串聯(lián)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
回收CFP10c2-19T用BamH I和Hind III雙酶切后產(chǎn)生的CFP10c2片段，與具有粘性末端的CFP10cl-19T相連，轉(zhuǎn)化后同樣進(jìn)行酶切和測序鑒定，鑒定正確的即為CFP10c3-19T。9.目的基因四次串聯(lián)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
回收CFP10c3-19T用Bgl II和Hind III雙酶切后產(chǎn)生的CFP10c3_19T片段，與CFPIOcI片段相連，轉(zhuǎn)化后同樣進(jìn)行酶切和測序鑒定，鑒定正確的即為CFP10c4_19T。10.目的基因五次串聯(lián)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
回收CFP10c4-19T用Bgl II和Hind 111雙酶切后產(chǎn)生的0 1(^4-191'片段，與經(jīng)83111!1I和Hind III雙酶切后產(chǎn)生的CFP10c4片段相連，轉(zhuǎn)化后同樣進(jìn)行酶切和測序鑒定，鑒定正確的即為CFP10c5-19T。 11.目的基因六次串聯(lián)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
回收CFP10c5-19T用Bgl II和Hind III雙酶切后產(chǎn)生的CFP10c5_19T片段，與經(jīng)BamHI和Hind III雙酶切后產(chǎn)生的CFP10c5片段相連，轉(zhuǎn)化后同樣進(jìn)行酶切和測序鑒定，鑒定正確的即為CFP10c6-19T。12.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
用 Nde I 及 Xho I 雙酶切 CFP10cl_19T，CFP10c2_19T，CFP10c3_19T，CFP10c4_19T，CFP10c5-19T, CFP10c6-19T 和表達(dá)載體 pET16b。分別回收 CFPlOcl，CFP10c2, CFP10c3,CFP10c4, CFP10c5, CFP10c6目的片段和pET16b質(zhì)粒片段。連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta-gami (DE3)菌株，37°C倒置過夜培養(yǎng)。挑取單菌落于氨芐和卡那雙抗LB培養(yǎng)基中(氨芐終濃度100ug/ml，卡那終濃度50ug/ml)，37°C震蕩培養(yǎng)過夜，提取重組表達(dá)質(zhì)粒。13.重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
以所提取重組表達(dá)質(zhì)粒為模板，用pET16b的測序引物做PCR鑒定；同時做Nde I和Xho I雙酶切鑒定。將鑒定的陽性克隆分別命名為CFP10cl-pET16b，CFP10c2_pET16b,CFP10c3-pET16b, CFP10c4_pET16b，CFP10c5_pET16b 和 CFP10c6_pET16b。14.基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定
將含有 CFP10cl-pET16b， CFP10c2_pET16b， CFP10c3_pET16b， CFP10c4_pET16b，CFP10c5-pET16b 和 CFP10c6_pET16b 的 Rosetta-gami (DE3) 37°C震蕩培養(yǎng)過夜，再按 1% 的接種量轉(zhuǎn)接與氨芐和卡那雙抗LB培養(yǎng)基中，待OD值為0.60.8時，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體Iml,離心后按比例加入Loading buffer和PBS后，重懸菌體，至沸水中煮510min，12000rpm離心5min后取IOul進(jìn)行SDS-PAGE電泳，同時以pET16b-Rosetta-gami (DE3)作為對照。12%分離膠，100V恒壓，電泳2h,電泳結(jié)束后，脫色至條帶清晰。根據(jù)電泳結(jié)果將有明顯的表達(dá)帶的菌株分別命名為CFP10cl-pET16b-ROSetta-gami (DE3)、CFP10c2-pET16b-Rosetta_gami(DE3)、CFP10c3-pET16b-Rosetta_gami(DE3)、CFP10c4-pET16b-Rosetta-gami(DE3)、CFP10c5-pET16b-Rosetta_gami(DE3)和 CFPlOc6-pET16b-Rosetta-gami(DE3)。15.基因工程菌誘導(dǎo)條件的優(yōu)化
應(yīng)用 0.2，0.4，0.6，0.6，0.8，1.0，1.2mM 濃度的 IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)，并在 2h，4h，6h，8h，及過夜條件下分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。同時將過夜誘導(dǎo)菌進(jìn)行超聲破碎，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳。從而確定IPTG濃度和誘導(dǎo)時間以及是上清表達(dá)或包涵體。16.重組蛋白的純化
誘導(dǎo)菌收集后破碎，用0.22um濾膜過濾后，采用GE公司的AKTA plus蛋白純化系統(tǒng)和HisTrap HP 預(yù)裝柱親和純化 CFPlOcl，CFP10c2, CFP10c3, CFP10c4, CFP10c5 和 CFP10c6 重組蛋白。SDS-PAGE檢測結(jié)果表明目的條帶單一，無雜帶。實施例2基于結(jié)核分枝桿菌CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白的人結(jié)核桿菌檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)
包裝規(guī)格
9人份/盒(48T) 21人份/盒(96T)
預(yù)期用途
本試劑盒采用化學(xué)發(fā)光雙抗體夾心法定量測定人血液樣本中T淋巴細(xì)胞在結(jié)核桿菌特異抗原多肽刺激后分泌的人干擾素-Y (Interferon- y，IFN- Y )的含量。結(jié)核桿菌感染主要引起的是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。作為免疫應(yīng)答的一部分，T淋巴細(xì)胞接受結(jié)核桿菌特異抗原多肽刺激成為活化的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子IFN- Y。通過檢測樣本中IFN- Y的含量可以推測體內(nèi)是否存在對結(jié)核桿菌反應(yīng)的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，從而對結(jié)核桿菌感染進(jìn)行輔助診斷。檢驗原理
本試劑盒是利用結(jié)核桿菌感染者血液樣本中存在結(jié)核桿菌特異的活化T淋巴細(xì)胞，這些T淋巴細(xì)胞在受到結(jié)核桿菌特異抗原多肽刺激后分泌IFN-Y設(shè)計而成的。將新鮮血液樣本、結(jié)核桿菌特異抗原多肽A/結(jié)核桿菌特異抗原多肽B或陽性對照試劑一起加入細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)血液樣本中存在針對結(jié)核桿菌的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞時，培養(yǎng)液中加入的結(jié)核桿菌特異抗原多肽A和B將刺激這些效應(yīng)T淋巴細(xì)胞分泌IFN-Y。將抗IFN-Y抗體包被微孔反應(yīng)板，制成固相抗體，加入培養(yǎng)液上清，同時加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗IFN-Y抗體。如培養(yǎng)液上清中含有IFN-Y時，就與包被抗IFN-Y抗體、酶標(biāo)記抗IFN-Y抗體結(jié)合形成復(fù)合物，加入底物液而發(fā)光，測定相對光信號(RLU)。通過數(shù)據(jù)處理分析，即可判定培養(yǎng)液上清中IFN-Y的含量，以此推測體內(nèi)是否存在對結(jié)核桿菌反應(yīng)的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，從而對結(jié)核桿菌感染進(jìn)行輔助診斷。主要組成成份
1.人干擾素-Y檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)
__48人份_96人份_
標(biāo)準(zhǔn)品_人干擾素 _ Y 含量為 O (A)、50 (B)、125(C)、312.5 (P)、800 (E).2000 (F) pg/ml，6 瓶_ (0.5±0.l)ml/瓶(0.5±0.l)ml/瓶
包被孔包被有抗人干擾素-Y抗體的聚苯乙烯微孔—48孔96孔
30倍酶濃縮液I辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人干擾素-Y抗體， I管|(100±15)μ1 |(200±15)μ1 _
權(quán)利要求
1.一種編碼結(jié)核分枝桿菌CFPio的密碼子優(yōu)化基因序列，其特征在于:其單拷貝核昔酸序列CFPIOcI如SEQ ID N0.1所示，2次拷貝串聯(lián)核苷酸序列CFP10c2如SEQ ID N0.2所示，3次拷貝串聯(lián)核苷酸序列CFP10c3如SEQ ID N0.3所示，4次拷貝串聯(lián)核苷酸序列CFP10c4如SEQ ID N0.4所示，5次拷貝串聯(lián)核苷酸序列CFP10c5如SEQ ID N0.5所示，6次拷貝串聯(lián)核苷酸序列CFP10c6如SEQ ID N0.6所示，CFPlO基因串聯(lián)次數(shù)包括但不限于I 一6次。
2.結(jié)核分枝桿菌CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白，其特征在于:它由權(quán)利要求1所述的密碼子優(yōu)化基因序列編碼，其單拷貝氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示，2次拷貝氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示，3次拷貝氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示，4次拷貝氨基酸序列如SEQID N0.10所示，5次拷貝氨基酸序列如SEQ ID N0.11所示，6次拷貝氨基酸序列如SEQ IDN0.12所示，CFPlO蛋白串聯(lián)次數(shù)包括但不限于I 一 6次。
3.結(jié)核分枝桿菌CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白的表達(dá)載體，其特征在于:將權(quán)利要求1所述的密碼子優(yōu)化基因序列分別插入到質(zhì)粒pET-16b上，得到重組質(zhì)粒CFPIO c 1-pET 16b、CFP10c2-pET16b、CFP10c3-pET16b、CFP10c4-pET16b、CFP10c5-pET16b 或 CFP10c6_pET16b，載體包括但不限于pET16b。
4.一種表達(dá)結(jié)核分枝桿菌CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白的工程菌株，其特征在于:它含有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體,其宿主菌為大腸桿菌{Escherichia coli)
5.一種基于權(quán)利要求2所述的結(jié)核分枝桿菌CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白建立的體外檢測結(jié)核桿菌感染的化學(xué)發(fā)光法試劑盒，其特征在于:利用權(quán)利要求2所述的結(jié)核分枝桿菌CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白，刺激受檢者的外周血釋放Y-干擾素，并通過化學(xué)發(fā)光方法測定Y-干擾素的變化，診斷是否感染結(jié)核分枝桿菌。
6.一種基于權(quán)利要求2所 述的結(jié)核分枝桿菌CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白建立的體外檢測結(jié)核桿菌感染的TCELL-SPOT試劑盒，其特征在于:利用權(quán)利要求2所述的結(jié)核分枝桿菌CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白，刺激受檢者的外周血T淋巴細(xì)胞，并通過ELISPOT方法測定斑點形成的多少，診斷是否感染結(jié)核分枝桿菌。
7.權(quán)利要求2所述的結(jié)核分枝桿菌CFPlO串聯(lián)重組融合蛋白在制備單抗、多抗、檢測試劑盒及蛋白芯片中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公布一種結(jié)核分枝桿菌CFP10串聯(lián)重組融合蛋白及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種結(jié)核分枝桿菌CFP10密碼子優(yōu)化方法、串聯(lián)重組融合方法及融合蛋白制備方法，還提供了該重組融合蛋白在全血IFN-γ結(jié)核診斷試劑盒及TCELL-SPOT結(jié)核感染診斷試劑盒的制作和應(yīng)用方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點，很好的滿足了結(jié)核(TB)感染臨床診斷的需要。
文檔編號G01N33/68GK103146714SQ201310076460
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月20日
發(fā)明者楊艷坤, 林興兵, 白仲虎, 劉曉磊, 李昕, 朱國珍, 曹成, 付建軍 申請人:鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司