專(zhuān)利名稱(chēng):一種基因組多拷貝基因拷貝數(shù)的快速批量測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及一種基因測(cè)定方法,尤其涉及一種利用PCR技術(shù)和RT-PCR技術(shù)對(duì)基因組多拷貝基因拷貝數(shù)的快速批量測(cè)定方法。
背景技術(shù):
:拷貝數(shù)目變異(copy-number variant, CNV)也稱(chēng)拷貝數(shù)目多態(tài)(copy-numberpolymorphism, CNP),是一種大小介于Ikb至3Mb的DNA片段的變異,在人類(lèi)基因組中廣泛分布,其覆蓋的核苷酸總數(shù)大大超過(guò)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphisms, SNPs)的總數(shù),極大地豐富了基因組遺傳變異的多樣性,CNV對(duì)于物種特異的基因組構(gòu)成、物種的演化和系統(tǒng)發(fā)育以及基因組某些特定區(qū)域基因的表達(dá)和調(diào)控可能具有非常重要的生物學(xué)意義,已有研究發(fā)現(xiàn),CNV發(fā)生的頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于染色體結(jié)構(gòu)變異,而且在整個(gè)基因組中覆蓋的核苷酸總數(shù)大大超過(guò)SNP的總數(shù),由此,研究者們認(rèn)為,CNV可能和表型變異緊密關(guān)聯(lián),同時(shí)在物種的演化和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,同時(shí),研究者們還認(rèn)為此類(lèi)變異是基因組中最主要的變異,是導(dǎo)致個(gè)體間表型差異及各種遺傳性疾病和疾病易感性的主要原因,如自閉癥(autism),精神分裂癥(schizophrenia)和克羅恩病(Crohn' sdisease)的致病機(jī)理就是因?yàn)檎5亩嗫截惢蚩截悢?shù)突然改變,導(dǎo)致疾病的發(fā)生,所以對(duì)生物體多拷貝基因拷貝數(shù)的快速、準(zhǔn)確測(cè)定可以對(duì)人類(lèi)某些疾病的診斷和治療提供生物學(xué)方法以及對(duì)生命科學(xué)中相關(guān)現(xiàn)象的生理機(jī)制研究提供科學(xué)手段?,F(xiàn)行測(cè)定基因拷貝數(shù)的方法主要有:1、基因組測(cè)序法:是通過(guò)多種測(cè)序方法對(duì)整個(gè)基因組的所有基因序列進(jìn)行測(cè)定,將得到的序列與目的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析,從而得到目的基因的拷貝數(shù);2、基因芯片技術(shù):就是通過(guò)微陣列技術(shù),將數(shù)以萬(wàn)計(jì)、乃至百萬(wàn)計(jì)的特定序列的基因探針有規(guī)律地排列固定于2cm2的硅片、玻片等支持物上,構(gòu)成一個(gè)二維DNA探針陣列,當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列與基因芯片上對(duì)應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補(bǔ)匹配時(shí),通過(guò)確定熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的探針位置,獲得一組序列完全互補(bǔ)的探針序列,據(jù)此可重組出目標(biāo)基因的拷貝數(shù);3、DNA復(fù)性動(dòng)力學(xué)法:是指DNA經(jīng)熱變性,再恢復(fù)(重新復(fù)性)過(guò)程的動(dòng)力學(xué)分析,按DNA復(fù)性速度的快慢,將真核生物的DNA分為單一順序、中度重復(fù)順序和高度重復(fù)順序三類(lèi)不同的基因組織,從而得到目的基因的拷貝數(shù);4、生物雜交法:將轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物個(gè)體和非轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物個(gè)體相互雜交,根據(jù)子代中轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物個(gè)體的數(shù)量和孟德?tīng)柖桑扑愠瞿繕?biāo)基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物個(gè)體中的拷貝數(shù);5、Southern印跡法:將轉(zhuǎn)基因個(gè)體的DNA用限制性?xún)?nèi)切酶水解,然后用瓊脂糖凝膠電泳將DNA按片段大小分開(kāi),再將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維或尼龍膜上 ,將目標(biāo)基因用放射性同位素或其他方法標(biāo)記,然后和印到膜上的DNA雜交,根據(jù)放射性條帶的數(shù)值,推斷出目標(biāo)基因的拷貝數(shù);6、熒光定量法:實(shí)時(shí)PCR又稱(chēng)TapMan PCR,它用一對(duì)基因的PCR引物和探針以及DNA聚合酶,通過(guò)反復(fù)的熱冷循環(huán),使目標(biāo)基因以指數(shù)形式擴(kuò)增,由于PCR產(chǎn)物可以用熒光信號(hào)來(lái)定量,而且熒光閾值循環(huán)數(shù)(Ct)與被擴(kuò)增基因的起始濃度對(duì)數(shù)是直線(xiàn)負(fù)相關(guān)的,因此可以用目標(biāo)基因和已知內(nèi)參基因來(lái)確定目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。
現(xiàn)有技術(shù)的主要缺陷在于:1、用時(shí)長(zhǎng)、耗費(fèi)大,上述測(cè)序法和芯片法費(fèi)用高、花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng),特別是芯片的設(shè)計(jì)和定制需要較高的費(fèi)用和時(shí)間;同時(shí),數(shù)據(jù)的處理繁瑣,生物雜交法需要一個(gè)完整的生長(zhǎng)周期才能產(chǎn)生子一代,并需要檢測(cè)大量的子一代才可以獲得有統(tǒng)計(jì)意義的數(shù)據(jù);2、需特殊設(shè)備和裝置,如上述Southern印跡法需要放射性同位素操作和暗室等基礎(chǔ)設(shè)施和條件,還需要大量的資金處理放射性廢棄物,非放射性方法很難達(dá)到檢測(cè)單一基因的靈敏度,且價(jià)格昂貴;3.測(cè)定數(shù)據(jù)不夠精確,對(duì)DNA復(fù)性動(dòng)力學(xué)法,因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)操作中影響DNA動(dòng)力學(xué)的因素很多,比如溫度、電解質(zhì)環(huán)境等,對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確度有一定影響;4、基于不充分假設(shè),上述實(shí)時(shí)PCR法基于一個(gè)不充分的假設(shè),即目標(biāo)基因和內(nèi)參基因具有同樣的擴(kuò)增系數(shù),但這個(gè)假設(shè)一般難以成立,不同序列和長(zhǎng)度的基因,其PCR擴(kuò)增系數(shù)有差異,由于PCR是以指數(shù)方式擴(kuò)增基因的,微小的PCR擴(kuò)增系數(shù)差異會(huì)在多個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后被成倍放大,造成PCR擴(kuò)增的巨大差異,直接影響基因拷貝數(shù)的計(jì)算,現(xiàn)有通過(guò)實(shí)時(shí)PCR快速測(cè)定基因拷貝數(shù)的方法是基于TapMan熒光探針實(shí)現(xiàn),這種定量的方法需要花費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間來(lái)完成對(duì)探針的設(shè)計(jì)和定制,同時(shí)對(duì)于某些基因難以設(shè)計(jì)出理想的TapMan熒光探針,相對(duì)于普通熒光定量PCR費(fèi)用較高,同時(shí)現(xiàn)有的實(shí)時(shí)定量測(cè)定基因拷貝數(shù)的方法需要將目的基因和單拷貝內(nèi)參基因進(jìn)行不同比例的混合稀釋?zhuān)鴮?duì)于小體積液體的反復(fù)混合和稀釋處理,必將大大增加實(shí)驗(yàn)誤差
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明的目的在研制一種解決上述問(wèn)題,提供花費(fèi)時(shí)間短,耗費(fèi)成本低,易操作的一種利用PCR技術(shù)和RT-PCR技術(shù)對(duì)基 因組多拷貝基因拷貝數(shù)的快速批量測(cè)定方法。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):本發(fā)明利用實(shí)時(shí)PCR對(duì)基因組多拷貝基因拷貝數(shù)的測(cè)定方法主要是通過(guò)TapMan探針定量的方法對(duì)目的基因和單拷貝的內(nèi)參基因進(jìn)行不同比例混合后定量測(cè)定,這種利用TapMan探針定量的方法費(fèi)用較高,操作繁瑣,對(duì)引物和探針的設(shè)計(jì)要求較高,同時(shí)對(duì)目的基因和單拷貝內(nèi)參基因的反復(fù)混合和混合后稀釋處理將加大實(shí)驗(yàn)誤差,降低測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度,本方法通過(guò)PCR技術(shù)結(jié)合普通熒光定量,分別對(duì)目的基因(多拷貝基因)和內(nèi)參基因(已知單拷貝基因)進(jìn)行梯度稀釋后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),不需將目的基因和內(nèi)參基因進(jìn)行混合處理,同時(shí)可以在96孔熒光定量PCR反應(yīng)中應(yīng)用溫度梯度程序設(shè)計(jì)各自引物的退火溫度,實(shí)現(xiàn)一次定量測(cè)定7個(gè)多拷貝基因的快速批量測(cè)定:第一步,抽提待測(cè)生物個(gè)體DNA樣品,對(duì)需測(cè)定的多拷貝基因(XpX2、X3……Xn)和作為內(nèi)參已知單拷貝基因⑴進(jìn)行PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì);第二步,以個(gè)體DNA樣品為模板對(duì)各基因(XpX2、X3……Xn、Y)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并對(duì)PCR產(chǎn)物純化;第三步,測(cè)定各基因的PCR純化產(chǎn)物的質(zhì)量濃度,并根據(jù)其核酸序列,將質(zhì)
量濃度換算成摩爾濃度,分別為Mp M2、M3......Mn、My ;第四步,分別對(duì)各基因的PCR純化產(chǎn)
物進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)坏谖宀?,分別以梯度稀釋后各基因的PCR純化產(chǎn)物和組織DNA樣本作為模板,通過(guò)同一 RT-PCR反應(yīng)制作這些基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),同時(shí)獲得在組織DNA樣品中各基因的含量(Ct值);第六步,通過(guò)各個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和組織DNA樣品中各基因的表達(dá)量,計(jì)算出各基因的摩爾濃度……mn、mY,;第七步,根據(jù)在同一組織DNA樣品中多拷貝基因的數(shù)量是單拷貝基因的拷貝數(shù)的倍數(shù)關(guān)系,通過(guò)一套方程組聯(lián)解得到所測(cè)基因在基因組中的拷貝數(shù),達(dá)到發(fā)明目的。
:下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。圖1為本發(fā)明PCR對(duì)基因組多拷貝基因拷貝數(shù)的快速批量測(cè)定方法流程解示意圖。圖2為本發(fā)明PT-PCR排版設(shè)計(jì)利用熒光定量?jī)x的溫度梯度程序示意圖。圖3為本發(fā)明Xn基因多拷貝基因摩爾濃度-Ct值標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)示意圖。圖4為本發(fā)明Y基因單拷貝基因的摩爾濃度-Ct值標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)示意圖。
具體實(shí)施方式
:如圖1-4所示,本發(fā)明具體的實(shí)施方法如下:圖1-4所示的本發(fā)明的組織DNA樣品可通過(guò)任何試劑盒提取得到,對(duì)得到的同一組織DNA樣本分別對(duì)某些多拷貝基因(待測(cè)定基因)和已知的某單拷貝基因(內(nèi)參基因)進(jìn)行簡(jiǎn)單PCR擴(kuò)增并純化;測(cè)定各自的質(zhì)量濃度,并根據(jù)其核酸序列,將質(zhì)量濃度換算成摩爾濃度;再分別以梯度稀釋后的PCR產(chǎn)物以及組織DNA樣本作為模板通過(guò)同一 RT-PCR反應(yīng)(引物與普通PCR引物一樣)制作這些基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),并同時(shí)獲得各基因在DNA樣品中的摩爾濃度;根據(jù)在同一抽提效率下,多拷貝基因的拷貝數(shù)就是在相同體積下多拷貝基因的數(shù)量除以單拷貝基因數(shù)量的數(shù)學(xué)關(guān)系建立方程式求解得到多拷貝基因的拷貝數(shù)。Xn表示需要確定在基因組中拷貝數(shù)的某個(gè)多拷貝基因,Y表示某個(gè)已經(jīng)確認(rèn)的單拷貝基因(如人a 1-抗胰蛋白酶基因、胰高血糖素受體基因)。Mn、My分別表示通過(guò)PCR并純化后的Xn、Y基因的摩爾濃度,是通過(guò)高精度的核酸蛋白儀測(cè)定的質(zhì)量濃度結(jié)合該 基因的核苷酸序列計(jì)算得到的摩爾質(zhì)量換算得到的。Ct(Xn)^Ct(Y)是以同一組織DNA樣品為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)所得到的Ct值。mn、mY是根據(jù)Ct(Xn)、Ct(Y)值結(jié)合X、Y基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(橫坐標(biāo)由質(zhì)量濃度對(duì)換稀釋倍數(shù))所得到的Xn基因和Y基因的摩爾濃度(mn、mY的值可通過(guò)作圖直接讀取,他們分別為Mn、MY的倍數(shù))。N為Xn基因在基因組中的拷貝數(shù)。以96孔板的一次RT-PCR反應(yīng)對(duì)7個(gè)基因拷貝數(shù)進(jìn)行測(cè)定為例,具體操作為:第一步,將抽提的組織DNA分別對(duì)待測(cè)定的多拷貝基因基因和已知單拷貝基因Y (如胰高血糖素受體基因GCG)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(模板量可以不一樣)并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化(保證產(chǎn)物中只有Xp X2、X3> X4、X5、X6、X7和Y基因),再對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量濃度的測(cè)定,由核酸蛋白儀等儀器直接讀??;第二步,結(jié)合各個(gè)基因序列計(jì)算出各自的摩爾質(zhì)量,最后將每個(gè)基因的PCR純化產(chǎn)物的質(zhì)量濃度換算成摩爾濃度(由質(zhì)量濃度除以摩爾質(zhì)量),其分別
;第三步,分別對(duì)測(cè)定濃度后的X1'X2、X3、X4、X5、X6、X7、Y基因進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)源俗鳛闊晒舛康哪0?模板量2 iU),分別制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn);第四步,同時(shí)在對(duì)每個(gè)基因通過(guò)RT-PCR(引物與步驟(I)PCR引物一樣)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的同一批次反應(yīng)中,加入以所抽提的生物體組織DNA為模板(模板量2 u I)的定量反應(yīng),以確保以組織DNA為模板和以純化后的PCR產(chǎn)物為模板的基因的擴(kuò)增效率一致,最終得到組織DNA中該基因的濃度 Ct (X1)、Ct (X2)、Ct (X3)、Ct (X4)、Ct (X5)、Ct (X6)、Ct (X7)、Ct (Y)值;第五步,通過(guò)各個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),將所測(cè)得該基因的摩爾濃度取代橫坐標(biāo)的稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)值,由計(jì)算得到Ct值對(duì)摩爾濃度對(duì)數(shù)值的一次函數(shù)Ct = -alog2M+b (其中a是標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率;b是標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)截距,都是根據(jù)已知摩爾濃度下各基因的已知Ct值計(jì)算得到),結(jié)合生物體組織DNA樣品中該基因的Ct值獲得該DNA樣品中此基因的摩爾濃度,分別為m2、m3、m4、m5、m6、m7、mY ;第六步,根據(jù)在同一次組織DNA抽提中各基因的抽提效率一致,可確定抽提后的DNA中,在相同體積下某一多拷貝基因和單拷貝基因的摩爾數(shù)是一個(gè)固定整數(shù),也就是該多拷貝基因的拷貝數(shù);第七步,根據(jù)此關(guān)系可建立方程組求解達(dá)到發(fā)明目的。
權(quán)利要求
1.一種基因組多拷貝基因拷貝數(shù)的快速批量測(cè)定方法,利用PCR技術(shù)對(duì)基因組多拷貝基因的拷貝數(shù)的快速批量測(cè)定方法,第一步,抽提待測(cè)生物個(gè)體DNA樣品,對(duì)需測(cè)定的多拷貝基因(XpX2、X3……Xn)和作為內(nèi)參已知單拷貝基因⑴進(jìn)行PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì);第二步,以個(gè)體DNA樣品為模板對(duì)各基因(Xp X2、X3……Xn、Y)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并對(duì)PCR產(chǎn)物純化;第三步,測(cè)定各基因的PCR純化產(chǎn)物的質(zhì)量濃度,并根據(jù)其核酸序列,將質(zhì)量濃度換算成摩爾濃度,分別為A、M2' M3......Mn、My ;第四步,分別對(duì)各基因的PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)坏谖宀剑謩e以梯度稀釋后各基因的PCR純化產(chǎn)物和組織DNA樣本作為模板,通過(guò)同一RT-PCR反應(yīng)制作這些基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),同時(shí)獲得在組織DNA樣品中各基因的含量(Ct值);第六步,通過(guò)各個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和組織DNA樣品中各基因的表達(dá)量,計(jì)算出各基因的摩爾濃度……mn、mY,;第七步,根據(jù)在同一組織DNA樣品中多拷貝基因的數(shù)量是單拷貝基因的拷貝數(shù)的倍數(shù)關(guān)系,通過(guò)一套方程組聯(lián)解得到所測(cè)基因在基因組中的拷貝數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因組多拷貝基因拷貝數(shù)的快速批量測(cè)定方法,其特征在于:所使用的多拷貝基因和單拷貝基因的引物皆為普通PCR引物,不需要昂貴的且難設(shè)計(jì)的TaqMan PCR熒光探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因組多拷貝基因拷貝數(shù)的快速批量測(cè)定方法,其特征在于:所述的摩爾濃度是對(duì)多拷貝基因和單拷貝基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化處理后測(cè)定。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因組多拷貝基因拷貝數(shù)的快速批量測(cè)定方法,其特征在于:所述的同一 RT-PCR反應(yīng)是在同一次熒光定量反應(yīng)中分別加入以梯度稀釋后,以確保以組織DNA為模板和以純化后的PCR產(chǎn)物為模板的基因的擴(kuò)增效率一致。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因組多拷貝基因拷貝數(shù)的快速批量測(cè)定方法,其特征在于:所述的組織DNA樣品中各基因的摩爾濃度是通過(guò)該基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和樣品中該基因的Ct 值。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基因組多拷貝基因拷貝數(shù)的快速批量測(cè)定方法,一種利用PCR技術(shù)對(duì)基因組多拷貝基因拷貝數(shù)的快速批量測(cè)定方法,本方法通過(guò)對(duì)同一組織DNA樣本分別實(shí)施某些多拷貝基因和某已知單拷貝基因的PCR擴(kuò)增并純化產(chǎn)物,測(cè)定各基因PCR純化產(chǎn)物的質(zhì)量濃度后根據(jù)其核酸序列,將質(zhì)量濃度換算成摩爾濃度,再分別以梯度稀釋后的PCR產(chǎn)物以及組織DNA樣本為模板通過(guò)同一RT-PCR反應(yīng)制作這些基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)同時(shí)獲得各基因在DNA樣品中的濃度,由于在同一抽提效率下,多拷貝基因的拷貝數(shù)就是在相同體積下多拷貝基因的數(shù)量除以單拷貝基因的數(shù)量,由此可以利用一次96孔R(shí)T-PCR反應(yīng)測(cè)定同一生物個(gè)體中7個(gè)不同多拷貝基因的拷貝數(shù);也可以利用一次384孔R(shí)T-PCR反應(yīng)測(cè)定11個(gè)不同多拷貝基因的拷貝數(shù),實(shí)現(xiàn)快速批量的測(cè)定效率。
文檔編號(hào)G01N21/64GK103103280SQ20131004129
公開(kāi)日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月1日
發(fā)明者沈林園, 朱礪, 李雪梅, 沈靜, 張順華, 李學(xué)偉, 李學(xué)杰, 高菲, 蔣小兵, 鄭夢(mèng)月 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)