用于檢測流體樣品中淀粉狀蛋白β寡聚體的方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及能夠可靠地并且靈敏地檢測患者的生物樣品中的Aβ寡聚體的選擇性Aβ寡聚體免疫測定。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的測定使用一對抗Aβ寡聚體的抗體，19.3和82E1，來檢測和定量在腦脊液（CSF）樣品中的Aβ寡聚體。本發(fā)明測定可以用于區(qū)分阿爾茨海默氏病(AD)患者與非-AD患者和/或根據(jù)其疾病的嚴(yán)重程度對AD患者分層。本發(fā)明測定還可以用作目標(biāo)接觸測定，其可以測量結(jié)合的Aβ寡聚體，作為替代終點(diǎn)用于評估療效和/或目標(biāo)接觸。
【專利說明】用于檢測流體樣品中淀粉狀蛋白β寡聚體的方法及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于檢測生物樣品中與阿爾茨海默氏病(AD)相關(guān)的淀粉狀蛋白β(Αβ )寡聚體的方法。本發(fā)明還提供用于診斷和評價用于AD的治療的方法。
技術(shù)背景
[0002]阿爾茨海默氏病(AD)是破壞性的神經(jīng)變性疾病，其特征為在涉及學(xué)習(xí)和記憶的大腦區(qū)域的淀粉狀蛋白β (Αβ)斑塊積累。雖然一度認(rèn)為這些大的不溶性斑塊導(dǎo)致ADJM現(xiàn)在證據(jù)證明小的可擴(kuò)散的Αβ的寡聚體可以是負(fù)責(zé)的。淀粉狀蛋白衍生的可擴(kuò)散的配體(ADDLs)是Αβ寡聚體的種類，其可以在體外生成，具有與內(nèi)源性Αβ寡聚體類似的性質(zhì)(美國專利號6，218，506; Klein,等，2004，Neurobiol.Aging 25:569-580; Lambert,等，1998; Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A..95:6448-6453)。A β 寡聚體存在于 AD 患者的腦中，它們結(jié)合神經(jīng)元，并且它們誘導(dǎo)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)和記憶中的缺陷。用結(jié)合Αβ寡聚體的抗體的研究已經(jīng)證明在神經(jīng)元形態(tài)學(xué)和記憶中的改善。
[0003]雖然測量Αβ單體的測定是已知的，其利用β_和Y-分泌酶對淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)的活性，但是很少的測定已報道在正常對照和AD中特異性和可靠地檢測人流體樣品如腦脊液(CSF)中的 Αβ 寡聚體(Georganopoulou,等，2005，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A., 102:2273-2276; Fukumoto,等，2010，F(xiàn)ASEB T., 24:2716-2726; Gao,等，2010，PLoS One, 2010 Dec.30; 5 (12): el5725)。報道的 A β 寡聚體測定已采用了許多方法，包括偶聯(lián)生物條形碼PCR擴(kuò)增平臺的ADDL特異性抗體(Georganopoulou,等，2005)、重疊表位ELISA(Gandy,等，2010.，Ann.Neurol., 68:220-230.; Xia,等，2009，Arch.Neurol., 66:190-199),也第一次與尺寸排阻層析配對(Fukomoto等，2010),以及淀粉狀蛋白親和基質(zhì)方法(Gao,等，2010; Tanghe,等，2010，Int.J.Alz.Dis.，Sep.2，pi1: 417314)，隨后是低聚物的解離和用Αβ單體的抗體的測量。
[0004]從CSF或腦檢測Αβ寡聚體也使用:凝膠電泳，隨后是Western印跡(Klyubin等，2008，T.Neurosc1., 28:4231-4237; Hillen, 等，2010，T.Neurosc1.,30:10369-10379)，或之前是尺寸排阻層析(Shankar,等，2011，Methods Mol.Biol.,670:33-44)，取決于電泳方法后維持的寡聚體的分子量。但是，電泳和印跡技術(shù)不提供在正常對照CSF中看到這些種類所需的靈敏度(Klyubin,等，2008)。并且，Georganopoulou的發(fā)現(xiàn)證明A β寡聚體濃度的1000倍范圍，并且將該濃度表示為fM。Αβ寡聚體種類代表了大范圍的分子量，并且，因此，精確的體積摩爾濃度分配是有問題的。Georganopoulou測定是半定量的，并且展示了三個數(shù)量級的分析目標(biāo)濃度范圍，具有在IOOaM的更低的檢測限。報道最多的方法(Georganopoulou,等 2005; Gao,等，2010; Fukumoto,等，2010;Gandy,等，2010)沒有評估來自A β寡聚體相比A β單體的信號之間的選擇性，所以所提到的濃度需要謹(jǐn)慎看待。Xia測定(Xia，等，2009，Arch.Neurol., 66:190-199)，是Immunobiological Laboratories, Inc.(Minneapolis, MN)市售的測定，宣稱對于他們的A β 1-16 二聚體相比A β 40單體具有320倍的選擇性，但是缺少避免與CSF中的A β單體交叉反應(yīng)性所需的選擇性。由于假設(shè)在CSF中的Αβ寡聚體以fM水平存在，并且CSF Αβ單體在1.5-2ηΜ之間存在，所以選擇性測量CSF樣品中A β寡聚體的測定對于A β寡聚體相對單體必須具有出色的選擇性。
[0005]除了測量人CSFftAP寡聚體水平作為潛在的疾病生物標(biāo)記物之外，Αβ寡聚體還已被用作治療性單克隆抗體的目標(biāo)以治療AD (參見，例如，美國專利號7，811，563，7，780，963和7，731，962)。據(jù)認(rèn)為，這些抗體進(jìn)入CNS并將毒性的ADDL種類從腦清除，通過I)通過Fe介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活的催化反轉(zhuǎn),2)進(jìn)入腦血管的抗體/ADDL復(fù)合物的清除，或3)在抗體結(jié)合并改善降解酶的接觸后ADDLs的酶消化，所述降解酶例如腦啡肽酶、胰島素降解酶、纖溶酶、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶(ECE-1和_2)、基質(zhì)金屬蛋白酶(ΜΜΡ-2、-3和-9)和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)。因此，選擇性的Αβ寡聚物測定的目的是在使用抗寡聚體抗體治療或改變A β單體/寡聚體形成或清除的其它治療之后，測量中樞神經(jīng)系統(tǒng)A β寡聚體的藥效動力學(xué)(PD)變化。此外，能特異性檢測結(jié)合抗A β寡聚體抗體的A β寡聚體的測定，即目標(biāo)接觸(TE)測定，對于治療后治療性抗體的評估將是非常寶貴的。
[0006]本發(fā)明提供這樣的測定，其能夠可靠地并且靈敏地檢測人流體樣品中的Αβ寡聚體。
[0007]發(fā)明概述
本發(fā)明涉及能夠可靠地并且靈敏地檢測患者的生物樣品，即患者的流體樣品中的Αβ寡聚體的選擇性Αβ寡聚體測定。本發(fā)明的測定使用一對具有高度選擇性的抗Αβ寡聚體的抗體，19.3和82Ε1，來檢測和定量在腦脊液(CSF)樣品中的Αβ寡聚體。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明是選擇性的Αβ寡聚物的藥效動力學(xué)(PD)測定，其可以將阿爾茨海默氏病(AD)患者和非AD患者區(qū)分開來和/或根據(jù)其疾病的嚴(yán)重程度分層AD患者。在又另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明是選擇性的Αβ寡聚體目標(biāo)接觸(TE)測定，其可以測量結(jié)合的Αβ寡聚體，作為替代終點(diǎn)用于治療效果的評估。
[0008]附圖簡述
圖1A-1C是圖解表示，顯示抗ADDL抗體19.3結(jié)合A β寡聚體的ADDL種類(每組的中間的條)相比Αβ單體或Αβ纖維的選擇性。圖1A顯示一組人源化的(h3B3)和親和力成熟的抗ADDL (14.2,7.2,11.4,9.2,13.1,17.1和19.3)抗體和三個比較性抗體(比較1、2和3)對單體A β ,ADDLs和纖維A β的ELISA結(jié)合。比較性抗體2已知是對于ADDLs的非選擇性的抗體。本測定的背景通過從ELISA去除捕獲抗體來確定(無mAb)。誤差條表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖1B顯示在板用Αβ寡聚體(▲)或Αβ單體( )包被的單面ELISA中，人源化抗體19.3的相對親和力和最大結(jié)合特征。圖1C顯示競爭性ELISA和19.3對包被在ELISA板上的Αβ寡聚體(▲)和Αβ單體( )在溶液中存在競爭性種類的情況下的相對親和力。
[0009]圖2A-2C是圖解表示,其顯示在使用化學(xué)發(fā)光(EnVision? Multilable Reader,Perkin Elmer, Waltham, MA)作為檢測方法的夾心ELISA形式中三對抗體的靈敏度和它們對Αβ寡聚體的相對親和力。圖2Α顯示，描繪經(jīng)Αβ寡聚體濃度范圍的抗Aβ寡聚體抗體19.3作為捕獲抗體和82Ε1作為檢測抗體。圖2Β和2C描繪6Ε10和19.3分別均作為捕獲和檢測抗體。19.3 X 82Ε1夾心ELISA對(圖2Α)在檢測Αβ寡聚體方面相比其它對(圖2B和2C)顯著更靈敏。
[0010]圖3是使用抗-A β寡聚體抗體19.3和82Ε1對于Αβ寡聚體()相比Αβ單體(▲)的檢測的靈敏度和選擇性的圖解表示，如使用順磁性微粒探測器,例如Erenna?數(shù)字檢測器(Singulex?，Almeda, CA)所測量的。使用順磁性微粒探測器顯著提高了用19.3/82E1抗體對檢測Αβ寡聚體的靈敏度。
[0011]圖4Α和4Β是在人腦脊液(CSF)樣品中檢測的Αβ寡聚體的水平的圖解表示。圖4Α顯示在本文使用本發(fā)明的方法的設(shè)盲的評價中A β寡聚體水平在AD患者中比年齡匹配的對照，即非AD患者中高4倍。如采用雙向t檢驗(yàn)和Mann Whitney秩分析確定,差異是統(tǒng)計學(xué)顯著的，達(dá)Pi0.0004，假設(shè)人群是非高斯分布的。圖4B顯示在本文使用本發(fā)明的方法的設(shè)盲的評價中A β寡聚體水平在AD患者中比年輕的對照，即非AD患者高8倍。使用如圖4Α中相同的統(tǒng)計學(xué)方法，這些組之間的差異也是統(tǒng)計學(xué)顯著的，為P-值i 0.0021。
[0012]圖5A和5B是在臨床證實(shí)的AD或年輕對照(B卩非AD)患者的CSF中A β單體水平的圖解表示，在AD樣品中具有Αβ 42單體的水平的相應(yīng)的下降和不變的A β 40單體的水平。這表示對于AD患者觀察到的一般模式并證實(shí)在圖4Β中評價的樣品的疾病狀態(tài)。圖5Α顯示在AD CSF樣品中降低的Αβ 42單體水平。如采用雙向t檢驗(yàn)和Mann Whitney秩分析確定，差異是統(tǒng)計學(xué)顯著的，達(dá)Pi0.002，假設(shè)人群是非高斯分布的。圖5B顯示兩組之間不變的A β 40單體水平。
[0013]圖6是簡易精神狀態(tài)檢查(MMSE)評分(作為認(rèn)知表現(xiàn)的量度)和使用本文中本發(fā)明測定測量的Αβ寡聚體水平之間相關(guān)性的圖解表示。圖4Β中描繪的所有患者包括在此相關(guān)性中。在-0.7445pg/mL Αβ寡聚體的相關(guān)性是顯著的，為ρ < 0.0001。
[0014]圖7Α和7Β是目標(biāo)接觸測定的圖解表示。圖7Α是摻入人CSF(.)或酪蛋白緩沖液(▲)的先體外后體內(nèi)形成的抗_Αβ寡聚體抗體19.3/Αβ寡聚體復(fù)合物的表示。圖7Β是摻入人CSF(.)或酪蛋白緩沖液(▲)的先體外后體內(nèi)形成的抗_Αβ寡聚體抗體19.3/Αβ寡聚體復(fù)合物的表示。在抗人K鏈(捕獲)χ82Ε1 (檢測)目標(biāo)接觸ELISA (實(shí)施例9)中19.3/Αβ寡聚體的檢測中觀察到差異靈敏度(Differential sensitivity)。抗κ捕獲抗體很差地區(qū)分抗-A β寡聚體抗體19.3與人CSF中的內(nèi)源抗體種類。
[0015]圖8是使用采用小腦延髓池開口的恒河猴模型靜脈內(nèi)推注施用20 mg/kg劑量后，在靈長類動物(三只雄性恒河猴)腦脊液(CSF)中評估的抗-ADDL抗體19.3的PK的圖解表示。在給藥后約24小時，抗體19.3以100 ng/mL存在于CSF中。
[0016]圖9A和9B分別是Αβ寡聚體夾心ELISA，即藥效動力學(xué)(PD)測定，和Αβ寡聚體/抗體夾心ELISA，即目標(biāo)接觸測定的圖解表示。
[0017]發(fā)明詳述
申請人:在本文中提供能夠可靠地和靈敏地檢測在患者CSF中Αβ寡聚體的方法，用于作為Αβ寡聚體的藥效動力學(xué)和目標(biāo)接觸測量使用。本發(fā)明的方法可以將AD患者與非AD患者區(qū)分開并基于AD患者中CNS Αβ寡聚體升高的水平分層AD疾病狀態(tài)，類似于先前報道的對于 tau/AP42 CSF 比 例的用途(De Meyer,等，2010，Arch.Neurol..67:949-56)。此外，相比于對于Αβ單體的水平觀察到的較差相關(guān)性，檢測大部分神經(jīng)毒性種類的Aβ寡聚體測定可以與認(rèn)知表現(xiàn)中的變化更好地關(guān)聯(lián)，并且是認(rèn)知表現(xiàn)中變化的更動態(tài)的量度。 申請人:在本文第一次證明外周施用的抗Aβ寡聚體抗體可以穿透血-腦屏障并結(jié)合Αβ寡聚體，并且，當(dāng)在本文中本發(fā)明的方法中使用時，可以提供用于AD療法的評估的替代終點(diǎn)測定。
[0018] 申請人:在本文中已經(jīng)開發(fā)了高靈敏度的測定法及其用途，所述測定法在生物樣品中，即，流體樣品中檢測和測量神經(jīng)元衍生蛋白的水平。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，神經(jīng)元衍生蛋白是Αβ寡聚體，并且流體樣品是腦脊液(CSF)樣品。本發(fā)明方法利用順磁微粒檢測在夾心ELISA中使用兩種選擇性的抗-Aβ寡聚體抗體。雖然Αβ寡聚體已在生物樣品中，特別是在CSF中發(fā)現(xiàn)(Georganopoulou,等，2005 ;Klyubin等，2008),但是與已知檢測方法相關(guān)的限制(包括靈敏度和選擇性)尚不能實(shí)現(xiàn)可靠地檢測，更不用說，對Αβ寡聚體定量，以用于對患者的疾病狀態(tài)進(jìn)行分類或用于AD療法的開發(fā)。使用兩種抗-A β寡聚體抗體19.3和82Ε1，連同順磁微粒檢測，本文 申請人:能夠開發(fā)夾心ELISA測定，以在生物樣品中檢測Αβ寡聚體，到40 fg/mL的檢測限。采用此測定，本文 申請人:證明在臨床證實(shí)的AD樣品中，相比年輕的或年齡匹配的對照的Αβ寡聚體高度顯著性升高。這些相同的樣品，用于測量A β 42和A β 40單體的水平，證實(shí)了在AD樣品中與對照相比，A β 42單體被顯著減少，而Aβ 40單體水平保持不變。本發(fā)明的Aβ寡聚體夾心ELISA測定表明Aβ寡聚體濃度和在廣泛用于測量AD的嚴(yán)重程度的認(rèn)知測試，稱為簡易精神狀態(tài)檢查(MMSE)中性能之間的顯著的相關(guān)性；認(rèn)知得分越高(最多為30的值，其是認(rèn)知正常的)，CSF中的Αβ寡聚體水平越低。本發(fā)明的Αβ寡聚體夾心ELISA測定可以與額外的患者樣本用于產(chǎn)生與已知的流體、成像和認(rèn)知的生物標(biāo)志物的進(jìn)一步的相關(guān)性。
[0019]除了上文的藥效動力學(xué)測定之外， 申請人:已經(jīng)開發(fā)了對人IgG2/抗-Αβ寡聚體復(fù)合物具有選擇性，使得它可以用于人CSF樣品的目標(biāo)接觸(TE)。如在后面的實(shí)施例所述，本文所述的TE測定克服了將非天然人IgG2抗體(抗A β寡聚體，IgG2抗體)與存在于人CSF中的過多內(nèi)源性IgG抗體選擇性地區(qū)分的挑戰(zhàn)。TE測定的選擇性通過使用高度選擇性的抗 IgG2 同種型捕獲(Southern Biotech, Birmingham, AL, #9060-05)抗體而實(shí)現(xiàn)，所述捕獲抗體能夠從存在于人類CSF中內(nèi)源的IgG2種類中捕獲Αβ寡聚體IgG2抗體/Αβ寡聚體復(fù)合物。結(jié)合到19.3/IgG2同種型抗體的Αβ寡聚體的檢測使用商業(yè)抗體，82Ε1(Immunobiological Laboratories, Inc., Minneapolis, MN)完成。這種方法能夠可靠和一致地檢測19.3-1gG2抗體/Αβ寡聚體復(fù)合物，無論是在緩沖液中，在用Αβ寡聚體抗體處理的動物的轉(zhuǎn)基因Tg2576腦提取物中，還是摻入外源抗體和Αβ寡聚體的人CSF樣品中。
[0020]為了能夠獲得具有獨(dú)特的靈敏度的測定，來檢測治療性抗Αβ寡聚體IgG2抗體結(jié)合Αβ寡聚體的復(fù)合物，如下文藥效動力學(xué)(PD)測定中所述，抗人IgG2抗體結(jié)合到磁性微粒(MP)上。MP/抗人IgG2復(fù)合物與從個體取得的CSF樣品混合，所述個體用IgG2同種型(治療性IgG2抗體)的治療性抗Αβ寡聚體抗體給藥。治療性抗A β寡聚體抗體將結(jié)合個體的CSF樣品中存在的任何Αβ寡聚體種類。此MP/抗-1gG2/抗-Αβ寡聚體/Αβ寡聚體復(fù)合物與第二抗-Αβ寡聚體抗體82Ε1混合,所述82Ε1上連接突光染料(fluor)。所述MP/抗-1gG2/抗-A β寡聚體/A β寡聚體/82El-f Iuor復(fù)合物憑借微粒的磁性性質(zhì)充分清洗，并且82El-fluor復(fù)合物從微珠分離以減少背景。82El-fluor的單分子代表在給藥的個體的CSF中存在的抗-A β寡聚體/Αβ寡聚體復(fù)合物的初始水平。此測定將能夠證實(shí)，治療性IgG2抗體接觸Αβ寡聚體目標(biāo)(圖9Β)。隨著治療過程中Αβ寡聚體的清除，所述治療性IgG2抗體將接觸更少的Αβ寡聚體并從而展示減少的信號。因此，目標(biāo)接觸測定將能夠測量對所評價的治療性抗體的有效性。藥效動力學(xué)測定(圖9Α)也將展示減少的信號，其將歸因于減少的Αβ寡聚體的存在，例如在治療后。因此，對于用于AD治療的任何療法的有效性的評價，藥代動力學(xué)測定可以用作替代終點(diǎn)。
[0021]本文發(fā)明是靈敏的和選擇性的夾心ELISA測定，其檢測并定量來自AD和人對照個體的CSF樣品中的內(nèi)源Αβ寡聚體。本發(fā)明測定的開發(fā)從鑒定產(chǎn)生對Αβ寡聚體相對Αβ單體和纖維具有選擇性的抗體的小鼠雜交瘤開始。 申請人:開發(fā)的(共同未決的申請PCT/US2011/XXXXXX，要求USSN 61/364，210的優(yōu)先權(quán))并且本文稱為19.3的選擇性的抗_Α β寡聚體抗體，進(jìn)行人源化到IgG2同種型，并進(jìn)一步通過單面ELISA表征其對A β寡聚體的親和力，具有約1.6ηΜ的EC50。對19.3抗體在溶液中和固相中對ADDLs的親和力的進(jìn)一步的評價，當(dāng)以競爭性ELISA形式評價時，證明19.3對Αβ寡聚體相比對Aβ單體具有約600倍更高的選擇性。19.3對于Αβ寡聚體的靈敏度和選擇性表明在用于Aβ寡聚體檢測的夾心ELISA中的可用性。
[0022]在夾心ELISA形式中，組合三種不同抗體如檢測抗體19.3、7305 (美國專利號7，780, 963，其通過引用以其整體并入本文)和82Ε1，在它們生物素化之后，評價19.3抗體作為對于Αβ寡聚體的潛在的捕獲劑。在重疊表位測試中，檢驗(yàn)生物素化的19.3作為檢測抗體并與作為捕獲抗體的19.3配對。重疊表位的存在將指示具有多個表位的A β構(gòu)建體，其表明二聚體或更高階A β寡聚體的存在。19.3 X 19.3重疊表位ELISA具有對A β寡聚體的98 pg/mL的檢測限(LoD)(圖2C)。對于抗體對19.3和82E1 ( “19.3 x 82E1夾心ELISAO 的夾心 ELISA (圖 2A)，以及 19.3 x 7305 夾心 ELISA (數(shù)據(jù)未顯示)，1.3 pg/mL的(LoD),對于Αβ寡聚體的4.2 pg/mL的可靠定量限(LoRQ),并且來自Αβ寡聚體/Αβ單體的信號比例為大約1，000:1，顯示該測定對于A β寡聚體相比A β 40單體選擇性高1,000倍。 申請人:發(fā)現(xiàn)非-重疊表位測定，即19.3 X 82Ε1夾心ELISA相比最近公開的對于采用商品化Αβ抗體6Ε10的類似測定的結(jié)果更有靈敏度(圖2Β)，其導(dǎo)致對Aβ寡聚體的98 pg/mL的檢測限(Covance, Princeton, NJ) (Gandy,等，2010，Ann.Neurol., 68:220-230),并且相比采用商品化抗體82E1的重疊表位測定同等敏感(Xia,等2009，Arch.Neurol.，66:190-199) (Immunobiological Laboratories, Inc., Minneapolis, MN)。雖然使用化學(xué)發(fā)光檢測進(jìn)行的夾心ELISA(圖2A、2B和2C)足以檢測Αβ寡聚體標(biāo)準(zhǔn)品，但是先前報道的fM (fg/mL)范圍內(nèi)的CSF Αβ寡聚體水平表明選擇性的基于ELISA的Αβ寡聚體測定將需要十至一百倍更高的靈敏度，以可靠地檢測和定量CSF樣品中的Αβ寡聚體。
[0023]為了增加夾心ELISA測定的靈敏度， 申請人:評價了在順磁微粒檢測系統(tǒng)中的兩種抗體對的性能，所述順磁微粒檢測系統(tǒng)具體為Erenna?系統(tǒng)(Singulex?, Almeda, CA),利用從夾心ELISA復(fù)合物解偶聯(lián)的熒光標(biāo)簽的檢測抗體的檢測。對19.3 X 82E1夾心ELISA的性能進(jìn)行改善，使得19.3 X 82E1抗體對能夠以相比年齡匹配的或更年輕的對照樣品更高的水平檢測AD CSF樣品中Αβ寡聚體信號。更具體地，所述測定LoD改善了大約三十倍，達(dá)到0.04 pg/mL,而LoRQ改善了十倍,達(dá)到0.42 pg/mL。類似地，Αβ寡聚體/Αβ單體比例也改善了，達(dá)到5，000:1。如用此測定所測量的，AD CSF樣品降低了 Αβ 42水平并且未改變A β 40水平，這是AD患者的特征?？傊?，使用順磁微粒檢測系統(tǒng)的19.3 χ 82Ε1夾心ELISA能夠可靠并特異性地測量人CSF中的Αβ寡聚體種類。[0024]如本文所用術(shù)語“Αβ寡聚體”指Αβ單體的多聚體種類，其由于單體種類的自締合而得到。Αβ寡聚體主要是Αβ42的多聚體，盡管Αβ40的Αβ寡聚體也已有報道。在合成的Αβ單體體外聚集之后，或從人腦或體液分離/提取Aβ種類之后，Αβ寡聚體可以包括二體、三體、四體和更高階種類的動態(tài)范圍。ADDLs是Αβ寡聚體的一個種類。
[0025]如本文所用術(shù)語“神經(jīng)元源性蛋白”或“目的神經(jīng)元源性蛋白”指在腦中的神經(jīng)元中生成的蛋白和/或由腦中的神經(jīng)元生成的蛋白，其可以通過本文的本發(fā)明測定進(jìn)行測量。在本文中本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，神經(jīng)元源性蛋白是存在于人的腦脊液(CSF)樣品中的Αβ寡聚體。此蛋白與其它Αβ寡聚體的區(qū)別在于，其可以在神經(jīng)元以外的細(xì)胞或組織中由Αβ形成。
[0026]如本文所用術(shù)語“ADDLs”或“淀粉狀蛋白-β衍生的可擴(kuò)散的配體”或“淀粉狀蛋白-β衍生的癡呆性配體”指包括兩種或更多Αβ蛋白單體的神經(jīng)毒性的、可溶的、球狀、非纖維的寡聚體結(jié)構(gòu)。更高階的寡聚體結(jié)構(gòu)不僅可以從Αβ 42獲得，也可以從任何能夠穩(wěn)定形成可溶性非纖維Aβ寡聚體結(jié)構(gòu)的Aβ蛋白，例如Αβ 43或Αβ 40獲得。美國專利號6，218，506 和 WO 01/10900。
[0027]如本文所用術(shù)語“Αβ纖維”或“纖維”或“纖維狀淀粉狀蛋白”指Αβ的不溶性種類，其可以在人和轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中檢測到，這是由于它們與染料，例如硫代黃素S的雙折射性。形成由Αβ單體構(gòu)成的纖維狀結(jié)構(gòu)的Αβ種類包括β_折疊片。這些種類被認(rèn)為是在AD大腦中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外淀粉狀蛋白斑結(jié)構(gòu)的中間前體。
[0028]如本文所用術(shù)語“Αβ 40單體”或“Αβ 42單體”指在無細(xì)胞或細(xì)胞環(huán)境中β-分泌酶和Y-分泌酶的對淀粉狀蛋白前體(APP)的酶切割(即天冬氨酸蛋白酶活性)的直接產(chǎn)物。β -分泌酶對APP的切割產(chǎn)生從Aspl開始的A β種類(編號為切割后的A β肽序列)，而Y-分泌酶釋放的Aβ的C末端主要是在殘基40或42。
[0029]如本文所用術(shù)語“捕獲抗體”或“Α β寡聚體捕獲抗體”或“抗-人IgG2捕獲抗體”指在本文的測定中用作捕獲抗體的抗體。如本文所用捕獲抗體結(jié)合Aβ寡聚體或Aβ寡聚體/抗體復(fù)合物，其在流體樣品中測量和/或檢測。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述捕獲抗體是抗-Αβ寡聚體抗體19.3，并且所檢測的復(fù)合物是19.3/Αβ寡聚體。在另一個實(shí)施方案中，所述捕獲抗體是抗-人IgG2捕獲抗體并且所檢測的復(fù)合物是IgG2/19.3/Αβ寡聚體。
[0030]如本文所用術(shù)語“IgG”或“IgG2”指作為抗體分子發(fā)揮功能的任何蛋白。每個IgG由四條肽鏈組成一兩條重鏈Y和兩條輕鏈。每個IgG具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。在人中有四個IgG亞類(IgGl、2、3和4)，按照在血清中它們的豐度順序命名(IgGl是豐度最高的)。鉸鏈區(qū)的結(jié)構(gòu)賦予四類IgG的每一類其獨(dú)特的生物學(xué)概況。
[0031]如本文所用術(shù)語“ κ輕鏈”指包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和恒定區(qū)兩者的免疫球蛋白G(IgG)的部分。每個抗體分子具有兩條輕鏈，其可以是κ或λ型，分別在染色體2或22上編碼。兩條κ輕鏈將在B細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，連同兩條重鏈通過二硫鍵組裝以形成完整的IgG抗體分子，并且被分泌以作為體液免疫防御系統(tǒng)的一部分發(fā)揮功能。
[0032]如本文所用術(shù)語“生物樣品”或“流體樣品”指相比于組織或脊椎動物的任何類型的流體。可在本文的測定中使用的典型實(shí)例是血液、尿液、淚液、唾液和腦脊液，其在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中使用。如果存在Aβ寡聚體,也可以使用任何其它種類的體液。[0033]如本文所用術(shù)語“阿爾茨海默氏病”或“AD”或“淀粉樣蛋白形成性疾病”指與大腦中Αβ斑塊或神經(jīng)纖維纏結(jié)形成或沉積相關(guān)的神經(jīng)元退化導(dǎo)致的一系列癡呆或認(rèn)知損傷，所述大腦來自下列疾病范圍:包括但不限于唐氏綜合征、路易體癡呆、帕金森氏病、臨床前阿爾茨海默氏病、由于阿爾茨海默氏病的輕度認(rèn)知功能障礙、早發(fā)性阿爾茨海默氏病(E0D)、家族性阿爾茨海默氏病(FAD)、由于阿爾茨海默氏病的癡呆的直通提前認(rèn)知損傷(thru the advance cognitive impairment of dementia due to Alzheimer’s disease)(Jack,等，2011，Alzheimer's Dement., May 7(3):257-262),以及與ApoE4等位基因的存在有關(guān)的疾病。
[0034]如本文所用術(shù)語“LoD”的“檢測限”指在除了不存在Αβ寡聚體之外相同的樣品之上在可以被檢測的最低濃度的測定的靈敏度。不存在Αβ寡聚體情況下的信號被定義為“背景”。如本文所用，對于Αβ寡聚體的LoD定義為在背景的平均值之上的> 3標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0035]如本文所用“可靠定量的下限”或“LLoRQ”指組合變異系數(shù)的測定的靈敏度，以指示可以可靠地和可重復(fù)地從背景區(qū)別的最低濃度。該限值通常定義測定在靈敏度的低端的實(shí)際工作范圍，并且是，可提供跨> 3的測量值< 20%的變異系數(shù)的濃度。
[0036]選擇性的抗-Ag寡聚體捕獲抗體的鑒定和表征
為了開發(fā)對Αβ寡聚體選擇性的和特異性的測定， 申請人:首先尋求鑒定對ADDLs (Αβ寡聚體的非纖維種類)選擇性和特異性的抗體。如下生成抗ADDL的小鼠單克隆抗體，3Β3(美國專利號7811563和7780963):通過用1:1混合弗氏(第一和第二疫苗，皮下)或不完全弗氏佐劑(所有后續(xù)的疫苗接種，腹腔內(nèi))的ADDL Αβ寡聚體種類免疫小鼠。每次注射由等價于194 土 25 Pg總蛋白的純化的ADDLs組成。來自具有最高滴度的血清的小鼠的脾臟與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在聚乙二醇的存在下融合，并接種到96孔板中。細(xì)胞在37°C，5% CO2,在200 μ L次黃嘌呤-氨基蝶呤胸腺嘧啶核苷(HAT)選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天。培養(yǎng)物在第10天用補(bǔ)充有10%的胎牛血清(FBS)的Iscove氏改良的Dulbecco氏培養(yǎng)基(MDM)(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)補(bǔ)料一次,并在第14天去除培養(yǎng)物上清液以使用單面ELISA篩選陽性的包含Aβ寡聚體抗體的孔(實(shí)施例？)?；谄湎啾圈ˇ聠误w或Αβ纖維優(yōu)先結(jié)合ADDLs的能力，選擇抗體3Β3用于進(jìn)一步開發(fā)(圖1Α)。
[0037]小鼠克隆11/3Β3轉(zhuǎn)化為人IgG2抗體并命名為19.3。對編碼Αβ寡聚體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的3Β3可變重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域區(qū)進(jìn)行測序，并且產(chǎn)生的編碼這些⑶R的cDNA引入人IgG2背景。用在pFab3D噬菌體展示載體中引入的3B3的可變重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生親和力成熟文庫。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染到大腸桿菌TGl細(xì)胞中，并且產(chǎn)生的噬菌體培養(yǎng)物上清液進(jìn)行滴定，濃縮，并且制備等分試樣用于噬菌體文庫淘選。隨后使用生物素化的Aβ寡聚體進(jìn)行噬菌體文庫淘選。結(jié)合生物素化的A β寡聚體的噬菌體被洗脫并再次添加到大腸桿菌TGl細(xì)胞。使用與Αβ寡聚體相同的方法(實(shí)施例1)制備生物素化的Αβ寡聚體，但是從N-末端生物素化的A β 42肽開始(American Peptide, Sunnyvale, CA)。在上述Αβ單體、Αβ寡聚體和A β纖維差異結(jié)合ELISA中，噬菌體上清液(約100μ1)直接用于分析。
[0038]從3Β3的輕鏈親和力成熟文庫產(chǎn)生的抗-A β寡聚體抗體19.3，已被描述和表征于共同未決的申請PCT/US2011/XXXXXXX，要求2010年7月14日提交的61/364，210的優(yōu)先權(quán)，并且如本文所用的是分離的抗體，其包括:
具有下列序列的輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NO:1)
【權(quán)利要求】
1.用于從患者獲得的生物樣品中確定目的神經(jīng)元源性蛋白水平(NDPOI)的方法，其包括: (a)從哺乳動物獲得具有NDPOI的生物樣品； (b)在足以形成NDPOI/捕獲抗體/MP小珠復(fù)合物的條件下，使所述生物樣品與捕獲抗體/順磁微粒小珠(抗體/MP小珠)接觸； (c)在足以形成POI/捕獲抗體/MP小珠/檢測抗體復(fù)合物的條件下，使步驟(b)的所述NDPOI/捕獲抗體/MP小珠復(fù)合物與熒光標(biāo)記的檢測抗體接觸；和 (d)檢測從步驟(C)的所述復(fù)合物生成的熒光信號； 其中步驟(d)的所述熒光信號代表所述NDPOI的量。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述NDPOI是Αβ寡聚體。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物是人。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述捕獲抗體是選自19.3、7305、82Ε1和W02的抗_Αβ寡聚體抗體。
5.權(quán)利要求1的方法， 其中所述檢測抗體是選自82Ε1、7305和6Ε10的抗_Αβ寡聚體抗體。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述捕獲抗體是19.3并且所述檢測抗體是82Ε1。
7.權(quán)利要求的方法，其用于通過確定在從患者獲得的生物樣品中目的神經(jīng)元源性蛋白(NDPOI)的水平而鑒定具有阿爾茨海默氏癥的患者，其中所述NDPOI是Αβ寡聚體，并且其中具有范圍為0.5 pg/mL至11 pg/mL的Αβ寡聚體水平的患者確定為具有阿爾茨海默氏癥。
8.用于確定療法治療阿爾茨海默氏病的療效的方法，其包括: (a)從患者獲得具有目的神經(jīng)元源性蛋白(NDPOI)的生物樣品； (b)在足以形成NDPOI/捕獲抗體/MP小珠復(fù)合物的條件下，使所述生物樣品與捕獲抗體/順磁微粒小珠(抗體/MP小珠)接觸； (c)在形成NDPOI/捕獲抗體/MP小珠/檢測抗體復(fù)合物的條件下，使步驟(b)的所述NDPOI/捕獲抗體/MP小珠復(fù)合物與熒光標(biāo)記的檢測抗體接觸；和 (d)檢測從步驟(C)的所述復(fù)合物生成的熒光信號，并且其中所述熒光信號代表所述NDPOI的量； (e)對有需要的所述患者施用測試療法； (f)從所述患者獲得具有NDPOI的第二生物樣品； (g)用來自所述患者的第二生物樣品重復(fù)步驟(b)至(d);和 (h)比較從所述第二生物樣品檢測的熒光信號與來自第一生物樣品的所述信號； 其中所檢測的熒光信號降低代表有效的療法。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述NDPOI是Αβ寡聚體。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述捕獲抗體是19.3并且所述檢測抗體是82Ε1。
11.用于確定結(jié)合目的神經(jīng)元源性蛋白(NDPOI)的治療性抗體的目標(biāo)接觸的方法，其包括: (a)對哺乳動物施用治療性抗體； (b)從所述哺乳動物獲得具有NDPOI的生物樣品；(c)在足以形成NDPOI/捕獲抗體/MP小珠復(fù)合物的條件下，使所述生物樣品與捕獲抗體/順磁微粒小珠(抗體/MP小珠)接觸； (d)在形成NDPOI/捕獲抗體/MP小珠/檢測抗體復(fù)合物的條件下，使步驟(b)的所述NDPOI/捕獲抗體/MP小珠復(fù)合物與熒光標(biāo)記的檢測抗體接觸；和 (e)檢測從步驟(c)的所述復(fù)合物生成的熒光信號，并且其中熒光信號代表NDPOI/治療性抗體的目標(biāo)接觸。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述NDPOI是Αβ寡聚體。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述捕獲抗體是19.3并且所述檢測抗體是82Ε1。
【文檔編號】G01N33/53GK103782171SQ201280044598
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月13日
【發(fā)明者】M.薩瓦奇, P.舒魯埃, A.沃爾夫, A.麥坎貝爾 申請人:默沙東公司