純化核酸的方法、提取核酸的方法和用于純化核酸的試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明的目的在于提供了一種操作簡(jiǎn)單且短時(shí)間內(nèi)能夠高效地提取核酸的純化核酸的方法。本發(fā)明的純化核酸的方法包括用包含陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂的離子交換樹(shù)脂10來(lái)吸附含核酸的樣品中的物質(zhì)的步驟?？梢允褂玫谝魂?yáng)離子交換樹(shù)脂和排阻極限分子量小于第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂作為陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。
【專(zhuān)利說(shuō)明】純化核酸的方法、提取核酸的方法和用于純化核酸的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及純化核酸的方法、提取核酸的方法和用于純化核酸的試劑盒(kit)，并且更加具體地涉及一種通過(guò)用離子交換樹(shù)脂吸附外源物質(zhì)(foreign substance)來(lái)純化核酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]核酸擴(kuò)增反應(yīng)，例如PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))和LAMP (環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng))，應(yīng)用于各種生物【技術(shù)領(lǐng)域】。例如，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，診斷是基于DNA和RNA的堿基序列進(jìn)行的。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，DNA分析用于檢測(cè)基因重組體植物。
[0003]核酸擴(kuò)增反應(yīng)能夠有效地?cái)U(kuò)增和檢測(cè)少量樣品中的核酸。然而，如果極其少量的核酸包含于樣品中，那么核酸可能在檢測(cè)下限以下。此外，若樣品中核酸的濃度極其低，則可能無(wú)法檢測(cè)核酸，這是因?yàn)榇龜U(kuò)增的核酸沒(méi)有包含于具有能夠進(jìn)樣至反應(yīng)位點(diǎn)的容積的樣品中。在這些情形下，將事先通過(guò)純化、濃縮等方式所提取的核酸進(jìn)樣至反應(yīng)位點(diǎn)是有效的。
[0004]本文通過(guò)聚焦純化核酸，使用苯酚/氯仿/乙醇的常規(guī)方法是已知的。同樣，使用具有核酸吸附能力的多孔載體來(lái)純化核酸的方法是已知的(參見(jiàn)專(zhuān)利文件I)。
[0005]專(zhuān)利文件1:日本特開(kāi)2005-080555公報(bào)
[0006]專(zhuān)利文件2:國(guó)際公開(kāi)第2009/060847號(hào)
[0007]發(fā)明簡(jiǎn)述
[0008]本發(fā)明所解決的問(wèn)題
[0009]然而，在使用苯酚/氯仿/乙醇的常規(guī)方法中，毒性有機(jī)溶劑的使用是必然的且離心操作是額外工作。在使用具有核酸吸附能力的多孔載體來(lái)純化核酸的方法中，多個(gè)步驟是必然的且簡(jiǎn)單操作是不可行的。相應(yīng)地，強(qiáng)烈需要一種短時(shí)間內(nèi)高效率地純化核酸的簡(jiǎn)單方法。
[0010]本技術(shù)的主要目的是提供一種短時(shí)間內(nèi)有效率地純化核酸的簡(jiǎn)單方法。
[0011 ] 用于解決該問(wèn)題的方法:
[0012]為了解決上述問(wèn)題，本技術(shù)提供一種純化核酸的方法，包括用離子交換樹(shù)脂吸附包含于含核酸樣品中的物質(zhì)的步驟，該離子交換樹(shù)脂是陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)月旨。陽(yáng)離子交換樹(shù)脂允許吸附包含于待吸附的樣品中的帶正電的蛋白質(zhì)或金屬鹽的陽(yáng)離子。陰離子交換樹(shù)脂允許吸附包含在樣品中的除核酸以外的帶負(fù)電的陰離子。
[0013]優(yōu)選使用第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和具有的排阻極限分子量(exclustion limitmolecular weight)小于第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的排阻極限分子量的第二陽(yáng)離子樹(shù)脂作為所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。本文中，排阻極限分子量表示待由離子交換樹(shù)脂吸附的難于進(jìn)入離子交換樹(shù)脂的孔道(即難于吸附于離子交換樹(shù)脂的孔道內(nèi))的化合物的最小分子量。換言之，具有分子量大于排阻極限分子量的化合物難于被離子交換樹(shù)脂吸附。[0014]在陽(yáng)離子交換樹(shù)脂中，具有較大排阻極限分子量的第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂可易于選擇性吸附蛋白質(zhì)。此外，在陽(yáng)離子交換樹(shù)脂中，具有較小排阻極限分子量的第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂可易于選擇性吸附主要的陽(yáng)離子，例如金屬鹽。
[0015]優(yōu)選的是所述物質(zhì)被第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附之后，物質(zhì)再被陰離子交換樹(shù)脂和第二離子交換樹(shù)脂吸附。在這種情形下，柱子(column)包括上層的第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和下層的陰離子交換樹(shù)脂和第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。樣品可以從上層一側(cè)流入柱子。對(duì)于樣品中的物質(zhì)，通過(guò)這種方式樣品中的蛋白質(zhì)主要由第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂選擇性地吸附，而樣品中的金屬鹽主要由第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂選擇性吸附，從而提高了樣品中物質(zhì)的吸附效率。
[0016]同樣，該步驟可以由離子交換樹(shù)脂吸附包含于用緩沖溶液稀釋的樣品中的物質(zhì)。優(yōu)選地，緩沖溶液具有4.0~8.0的pH。
[0017]優(yōu)選地，該陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。優(yōu)選地，第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的反荷離子(抗衡離子，counter ion)為Na+(鈉離子)。優(yōu)選地，第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的反荷離子為H+(質(zhì)子)。
[0018]優(yōu)選地，陰離子交換樹(shù)脂為強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂。優(yōu)選地，陰離子交換樹(shù)脂的反荷離子為OF (氫氧離子)。
[0019]同樣，優(yōu)選地，陰離子交換樹(shù)脂比第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的離子交換容量的百分比為50~150%。本文中，離子交換容量表示每單位數(shù)量的離子交換樹(shù)脂的可交換基團(tuán)(exchange groups)的總數(shù)量。例如，當(dāng)?shù)诙?yáng)離子交換樹(shù)脂的反荷離子為H+時(shí),離子交換容量表示包含于Iml的第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂中的H+的總數(shù)量。當(dāng)陰離子交換樹(shù)脂比第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的離子交換容量的百分比為50~150%時(shí)，在由離子交換樹(shù)脂吸附包含于樣品中的物質(zhì)前后，可能更穩(wěn)定地抑制PH變化。
[0020]在純化核酸的方法中，更加優(yōu)選的是向樣品中加入非離子表面活性劑和/或非離子親水聚合物化合物以吸附物質(zhì)。通過(guò)加入非離子表面活性劑和/或非離子親水聚合物化合物至樣品中，可能抑制核酸物理吸附于樹(shù)脂。
[0021]上述的物質(zhì)為例如外源物質(zhì)。外源物質(zhì)包括例如蛋白質(zhì)和金屬鹽。外源物質(zhì)可以包括以下物質(zhì)，例如多種肽、糖、鹽和低分子量的陰離子(例如延胡索酸、酞酸、腐殖酸和灰黃霉酸)，除蛋白質(zhì)和金屬鹽外它們對(duì)分析樣品中的核酸來(lái)說(shuō)不是必須的。
[0022]為了解決上述問(wèn)題，本技術(shù)提供一種包括以下步驟的純化核酸的方法:超聲處理包含核酸的樣品，用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂吸附包含于樣品中的物質(zhì)，以及通過(guò)阻斷利用電泳遷移的核酸來(lái)濃縮核酸。
[0023]電泳可以在嵌入具有陰離子官能團(tuán)的嵌入劑(intercalator)的核酸上進(jìn)行。同樣，電泳可以在通過(guò)混合:樣品、具有通過(guò)脫水縮合與包含于樣品中的物質(zhì)的羧基進(jìn)行反應(yīng)的官能團(tuán)的化合物以及脫水縮合反應(yīng)的縮合劑所得到的核酸上進(jìn)行。
[0024]此外，本技術(shù)提供一種用于純化核酸的試劑盒，該試劑盒包括:陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、陰離子交換樹(shù)脂的試劑盒、以及一種用于分布(能夠流通)包含核酸的樣品的內(nèi)部盛有(保持有)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂的核酸純化儀器。
[0025]發(fā)明效果
[0026]本技術(shù)提供了一種短時(shí)間內(nèi)有效率地純化核酸的簡(jiǎn)單方法?！緦?zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1:用于解釋根據(jù)本技術(shù)的第一實(shí)施方式的純化核酸方法的各步驟的示意圖。
[0028]圖2:用于概念性解釋根據(jù)本技術(shù)的第一實(shí)施方式的由第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂所吸附的外源物質(zhì)的狀態(tài)的示意圖。
[0029]圖3:用于概念性解釋根據(jù)本技術(shù)第一實(shí)施方式的由第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂所吸附的外源物質(zhì)的狀態(tài)的示意圖。
[0030]圖4:用于解釋根據(jù)本技術(shù)的第二實(shí)施方式的純化核酸方法的各步驟的示意圖。
[0031]圖5:顯示了由陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附處理后的核酸回收率的圖(測(cè)試實(shí)施例1)。
[0032]圖6:顯示了由陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附處理后的樣品的LAMP反應(yīng)結(jié)果的圖(測(cè)試實(shí)施例I)。
[0033]圖7:顯示了考查陽(yáng)離子交換樹(shù)脂對(duì)反荷離子種類(lèi)(Na+、H+)回收率的影響結(jié)果的圖(測(cè)試實(shí)施例2)。
[0034]圖8:顯示了由離子交換樹(shù)脂吸附處理后的樣品的LAMP反應(yīng)結(jié)果的圖(實(shí)施例4和5)。
[0035]圖9:顯示了由陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的吸附處理后的樣品的LAMP反應(yīng)和RT-LAMP反應(yīng)(Tf值)的結(jié)果的圖(實(shí)施例4和5)。
[0036]圖10:顯示了由陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的吸附處理后的LAMP反應(yīng)和RT-LAMP反應(yīng)(Tt值)的結(jié)果的圖(實(shí)施例6)。
[0037]圖11:顯示了由離子交換樹(shù)脂的吸附處理后的LAMP反應(yīng)和RT-LAMP反應(yīng)(Tt值)的結(jié)果的圖(實(shí)施例7)。
[0038]圖12:顯示了樣品的LAMP反應(yīng)結(jié)果的圖(實(shí)施例12)。
[0039]圖13:顯示了樣品的RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果的圖(實(shí)施例12)。
[0040]參照數(shù)字說(shuō)明
[0041]1、101:用于純化核酸的試劑盒
[0042]3:核酸純化儀器
[0043]10:離子交換樹(shù)脂
[0044]20:第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂
[0045]30:陰離子交換樹(shù)脂
[0046]40:第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂
【具體實(shí)施方式】
[0047]下面將參照附圖描述本公開(kāi)的【具體實(shí)施方式】。以下描述的實(shí)施方式僅描述本公開(kāi)的典型實(shí)施方式，且本公開(kāi)的范圍不應(yīng)該被解釋為范圍變窄。這些實(shí)施方式將按如下順序描述:
[0048]1.本技術(shù)第一實(shí)施方式的用于純化核酸的試劑盒和純化核酸的方法
[0049](1)用于純化核酸的試劑盒
[0050](2)純化核酸的方法
[0051]2.本技術(shù)第二實(shí)施方式中純化核酸的試劑盒和純化核酸的方法[0052]3.提取核酸的方法
[0053]1.本技術(shù)第一實(shí)施方式中用于純化核酸的試劑盒和純化核酸的方法
[0054](I)用于純化核酸的試劑盒
[0055]首先，參照?qǐng)D1(A)，本文將描述根據(jù)本技術(shù)的第一實(shí)施方式的用在純化核酸的方法中的用于純化核酸的試劑盒。圖1(A)~(C)是用于解釋根據(jù)本技術(shù)第一實(shí)施方式的純化核酸的方法的各步驟的示意圖。
[0056]在圖1 (A)中，用于純化核酸的試劑盒I吸附包含于樣品中的除核酸外的物質(zhì)(以下表示為“外源物質(zhì)”)，且純化該核酸。用于純化核酸的試劑盒I主要包括離子交換樹(shù)脂10和核酸純化儀器3，該核酸純化儀器3內(nèi)部盛有離子交換樹(shù)脂10且其能夠分布含核酸的樣品。本技術(shù)中所使用的樣品不是特別受限制，可以是生物樣品，例如拭子、口腔拭子、唾液、血清、血衆(zhòng)、外周血單核細(xì)胞、腦脊液、糞便、尿、培養(yǎng)細(xì)胞和活檢組織(biopsy tissue)。除生物樣品外，該樣品也可以是河流水、海水、土壤等。
[0057]該核酸純化儀器3內(nèi)部盛有離子交換樹(shù)脂10且分布樣品。核酸純化儀器3的形狀、材質(zhì)等不是特別受限制，只要核酸純化儀器3能夠內(nèi)部盛有離子交換樹(shù)脂10且分布樣品。例如，正如圖1(A)所示的，上部具有開(kāi)口的商業(yè)可得的樣品管、槍頭(chip)等。任選地，核酸純化儀器3可具有在上部和下部具有開(kāi)口的試管。在該情形下，樣品經(jīng)核酸純化儀器3分布且被離子交換樹(shù)脂10吸附后，能夠使用單獨(dú)的槍頭等來(lái)回收從下部流過(guò)的樣品。
[0058]根據(jù)本技術(shù)的離子交換樹(shù)脂10吸附包含于樣品中的外源物質(zhì)。該離子交換樹(shù)脂10包括陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂。例如，外源物質(zhì)包括蛋白質(zhì)和金屬鹽。外源物質(zhì)可以包括多種肽、糖、鹽、低 分子量的陰離子(例如，延胡索酸、酞酸、腐殖酸和灰黃霉酸)，除蛋白質(zhì)和金屬鹽外它們對(duì)分析樣品中的核酸來(lái)說(shuō)不是必須的。
[0059]上述的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂主要吸附陽(yáng)離子外源物質(zhì)。優(yōu)選地，陽(yáng)離子交換樹(shù)脂包括第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂具有小于第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的排阻極限分子量的排阻極限分子量。第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂主要用于吸附包含于樣品中的蛋白質(zhì)。第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂主要用于吸附包含于樣品中的例如金屬離子的正離子(陽(yáng)離子)。
[0060]只要樣品中存在蛋白質(zhì)就能夠使用第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的非限定性實(shí)例。優(yōu)選地，第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂是強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的固定離子優(yōu)選為SO'反荷離子的非限定性實(shí)例包括鈣離子(Ca2+)、銅離子(Cu2+)、鋅離子(Zn2+)、鎂離子(Mg2+)、鉀離子(K+)、銨離子(NH4+)、鈉離子(Na+)、質(zhì)子(H+)等。在這方面上，這些離子的離子交換強(qiáng)度(離子選擇性)的順序?yàn)镃a2+>Cu2+>Zn2+>Mg2+>K+>NH4+>Na+>H+。相應(yīng)地，就離子交換強(qiáng)度而言，反荷離子優(yōu)選為H+。另一方面，當(dāng)反荷離子為H+時(shí)，樣品的pH可能轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝詡蒛。相反地，反荷離子為Na+時(shí)，吸附金屬鹽的功能弱于反荷離子為H+時(shí)。然而，抑制樣品PH的變化是可能的。盡管反荷離子為Na+，第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂能夠完全吸附蛋白質(zhì)。因此，第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂優(yōu)選為具有Na+作為反荷離子的強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(Na+型強(qiáng)酸性尚子交換樹(shù)脂)。
[0061]第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂不是特別受限制，只要包含于樣品中的例如金屬鹽的陽(yáng)離子能夠被吸附，但是第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂優(yōu)選為強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的固定離子優(yōu)選為so3-。反荷離子不是特別受限制。然而，就上述離子交換強(qiáng)度(離子選擇性)而言，第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的反荷離子優(yōu)選為質(zhì)子(H+)。
[0062]陰離子交換樹(shù)脂吸附包含于樣品中的負(fù)離子(陰離子)。只要樣品中包含例如金屬鹽的陰離子就能夠使用陰離子交換樹(shù)脂的非限定性實(shí)例。優(yōu)選地，陰離子交換樹(shù)脂為強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂。陰離子交換樹(shù)脂可以為具有三甲基銨基的I型強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)月旨，或者具有二甲基乙醇銨基的II型強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂。在I型中，這些離子的陰離子交換強(qiáng)度(離子選擇性)的順序?yàn)?HS04->N03->Br->Cr>HC03->HC00->CH3C00->F->0H-。在 II型中，這些離子的陰離子交換強(qiáng)度(離子選擇性)的順序?yàn)镠S04->N03->Br->Cr>HC03->0H->Hcoo->ch3coo_>f-。在這些I型和II型強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂中，I型強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂能夠更加準(zhǔn)確地吸附氯離子(Cl—)等。因此，陰離子交換樹(shù)脂優(yōu)選為I型的且包含氫氧離子(0H_)作為反荷離子。
[0063]用于純化核酸的試劑盒I可能包括添加劑，例如包含非離子表面活性劑的非離子化合物、非離子親水性聚合物化合物等，從而使得核酸不和外源物質(zhì)一起吸附。非離子化合物的實(shí)例包括非離子表面活性劑，例如Brij35、吐溫20和TritonXlOO。同樣，非離子親水性聚合物化合物的實(shí)例包括聚乙二醇、多羥基乙基纖維素等。這些例舉的非離子化合物可以單獨(dú)或組合使用。此外，用于純化核酸的試劑盒I可以包含螯合添加劑，例如EDTA。
[0064]用于純化核酸的試劑盒I可以包含緩沖溶液。用于緩沖溶液的緩沖劑實(shí)例包括HomoPIPES (pH: 3.9 ~5.1，pKa:4.55) ,MES (pH: 5.5 ~7.0，pKa:6.15) ,Bis-Tris (pH: 5.7 ~
7.3, pKa:6.46) , ADA (pH: 5.8 ~7.4，pKa: 6.60)、PIPES (pH: 6.1 ~7.5，pKa: 6.80)、ACES (pH: 6.0 ~7.5，pKa:6.90)、M0PS0(pH:6.2 ~7.4，pKa: 6.95)、BES (pH: 6.6 ~
8.0，pKa:7.15)、M0PS(pH:6.5 ~7.9，pKa: 7.20)、TES (pH: 6.8 ~8.2，pKa: 7.50)、HEPES (pH: 6.8 ~8.2，pKa: 7.55)、DIPSO (pH: 6.9 ~8.1，pKa: 7.6)、TAPSO (pH: 7.0 ~
8.2，pKa: 7.7)、POPSO (pH: 7.2 ~8.5，pKa: 7.85)、HEPPSO (pH: 7.4 ~8.6，pKa: 7.9)、EPPS (pH:7.5 ~8.5，pKa: 8.0)、Tricine (pH: 7.8 ~8.8，pKa: 8.15)、Bicine (pH: 7.7 ~
9.1，pKa:8.35)、TAPS(pH:7.7 ~9.1，pKa: 8.4)、CHES (pH: 8.6 ~10.0，pKa: 9.5)、CAPSO (pH: 9.3 ~10.7，pKa: 10.0)、CAPS (pH: 9.7 ~11.1, pKa: 10.40)等。前面引用的每種緩沖劑的PH范圍表示緩沖劑所加入樣品的合適pH范圍。除HomoPIPES外(對(duì)于HomoPIPES，其pKa是在37°C下)，前面引用的每種緩沖液的pKa表示20°C下的pKa。稀釋樣品的緩沖溶液的PH優(yōu)選為4~8。在這方面上，在前面引用的緩沖劑中，用于第一實(shí)施方式中的緩沖劑優(yōu)選為 HomoPIPES、MES、Bis-Tris 和 ADA。
[0065](2)純化核酸的方法
[0066]然后，參照?qǐng)D1的(A)至(C)，將描述根據(jù)本技術(shù)第一實(shí)施方式的純化核酸方法的步驟。
[0067]在描述根據(jù)本技術(shù)第一實(shí)施方式的純化核酸的方法之前，將描述本技術(shù)的相關(guān)技術(shù)中純化核酸的方法。在相關(guān)技術(shù)的純化核酸的方法中，使用沸石(zeolite)吸附樣品中的外源物質(zhì)(例如，參見(jiàn)專(zhuān)利文件2)。
[0068]通過(guò)相關(guān)技術(shù)中的純化核酸的方法，只有包含于例如生物樣品的樣品中的陰離子和陽(yáng)離子中的陽(yáng)離子能夠被除去。因此，在相關(guān)技術(shù)中純化核酸的方法中，當(dāng)純化樣品時(shí)，質(zhì)子會(huì)被排出，由此減小含有樣品的溶液的PH(更加轉(zhuǎn)移至酸性側(cè))。在這方面上，樣品純化后，核酸擴(kuò)增反應(yīng)可以在pH為7~9下進(jìn)行。有必要事先設(shè)定包含和沸石接觸的樣品的溶液的pH更大(設(shè)定于堿性側(cè))。用這種方式，相關(guān)技術(shù)中的純化核酸的方法可能是復(fù)雜的操作。同樣，當(dāng)樣品包含RNA時(shí)，RNA可能被分解。
[0069]在相關(guān)技術(shù)中的純化核酸的方法中，用堿性化合物和表面活性劑(例如SDS)的混合試劑稀釋樣品后，在高溫下加熱樣品。同樣在這方面上，相關(guān)技術(shù)中的純化核酸的方法可能是復(fù)雜的操作，同樣，當(dāng)樣品包含RNA時(shí)，RNA可能被分解。
[0070]此外，在相關(guān)技術(shù)中純化核酸的方法中，純化樣品后，陰離子可能保留于樣品中。此外，陰離子表面活性劑可能包含于樣品中。因此，當(dāng)樣品純化后對(duì)核酸進(jìn)行電泳時(shí)，樣品可能具有高電解質(zhì)濃度且易于產(chǎn)生熱量。同樣在這方面上，當(dāng)樣品包含RNA時(shí)，RNA可能被分解。此外，樣品的常規(guī)流動(dòng)由熱產(chǎn)生引起，由此會(huì)降低核酸的電泳濃縮效率。
[0071]相反地，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)他們的大量研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以下詳細(xì)描述的根據(jù)本技術(shù)的純化核酸的方法，不需要復(fù)雜的操作，極大簡(jiǎn)化操作，并且該方法是能夠短時(shí)間內(nèi)高效地純化核酸的簡(jiǎn)單方法。
[0072]在根據(jù)本技術(shù)第一實(shí)施方式的純化核酸的方法中，放置于容器5中的含核酸的樣品A和用于稀釋樣品A的緩沖溶液裝填入附屬于移液管50的移液管吸頭51 (參見(jiàn)圖1 (A))。然后，裝填入移液管50的樣品A和用于稀釋樣品A的緩沖溶液注射入核酸純化儀器3(參見(jiàn)圖1 (B))。此時(shí)，由于核酸純化儀器3內(nèi)部盛有離子交換樹(shù)脂10，包含于樣品A中的外源物質(zhì)由離子交換樹(shù)脂10所吸附。
[0073]最后，用離子交換樹(shù)脂10經(jīng)過(guò)吸附外源物質(zhì)所純化的樣品A穿過(guò)離子交換樹(shù)脂10，且在核酸純化儀器3的底部聚集(參見(jiàn)圖1 (C))。
[0074]經(jīng)圖1 (A)至(C)中所示的步驟后，能夠?qū)悠稟實(shí)施核酸擴(kuò)增反應(yīng)。例如，核酸擴(kuò)增反應(yīng)能夠通過(guò)加入樣品A至固化的核酸擴(kuò)增試劑的方式進(jìn)行。在第一實(shí)施方式中，通過(guò)離子交換樹(shù)脂10可以使樣品脫礦物質(zhì)以改變雙螺旋DNA成為單鏈DNA。因此，在核酸擴(kuò)增反應(yīng)之前，可以適當(dāng)?shù)馗男訢NA。
[0075]本文中，參照?qǐng)D2和3，將詳細(xì)描述由離子交換樹(shù)脂10所吸附的包含于樣品A中的外源物質(zhì)(圖1(B)中的(I))的狀態(tài)。圖2是用于概念性解釋特別是由圖1(B)所示的第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附的外源物質(zhì)的狀態(tài)的示意圖。圖3是用于概念性解釋特別是由圖1 (B)所示的第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂吸附的外源物質(zhì)的狀態(tài)的示意圖。
[0076]參照?qǐng)D2，顯示了由包含于離子交換樹(shù)脂10的第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20所吸附的包含于樣品A的外源物質(zhì)的狀態(tài)。在圖2中，核酸B包含于樣品A中，且蛋白質(zhì)C為包含于樣品A的外源物質(zhì)中的一種。本文中，第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20是具有鈉離子(Na+)作為反荷離子的強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。
[0077]第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20包含例如S03_的陰離子21和反荷離子Na+22。此外，在第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20上形成用于吸附蛋白質(zhì)C的區(qū)域23。
[0078]正如圖2中所 示的，由于包含于流入核酸純化儀器3的樣品A中的蛋白質(zhì)C是帶正電的，蛋白質(zhì)C被表面上具有陰離子21的第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20所吸附。另一方面，由于核酸B是帶負(fù)電的，核酸B不會(huì)被第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20吸附，并由包含于樣品A中的緩沖溶液的流過(guò)而引導(dǎo)流過(guò)。此外，由于第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20的反荷離子為Na+22，第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20較少地吸附(脫礦物質(zhì))金屬鹽但能夠選擇性吸附蛋白質(zhì)C，正如相比于反荷離子為H+的情形。[0079]在該情形下，用于稀釋樣品A的緩沖溶液優(yōu)選具有4~8的pH。用于稀釋樣品A的具有PH為4~8的(酸性)緩沖溶液，只有外源物質(zhì)(主要是蛋白質(zhì)C)能夠帶正電，同時(shí)核酸B帶負(fù)電。用這種方式，只有蛋白質(zhì)C能夠被離子交換樹(shù)脂20穩(wěn)定地吸附，且能夠高效地純化核酸B。此外，由于第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20是強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20能夠在大范圍pH條件(例如pH為3~13)下帶負(fù)電。正如前面描述的，盡管樣品是酸性的，第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20能夠穩(wěn)定地吸附蛋白質(zhì)C。此外，樣品A具有4~8的pH(酸性)，能夠抑制RNase的活性，從而利于純化RNA。
[0080]優(yōu)選第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20的排阻極限分子量能夠使得將包含于樣品A中的蛋白質(zhì)C引入至區(qū)域23。更具體地，第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20的排阻極限分子量?jī)?yōu)選為5000或更大。當(dāng)?shù)谝魂?yáng)離子交換樹(shù)脂20的排阻極限分子量為5000或更大時(shí)，容易地且特別選擇性地吸附蛋白質(zhì)C，并且將其從外源物質(zhì)中除去。
[0081]第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20的平均體積粒徑優(yōu)選為I~3000 μ m。當(dāng)?shù)谝魂?yáng)離子交換樹(shù)脂20的平均體積粒徑為I~3000 μ m時(shí)，容易地且特別選擇性地吸附蛋白質(zhì)C，并且將其從外源物質(zhì)中除去。
[0082]第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20中的顆粒本身的比重優(yōu)選為0.5~2.5。當(dāng)?shù)谝魂?yáng)離子交換樹(shù)脂20中的顆粒本身的比重優(yōu)選為0.5~2.5時(shí)，容易地且特別選擇性地吸附蛋白質(zhì)C，并且將其從外源物質(zhì)中除去。更優(yōu)選地，顆粒本身的比重為1.0~2.5。當(dāng)比重為1.0~
2.5時(shí)，顆粒在溶液中容易地沉積，從而可能容易地從溶液中除去顆粒。
[0083]然后，圖3解釋了由包含于離子交換樹(shù)脂10的陰離子交換樹(shù)脂30和第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40吸附的包含于樣品A中的外源物質(zhì)的狀態(tài)。
[0084]在圖3中，每個(gè)指定符號(hào)Dl、D2或D3為包含于金屬鹽的陽(yáng)離子或陰離子，該金屬鹽為包含于樣品A中的外源物質(zhì)的實(shí)例。盡管在第一實(shí)施方式中不是特別加以限定，但是Dl表示例如氯離子的陰離子，D2表示例如鈉離子的陽(yáng)離子，且D3表示例如鎂離子的陽(yáng)離子。
[0085]參照?qǐng)D3，將描述陰離子交換樹(shù)脂30吸附外源物質(zhì)(主要為例如氯離子的陰離子)的狀態(tài)。在第一實(shí)施方式中，陰離子交換樹(shù)脂30是具有氫氧離子作為反荷離子的I型強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂。
[0086]陰離子交換樹(shù)脂30具有例如CH2N(CH3)3+的陽(yáng)離子31和例如0H_32的反荷離子。此外，用于吸附例如氯離子Dl的陰離子的區(qū)域33在陰離子交換樹(shù)脂30中形成。
[0087]正如圖3所示的，包含于流入核酸純化儀器3的樣品A中的氯離子Dl是帶負(fù)電的，且被表面具有陽(yáng)離子31的陰離子交換樹(shù)脂30吸附。例如，氯離子Dl被吸附至區(qū)域33。盡管核酸B也是帶負(fù)電的，但是核酸B具有比例如氯離子Dl的陰離子更大的體積，從而較少地由陰離子交換樹(shù)脂30所吸附。在這方面上，陰離子交換樹(shù)脂30的排阻極限分子量?jī)?yōu)選100~2000。當(dāng)陰離子交換樹(shù)脂30的排阻極限分子量為100~2000時(shí)，更加準(zhǔn)確地抑制核酸B的吸附，且例如氯離子Dl的陽(yáng)離子被選擇性吸附并輕易地除去。 [0088]陰離子交換樹(shù)脂30的平均體積粒徑優(yōu)選I~3000 μ m。當(dāng)?shù)谝魂?yáng)離子交換樹(shù)脂20的平均體積粒徑為I~3000 μ m時(shí)，例如氯離子Dl的陽(yáng)離子能夠被選擇性吸附并輕易地除去。
[0089]陰離子交換樹(shù)脂30的比重優(yōu)選為0.5~2.5。當(dāng)陰離子交換樹(shù)脂30的比重為0.5~2.5時(shí)，例如氯離子Dl的陽(yáng)離子能夠被選擇性吸附并輕易地除去，同時(shí)具有較高的精確度。更優(yōu)選地，顆粒本身的比重為1.0~2.5。當(dāng)比重為1.0~2.5時(shí)，顆粒容易地在溶液中沉積，從而可能從溶液中容易地除去顆粒。
[0090]然后，圖3解釋了外源物質(zhì)(主要為鈉離子D2和鎂離子D3的陽(yáng)離子)由第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40所吸附的狀態(tài)。在第一實(shí)施方式中，第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40為具有H+離子(質(zhì)子)作為反荷離子的強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。
[0091]第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40具有例如S03_的陰離子41和H+42。此外，用于吸附例如鈉離子D2和鎂離子D3的陽(yáng)離子的區(qū)域43在第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40中形成。
[0092]正如圖3所示的，包含于流入核酸純化儀器3的樣品A中的鈉離子D2和鎂離子D3是帶正電的，且由表面上具有陰離子41的第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40所吸附。例如，鈉離子D2和鎂離子D3吸附于區(qū)域43上。另一方面，核酸B是帶負(fù)電的，因此其不能由第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40吸附，而是被包含于樣品A的緩沖溶液的流過(guò)而引導(dǎo)流過(guò)。
[0093]本文中，第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40具有比第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20更小的排阻極限分子量。相應(yīng)地，相比于第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20，第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40具有增加的每單位面積表面積，且易于脫礦物質(zhì)(demineralized)。當(dāng)?shù)诙?yáng)離子交換樹(shù)脂40具有質(zhì)子作為反荷離子時(shí)，第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40相比于第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20更易于脫礦物質(zhì)。第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40的排阻極限分子量?jī)?yōu)選為100~2000。當(dāng)?shù)诙?yáng)離子交換樹(shù)脂40的排阻極限分子量為100~2000時(shí)，例如鈉離子D2和鎂離子D3的陽(yáng)離子能夠更準(zhǔn)確地被吸附。
[0094]第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40的平均體積粒徑優(yōu)選為I~3000 μ m。當(dāng)?shù)诙?yáng)離子交換樹(shù)脂40的平均體積粒徑為I~3000 μ m時(shí)，例如鈉離子D2和鎂離子D3的陽(yáng)離子能夠更準(zhǔn)確地被吸附。第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40的平均體積粒徑更優(yōu)選為I~2000 μ m。當(dāng)?shù)诙?yáng)離子交換樹(shù)脂40的平均體積粒徑為I~2000 μ m時(shí)，當(dāng)溶液流過(guò)離子交換樹(shù)脂時(shí)可以降低壓力。
[0095]第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40的比重優(yōu)選為0.5~2.5。當(dāng)?shù)诙?yáng)離子交換樹(shù)脂40的比重為0.5~2.5時(shí)，能夠更準(zhǔn)確地吸附例如鈉離子D2和鎂離子D3的陽(yáng)離子。更加優(yōu)選地,顆粒本身的比重為1.0~2.5。當(dāng)比重為1.0~2.5時(shí)，顆粒容易地在溶液中沉積，從而可能從溶液中容易地除去顆粒。
[0096]同樣，優(yōu)選地，陰離子交換樹(shù)脂30比第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40的離子交換容量的百分比為50~150%。當(dāng)離子交換容量的百分比為50~150%時(shí)，樣品能夠被脫礦物質(zhì)并且更加穩(wěn)定地抑制PH的變化。
[0097]同樣，優(yōu)選地，陰離子交換樹(shù)脂30比第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40的含量百分比為50~150%。當(dāng)含量百分比為50~150%時(shí)，樣品能夠被脫礦物質(zhì)并且更加穩(wěn)定地抑制pH的變化。
[0098]盡管未在圖2和3中顯示，但是適當(dāng)?shù)叵驑悠分屑尤敕请x子表面活性劑，例如Brij35、吐溫20和TritonXlOO，以阻止核酸B被離子交換樹(shù)脂所吸附。同樣，優(yōu)選適當(dāng)?shù)叵驑悠稟中加入非離子親水性聚合物化合物，例如聚乙二醇、多羥基乙基纖維素。
[0099]根據(jù)如前面描述的本技術(shù)第一實(shí)施方式的純化核酸的方法，包含陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂的離子交換樹(shù)脂10用作吸附載體，由此吸附包含于樣品中的外源物質(zhì)。例如，當(dāng)樣品為血液樣品時(shí)，能夠直接進(jìn)行吸附步驟，而不需要復(fù)雜的前處理步驟。因此，根據(jù)第一實(shí)施方式的純化核酸的方法能夠通過(guò)非常簡(jiǎn)單的操作短時(shí)間內(nèi)高效地提取核酸。具體地，在純化核酸的方法中，進(jìn)行全部步驟只需要幾秒鐘。用這種方式能夠在如此短的時(shí)間內(nèi)純化核酸。
[0100]由于不同于娃石固相萃取(silica solid-phase extraction),根據(jù)第一實(shí)施方式的純化核酸方法不包括清洗步驟，舉例來(lái)說(shuō)，對(duì)于該操作只需要少量的樣品且還能夠降低設(shè)備的尺寸。同樣，第一實(shí)施方式的純化核酸方法能夠吸附外源物質(zhì)，使得樣品保持在酸性條件下(優(yōu)選PH為4~8)。換言之，根據(jù)第一實(shí)施方式的純化核酸方法不需要調(diào)整樣品為堿性或?qū)ζ浼訜帷Ｏ鄳?yīng)地，當(dāng)樣品包含RNA時(shí)，能夠純化樣品同時(shí)抑制RNA分解。此外，在第一實(shí)施方式的純化核酸方法中，當(dāng)對(duì)酸性區(qū)域進(jìn)行超聲分散時(shí)，能夠抑制RNase的功能。
[0101]當(dāng)通過(guò)使用固化核酸擴(kuò)增試劑進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，不稀釋樣品且外源物質(zhì)明顯抑制核酸擴(kuò)增反應(yīng)。然而，由于經(jīng)由第一實(shí)施方式的純化核酸方法純化的樣品不包含外源物質(zhì)，通過(guò)向固化核酸方法試劑(solidified nuclear acid amplification reagent)直接加入核酸的方式能夠進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
[0102]根據(jù)本技術(shù)第一實(shí)施方式的純化核酸方法，第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和具有排阻極限分子量小于第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂能夠用作陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。相應(yīng)地，當(dāng)樣品中的外源物質(zhì)包含金屬鹽和蛋白質(zhì)時(shí)，兩者均能有效地被除去。
[0103]為了通過(guò)第一實(shí)施方式的純化核酸方法吸附和除去外源物質(zhì)，若第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂各自為強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂則更加有效。當(dāng)?shù)谝魂?yáng)離子交換樹(shù)脂的反荷離子為Na+或第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的反荷離子為H+時(shí)，能夠更加有效地除去外源物質(zhì)。
[0104]在第一實(shí)施方式的純化核酸方法中，當(dāng)陰離子交換樹(shù)脂為強(qiáng)堿性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂時(shí)，更加有效地除去外源物質(zhì)。當(dāng)陰離子交換樹(shù)脂的反荷離子為0H—時(shí)，更加有效地除去外源物質(zhì)。
[0105]根據(jù)第一實(shí)施方式的純化核酸方法，陰離子交換樹(shù)脂比第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的離子交換容量的百分比為50~150%，從而能夠抑制樣品中pH的變化。正如前面所描述的，當(dāng)樣品包含RNA時(shí)，能夠純化樣品同時(shí)抑制RNA分解。
[0106]在第一實(shí)施方式的純化核酸方法中，能夠使用非離子化合物，例如非離子表面活性劑和非離子親水性聚合物化合物。在這種情形下，抑制核酸吸附于離子交換樹(shù)脂基體，并能夠有效地除去外源物質(zhì)。
[0107]2.本技術(shù)第二實(shí)施方式的用于純化核酸的試劑盒和純化核酸方法
[0108]圖4(A)~(C)是用于解釋本技術(shù)第二實(shí)施方式的純化核酸的方法中各步驟的示意圖。
[0109]在圖4(A)中，用于純化核酸的試劑盒101包括離子交換樹(shù)脂10和核酸純化儀器3，該核酸純化儀器3內(nèi)部盛有離子交換樹(shù)脂10且能夠分布含核酸的樣品。離子交換樹(shù)脂10包括陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂。在第二實(shí)施方式的用于純化核酸的試劑盒101中，陽(yáng)離子交換樹(shù)脂包括第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20和第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40。
[0110]第二實(shí)施方式的用于純化核酸的試劑盒、純化核酸的方法和第一實(shí)施方式的用于純化核酸的試劑盒、純化核酸的方法的不同點(diǎn)主要在于:在第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20放置于陰離子交換樹(shù)脂30和第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40的上層(在注入樣品的一側(cè))的狀態(tài)下純化核酸。為了這個(gè)目的，在第二實(shí)施方式中將主要描述設(shè)置于陰離子交換樹(shù)脂30和第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40上層的第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20的位置。
[0111]在第二實(shí)施方式的純化核酸的方法中，第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20放置于核酸純化儀器3內(nèi)部的陰離子交換樹(shù)脂30和第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40的上層。因此，從上層側(cè)注射的樣品A首先接觸第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20 (參見(jiàn)圖4(B))。
[0112]然后，一部分外源物質(zhì)由第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20除去的樣品A接觸陰離子交換樹(shù)脂30和第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40。包含于樣品A的外源物質(zhì)中的蛋白質(zhì)被第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20吸附的狀態(tài)(圖4(B)中的區(qū)域(II))能夠解釋成類(lèi)似于參照?qǐng)D2的由第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20吸附的蛋白質(zhì)的狀態(tài)。因此，省略了具體的描述。包含于樣品A的外源物質(zhì)中的金屬鹽被陰離子交換樹(shù)脂30和第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40吸附的狀態(tài)(圖4(B)中的區(qū)域
(III))能夠解釋成類(lèi)似于參照?qǐng)D3的由陰離子交換樹(shù)脂30和第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40吸附的金屬鹽的狀態(tài)。因此，省略了具體的描述。陰離子交換樹(shù)脂30或第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40中的任意可以放置作為上層，或可以混合且放置作為第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20的下層。
[0113]最后，外源物質(zhì)由離子交換樹(shù)脂10所吸附后，純化后的樣品在下層聚集。
[0114]根據(jù)本技術(shù)第二實(shí)施方式的純化核酸的方法，樣品A中的外源物質(zhì)由第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20所吸附，并然后進(jìn)一步由陰離子交換樹(shù)脂30和第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40所吸附。因此，根據(jù)本技術(shù)第二實(shí)施方式的純化核酸的方法，在除去具有較大體積的蛋白質(zhì)之后，能夠除去具有較小體積的金屬鹽，從而有效地除去外源物質(zhì)。
[0115]3.提取核酸的方 法
[0116]然后，下面將描述包括于各個(gè)實(shí)施方式的純化核酸方法中的提取核酸的方法。本技術(shù)中提取核酸的方法包括以下步驟:超聲處理含核酸的樣品；用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂吸附包含于樣品中的物質(zhì)；以及通過(guò)阻斷利用電泳遷移的核酸來(lái)濃縮核酸，作為核酸擴(kuò)增反應(yīng)的前處理。
[0117]上述步驟不是特別限定。例如，全部步驟能夠在同一單元(cell)中進(jìn)行。當(dāng)各個(gè)步驟在同一單元中進(jìn)行時(shí)，用于超聲過(guò)程的超聲發(fā)生器能夠設(shè)置于單元中。此外，單元能夠放置陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂。對(duì)于陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂，能夠使用用于本技術(shù)各個(gè)實(shí)施方式中的純化核酸方法的離子交換樹(shù)脂10 (第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20、陰離子交換樹(shù)脂30和第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂40)。同樣，用于電泳的負(fù)極和正極設(shè)置于單元中，且用于阻斷電泳遷移的核酸的阻斷器(blocker)(例如透析膜、聚合物凝膠等)能夠設(shè)置于單元中。
[0118]在核酸電泳時(shí)，能夠?qū)⒕哂嘘庪x子官能團(tuán)的嵌入劑嵌入核酸中。嵌入劑的實(shí)例包括具有磺基官能團(tuán)的化合物。具體實(shí)例包括9，10-蒽醌-2，6-二磺酸、蒽醌-1-磺酸鈉、蒽醌_2，7-磺酸二鈉、蒽醌-1，5-磺酸二鈉、蒽醌-2-磺酸鈉等。用這種方式，當(dāng)具有陰離子官能團(tuán)的嵌入劑嵌入核酸時(shí)，能夠調(diào)整在核酸電泳中的核酸的等電點(diǎn)。換言之，能夠濃縮和純化核酸，并且控制核酸的電泳速度。
[0119]此外，蛋白質(zhì)(一種包含于樣品中的外源物質(zhì))的羧基可以脫水，并和以下化合物縮合:例如N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、乙醇胺、乙二胺等。在脫水和縮合反應(yīng)中，基于碳二亞胺的化合物能夠用作縮合劑?；谔级啺返木唧w實(shí)例包括1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、氯化(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉(DMT-MM)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、二異丙基碳二亞胺(DIC)等。因此，盡管在核酸電泳時(shí)樣品中存在蛋白質(zhì)，但是與蛋白質(zhì)中的羧基脫水和縮合的核酸的等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)之間的差別變大，從而高準(zhǔn)確地從蛋白質(zhì)中分離核酸。
[0120]通過(guò)實(shí)施上述的各步驟，能夠非常簡(jiǎn)單且高效率地回收濃縮后的核酸。特別地，當(dāng)各步驟在同一單元中進(jìn)行時(shí)，能夠降低處理作為樣品的感染性試樣時(shí)對(duì)操作員感染的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)椴恍枰D(zhuǎn)移樣品至其它設(shè)備。
[0121]本技術(shù)可以具有以下的構(gòu)型:
[0122](1).一種純化核酸的方法，包括以下步驟:
[0123]用包含陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂的離子交換樹(shù)脂吸附含核酸的樣品中的物質(zhì)。
[0124](2).根據(jù)上述(1)所述的純化核酸的方法，其中，
[0125]陽(yáng)離子交換樹(shù)脂包括第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂具有的排阻極限分子量小于第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的排阻極限分子量。
[0126](3).根據(jù)上述(2)所述的純化核酸的方法，其中，
[0127]物質(zhì)由第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附，并然后進(jìn)一步由陰離子交換樹(shù)脂和第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附。
[0128](4).根據(jù)上述(2)或(3)所述的純化核酸的方法，其中，
[0129]樣品從在上層包含第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和在下層包含陰離子交換樹(shù)脂和第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的柱子的上層側(cè)流入。
[0130](5).根據(jù)上述(I)~⑷中任一項(xiàng)所述的純化核酸的方法，其中，
[0131]所述步驟是通過(guò)離子交換樹(shù)脂來(lái)吸附包含于樣品中的物質(zhì)，所述樣品用緩沖液稀釋?zhuān)揖彌_液具有4.0~8.0的pH。
[0132](6).根據(jù)上述(1)~(5)中任一項(xiàng)所述的純化核酸的方法，其中，
[0133]陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。
[0134](7).根據(jù)上述(2)~(6)中任一項(xiàng)所述的純化核酸的方法，其中，
[0135]第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的反荷離子為Na+。
[0136](8).根據(jù)上述(2)~(7)中任一項(xiàng)所述的純化核酸的方法，其中，
[0137]第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的反荷離子為H+。
[0138](9).根據(jù)上述⑴~⑶中任一項(xiàng)所述的純化核酸的方法，其中，
[0139]陰離子交換樹(shù)脂為強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂。
[0140](10).根據(jù)上述(1)~(9)中任一項(xiàng)所述的純化核酸的方法，其中，
[0141]陰離子交換樹(shù)脂的反荷離子為0H_。
[0142](11).根據(jù)上述⑵~(10)中任一項(xiàng)所述的純化核酸的方法，其中，
[0143]陰離子交換樹(shù)脂比第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的離子交換容量的百分比為50~150%。
[0144](12).根據(jù)上述(1)~(11)中任一項(xiàng)所述的純化核酸的方法，其中，
[0145]非離子表面活性劑和/或非離子親水性聚合物化合物用于吸附物質(zhì)。
[0146](13).根據(jù)上述(1)~(12)中任一項(xiàng)所述的純化核酸的方法，其中，
[0147]物質(zhì)為包含至少蛋白質(zhì)和金屬鹽的外源物質(zhì)。[0148](14).一種提取核酸的方法，包括以下步驟:
[0149]超聲處理含核酸的樣品；
[0150]用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂吸附包含于樣品中的物質(zhì)；以及
[0151]通過(guò)阻斷利用電泳遷移的核酸來(lái)濃縮核酸。
[0152](15).根據(jù)上述(14)所述的提取核酸的方法，其中，
[0153]針對(duì)嵌入具有陰離子官能團(tuán)的嵌入劑的核酸實(shí)施電泳。
[0154](16).根據(jù)上述(14)或(15)所述的提取核酸的方法，其中，
[0155]通過(guò)混合樣品、具有通過(guò)脫水縮合的方式與包含于樣品中的物質(zhì)的羧基反應(yīng)的官能團(tuán)的化合物以及脫水縮合反應(yīng)的縮合劑，針對(duì)核酸實(shí)施電泳。
[0156]17.一種用于純化核酸的試劑盒，包括:
[0157]陽(yáng)離子交換樹(shù)脂；
[0158]陰離子交換樹(shù)脂；和
[0159]內(nèi)部盛有陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂并用于分布含核酸樣品的核酸純化儀器。
[0160]實(shí)施例
[0161]1.強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的吸附處理對(duì)核酸純化能力的影響
[0162]〈測(cè)試實(shí)施例1>
[0163]稱(chēng)量IOOmg強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(Nuvia S Na+型(由Bio-RadLaboratories, Inc.制造))并裝入旋轉(zhuǎn)過(guò)濾柱(spin filter column)(Ultrafree-MC, 0.45 μ m,由 Mi 11 ipore 制造)。然后，制備 50mM 的 MES 緩沖液(pH 為 5)(由Dojindo Molecular Technologies, Inc.制造)。向該緩沖液中加入 0.5 重量 ％ 的 BSA (由Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造)，并然后加入 5 μ M 的 Cy3 改性后的 20mer 寡聚DNA (由Sigma Aldrich C0.制造)。蛋白質(zhì)和核酸的混合液在常溫下充分?jǐn)嚢韬?將200 μ L的混合液逐滴加入裝有強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的旋轉(zhuǎn)柱并充分?jǐn)嚢?。然后，離心該混合液并在 12000G 下旋轉(zhuǎn) 2 分鐘。使用 NanoDrop D-1000 (由 Thermo Fisher Scientific Inc.制造)測(cè)量經(jīng)旋轉(zhuǎn)的混合液的吸光度。從強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的處理前后的吸光度之間的差異來(lái)評(píng)價(jià)核酸的純化能力。BSA的吸光度在蛋白質(zhì)A280模式下評(píng)價(jià)，而核酸的吸光度在微陣列模式下作為Cy3的吸光度來(lái)評(píng)價(jià)。此外，為了接近生物環(huán)境，向蛋白質(zhì)-核酸混合液中加入 0.09 重量 ％(最終濃度計(jì))的 NaCl (由 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造)。類(lèi)似地，實(shí)施由強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的處理。
[0164]評(píng)價(jià)結(jié)果在圖5中顯示。正如圖5中所示的，從經(jīng)強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂處理前后的Cy3寡聚DNA和BSA的濃度來(lái)看，含NaCl的核酸回收率為約100%，而不含NaCl的核酸的回收率為約72%。另一方面，含NaCl的BSA回收率為約20%，而不含NaCl的BSA回收率為約14%。這些結(jié)果揭示了通過(guò)實(shí)施強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的處理，能夠增加蛋白質(zhì)和核酸的混合系統(tǒng)中DNA的存在率(presence ratio)。
[0165]圖6顯示了由陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附處理外源物質(zhì)后的樣品的LAMP結(jié)果和未經(jīng)吸附處理的樣品的LAMP結(jié)果。通過(guò)混合樣品、酶、熒光染料、核酸單體、緩沖液、用于目標(biāo)核酸鏈擴(kuò)增的引物組和用于實(shí)時(shí)測(cè)量的探針。通過(guò)Loopamp的DNA擴(kuò)增試劑盒(由EikenChemical C0., Ltd.制造)和 Loopamp 的 RNA 擴(kuò)增試劑盒(由 Eiken Chemical C0., Ltd.制造)來(lái)測(cè)定每個(gè)濃度。反應(yīng)溫度為63°C。通過(guò)使用能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)量的熱循環(huán)儀Chromo4 (由BioRad，US制造)來(lái)測(cè)量LAMP反應(yīng)。I個(gè)循環(huán)設(shè)置成I分鐘。所使用的探針為是淬滅探針(quenching probe)的QP探針,從而能夠觀測(cè)核酸的擴(kuò)增和突光強(qiáng)度的降低。更多關(guān)于J_bio21的QP探針，參考2011年7月19日的名稱(chēng)為“QP方法”的日本網(wǎng)站http://www.j-bio21.c0.jp/tech/qpmethod.htm。如圖6中所示的，由離子交換樹(shù)脂吸附處理外源物質(zhì)后，檢測(cè)樣品上的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。和前面描述的一樣，實(shí)施如后面描述的LAMP反應(yīng)。
[0166]2.關(guān)于陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的反荷離子的考察
[0167]〈測(cè)試實(shí)施例2>
[0168]稱(chēng)量IOOmg 的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(Nuvia S Na+型(由 Bio-Rad Laboratories, Inc.制造))并裝入旋轉(zhuǎn)過(guò)濾柱(Ultrafree-MC, 0.45 μ m)。使上述的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(Nuvia S Na+型)流經(jīng)IM的HCl溶液并用純凈水洗滌至中性以制備陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(Nuvia S H+型)。稱(chēng)量IOOmg的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(Nuvia S H+型)并裝入旋轉(zhuǎn)過(guò)濾柱(Ultrafree-MC, 0.45 μ m)。然后，制備50mM的MES緩沖液(pH為5)。向該緩沖液中加入0.5重量％的BSA，并然后加入4 μ M的Cy3改性的20mer寡聚DNA。此外，加入0.09重量％的NaCl。各樣品在常溫下充分?jǐn)嚢韬螅瑢?00 μ L的各樣品逐滴加入填充N(xiāo)a+型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂或H+型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾柱并充分?jǐn)嚢?。然后，離心混合液并在12000G下旋轉(zhuǎn)2分鐘。評(píng)價(jià)各強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的核酸純化能力的結(jié)果和測(cè)試實(shí)施例1的相似。使用 Horiba 小型鈉離子計(jì)(Horiba Cardy Sodium Compact 1n Meter) (C-122)(由HORIBA Ltd.制造)測(cè)量Na+的濃度。使用便攜式pH計(jì)(由ISFETC0M C0.，Ltd.制造)測(cè)量pH。這些評(píng)價(jià)結(jié)果顯示在圖7中。這些評(píng)價(jià)結(jié)果的匯總顯示在表1中。
[0169][表 1]
[0170]
【權(quán)利要求】
1.一種純化核酸的方法，包括以下步驟: 用包含陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂的離子交換樹(shù)脂吸附含核酸的樣品中的物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化核酸的方法，其中， 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂包括第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂具有的排阻極限分子量小于第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的排阻極限分子量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的純化核酸的方法，其中， 物質(zhì)由第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附，并然后進(jìn)一步由陰離子交換樹(shù)脂和第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的純化核酸的方法，其中， 樣品從在上層包含第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和在下層包含陰離子交換樹(shù)脂和第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的柱子的上層側(cè)流入。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的純化核酸的方法，其中， 所述步驟是通過(guò)離子交換樹(shù)脂來(lái)吸附包含于樣品中的物質(zhì)，所述樣品用緩沖液稀釋?zhuān)揖彌_液具有4.0~8.0的pH。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的純化核酸的方法，其中， 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為強(qiáng)酸性陽(yáng)離`子交換樹(shù)脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的純化核酸的方法，其中， 第一陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的反荷離子為Na+。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的純化核酸的方法，其中， 第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的反荷離子為H+。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的純化核酸的方法，其中， 陰離子交換樹(shù)脂為強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的純化核酸的方法，其中， 陰離子交換樹(shù)脂的反荷離子為OH—。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的純化核酸的方法，其中， 陰離子交換樹(shù)脂比第二陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的離子交換容量的百分比為50~150%。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的純化核酸的方法，其中， 非離子表面活性劑和/或非離子親水性聚合物化合物用于吸附物質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的純化核酸的方法，其中， 物質(zhì)為包含至少蛋白質(zhì)和金屬鹽的外源物質(zhì)。
14.一種提取核酸的方法，包括以下步驟: 超聲處理含核酸的樣品； 用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂吸附包含于樣品中的物質(zhì)；以及 通過(guò)阻斷利用電泳遷移的核酸來(lái)濃縮核酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的提取核酸的方法，其中， 針對(duì)嵌入具有陰離子官能團(tuán)的嵌入劑的核酸實(shí)施電泳。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的提取核酸的方法，其中， 通過(guò)混合樣品、具有通過(guò)脫水縮合的方式與包含于樣品中的物質(zhì)的羧基反應(yīng)的官能團(tuán)的化合物以及脫水縮合反應(yīng)的縮合劑，針對(duì)核酸實(shí)施電泳。
17.一種用于純化核酸的試劑盒，包括: 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂； 陰離子交換樹(shù)脂；和 內(nèi)部盛有陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂并用于分布含核酸樣品的核酸純化儀器。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK103781907SQ201280043107
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2012年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月13日
【發(fā)明者】中村友彥, 坂本直久, 世取山翼, 伊東和峰 申請(qǐng)人:索尼公司