串珠鐮刀菌素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明為串珠鐮刀菌素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其檢測(cè)快速、靈敏、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便，適用于大批量樣品的檢測(cè)，為此本發(fā)明還提供了試劑盒的制備及檢測(cè)方法。其特征在于：包括包被板、串珠鐮刀菌素標(biāo)準(zhǔn)品、串珠鐮刀菌素單抗凍干品和酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體凍干品；檢測(cè)時(shí)取包被板，加入50μL的串珠鐮刀菌素標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品到微孔中，加50μL辣根過(guò)氧化物酶（HRP）-羊抗鼠抗體，加50μL抗串珠鐮刀菌素抗體，室溫下反應(yīng)30min，用洗滌液洗3次～5次，用吸水紙拍干，加50μL顯色液A和50μL顯色液B，暗處?kù)o置15分鐘后加終止液，在450nm處測(cè)其吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的串珠鐮刀菌素含量。
【專利說(shuō)明】串珠鐮刀菌素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及食品中有害殘留物質(zhì)的檢測(cè)方法，特別是一種串珠鐮刀菌素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的發(fā)明。
【背景技術(shù)】
[0002]串珠鐮刀菌素是某些鐮刀菌的代謝產(chǎn)物，因最初是由Cole等人于1973年自串珠鐮刀菌的培養(yǎng)物中提取出來(lái)的，而被命名為串珠鐮刀菌素串珠鐮刀菌素。該菌素為水溶性，對(duì)動(dòng)物各器官，特別對(duì)心血管有極強(qiáng)的毒性作用。串珠鐮刀菌的化學(xué)名為3，4_ 二酮-1-羥基環(huán)丁烯，自然界中以鈉鹽或鉀鹽的方式存在。它是淡黃色針狀結(jié)晶，具有水溶性。串珠鐮刀菌素的毒性很強(qiáng)，小雞經(jīng)口 LD5tl為4.0 mg/kg。急性中毒的大鼠可導(dǎo)致進(jìn)行性肌肉衰弱。呼吸困難，發(fā)紺，昏迷和死亡。有人認(rèn)為某些疾病與攝食玉米有關(guān)。該毒素的毒理作用是選擇性抑制氧化戊二酸鹽脫氫酶和丙酮酸鹽脫氫酶系統(tǒng)。Wilson等發(fā)現(xiàn)了串珠鐮刀菌素的肝毒性和致肝癌性。在食品和飼料中，串珠鐮刀菌素的檢測(cè)方法有薄層色譜法，氣象色譜法，氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)和高效液相色譜法。由于以上諸分析法樣品前處理比較復(fù)雜，操作時(shí)需專門(mén)的技術(shù)人員、檢測(cè)費(fèi)用昂貴，不利于推廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明為串珠鐮刀菌素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。其檢測(cè)快速、靈敏、準(zhǔn)確、可定量，操作簡(jiǎn)便，且對(duì)樣品純度要求不高，特異性強(qiáng)，特別適用于大批量樣品的檢測(cè)，為此，本發(fā)明還提供了專用試劑盒的制備及檢測(cè)方法。其特征在于:包有串珠鐮刀菌素固相抗原的包被板制備(包括串珠鐮刀菌素酶標(biāo)二抗，洗滌液，顯色液，終止液等的制備)，串珠鐮刀菌素單克隆抗體的制備。
[0004]串珠鐮刀菌素一牛血清白蛋白偶聯(lián)物的制備:將串珠鐮刀菌素溶解在3 mL-100mL吡啶中，加入羧甲基羥胺鹽酸鹽，室溫下攪拌過(guò)夜，氮?dú)獯蹈桑尤?0 mL-100 mL蒸餾水，用氫氧化鈉溶液調(diào)PH為8.5-9.5左右，再用二氯甲烷提取3次-5次，每次10 mL-20mL,棄去二氯甲烷，水層用鹽酸溶液調(diào)pH為2.5-3.5左右，再用二氯甲烷提取3次-6次，每次10 mL-20 mL，收集二氯甲烷，過(guò)無(wú)水硫酸鈉脫水，過(guò)濾，低溫用氮?dú)獯蹈?，得到串珠鐮刀菌素中間產(chǎn)物。取串珠鐮刀菌素中間產(chǎn)物，加入3 mL-50 mL 二氧六環(huán)，加入氯甲酸乙丁酯，5°C _12°C下攪拌反應(yīng)30分鐘-45分鐘，將反應(yīng)液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清白蛋白溶于5 mL-50 mL蒸餾水和5 mL-50 mL 二氧六環(huán)中，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH為8_9，50C _12°C下攪拌反應(yīng)5小時(shí)-6小時(shí)，然后，以蒸餾水進(jìn)行透析，換液3次-5次，冷凍干燥，偶聯(lián)物_20°C _40°C保存；上述反應(yīng)成分的比例為:串珠鐮刀菌素:羧甲基羥胺鹽酸鹽=(10-1000)mg:(10-2000)mg,串珠鐮刀菌素中間產(chǎn)物:氯甲酸乙丁酯:BSA = (10-1000)mg:(10-1000) μ L:( 10-3000) mg。
[0005]串珠鐮刀菌素一卵清蛋白偶聯(lián)物的制備:將串珠鐮刀菌素溶解在3 mL-100 mL吡啶中，加入羧甲基羥胺鹽酸鹽，室溫下攪拌過(guò)夜，氮?dú)獯蹈?，加?0 mL-100 mL蒸餾水，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH為8.5-9.5左右，再用二氯甲烷提取3次-5次，每次10 mL-20 mL,棄去二氯甲烷，水層用鹽酸溶液調(diào)PH為2.5-3.5左右，再用二氯甲烷提取3次-6次，每次10 mL-20 mL，收集二氯甲烷，過(guò)無(wú)水硫酸鈉脫水，過(guò)濾，低溫用氮?dú)獯蹈?，得到串珠鐮刀菌素中間產(chǎn)物；取串珠鐮刀菌素中間產(chǎn)物，加入3 mL-50 mL 二氧六環(huán)，加入氯甲酸乙丁酯，5°C -12°C下攪拌反應(yīng)30分鐘-45分鐘，將反應(yīng)液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清白蛋白溶于5 mL-50 mL蒸餾水和5 mL-50 mL 二氧六環(huán)中，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH為8_9，5°C - 12°C下攪拌反應(yīng)5小時(shí)-6小時(shí)，然后，以蒸餾水進(jìn)行透析，換液3次-5次，冷凍干燥，偶聯(lián)物_20°C _40°C保存；上述反應(yīng)成分的比例為:串珠鐮刀菌素:羧甲基羥胺鹽酸鹽=(10-1000)mg:(10-2000)mg,串珠鐮刀菌素中間產(chǎn)物:氯甲酸乙丁酯:0VA = (10-1000)mg:(10-1000) μ L:( 10-3000) mg。
[0006]所述抗串珠鐮刀菌素單克隆抗體及其溶液的制備:取串珠鐮刀菌素一牛血清白蛋白偶聯(lián)物用生理鹽水配成0.1 μ g/μ L抗原溶液，與等體積完全福氏佐劑混勻，充分乳化，供首次免疫用，加強(qiáng)免疫時(shí)用同量的不完全福氏佐劑代替完全福氏佐劑，首次免疫采用小鼠腹腔內(nèi)直接注射，免疫劑量為10 μ g/只-100 μ g/只小鼠，以后每隔2周-4周加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫采用尾靜脈注射，免疫劑量10 μ g/只-100 μ g/只，最后一次免疫采用脾內(nèi)注射，4天后取脾融合，將分離的免疫小鼠脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0以10:1比例混合，離心，去除上清，在50 s-90 s內(nèi)將0.1 mL-10 mL 50%聚乙二醇(分子量為1500)加至細(xì)胞中，充分混勻，使其融合，I分鐘-3分鐘后加入10 mL-50 mL DMEM培養(yǎng)液，終止融合，水浴靜止10分鐘-30分鐘后離心，去除上清；將融合細(xì)胞用含5-30%小牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基懸浮后，以最后濃度為I X IO4-1 X IO6飼養(yǎng)細(xì)胞接種于小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作飼養(yǎng)層的96孔培養(yǎng)板中，于5%-10% CO2, 350C _45°C條件下培養(yǎng)，5天-10天后，每培養(yǎng)孔更換 HT培養(yǎng)液。10天-20天后，開(kāi)始對(duì)鏡檢有雜交瘤克隆生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔，取上清液進(jìn)行篩選，對(duì)檢測(cè)結(jié)果。陽(yáng)性的細(xì)胞立即用有限稀釋法進(jìn)行克隆，雜交瘤篩選采用固相抗原間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法 進(jìn)行，以串珠鐮刀菌素一卵清蛋白偶聯(lián)物為包被抗原，以免疫小鼠的血清為陽(yáng)性對(duì)照，以SP2/o骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)的上清液為陰性對(duì)照；陽(yáng)性細(xì)胞孔的判定標(biāo)準(zhǔn)為(A試驗(yàn)-A空白)代A對(duì)照-A空白)>2.1 ;對(duì)分泌陽(yáng)性抗體的細(xì)胞進(jìn)行克??；采用有限稀釋法，將陽(yáng)性克隆細(xì)胞吹勻，取一滴至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，倒置顯微鏡下準(zhǔn)確計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)，稀釋為70個(gè)/mL，再取I mL稀釋20倍，接種入96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行亞克隆，直至所有細(xì)胞孔的培養(yǎng)上清均呈陽(yáng)性為止；對(duì)10周齡-13周齡BALB/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.3 mL/只-0.5 mL/只，8天-10天后，腹腔注射培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的雜交瘤細(xì)胞，5 X IO6細(xì)胞/只，5天后注意觀察，收集腹水，離心去除沉淀，加甘油于_20°C~_40°C保存；上述反應(yīng)成分的比例為:串珠鐮刀菌素一牛血清白蛋白偶聯(lián)物:生理鹽水=(10-1000) Ug:(0.1-10) mL。
[0007]酶標(biāo)板制備:
1、串珠鐮刀菌素固相抗原的包被板制作，包括包被原的制作、封閉液的配置、以及孵育。把包被原加入包被液用作固相抗原的包板制作。包被液:稱取1.6 g碳酸鈉加上2.9g碳酸氫鈉，加雙蒸水至1000 mL，調(diào)節(jié)pH至9.6。封閉液:稱取I g100 mL PBS緩沖液中。包板時(shí)每孔100 111^包板液，371:下孵育2 h，后取出洗板兩次，加封閉液，每孔180 yL，37°C下孵育1.5 h，取出甩干，加干燥劑2 - 8°C保存；
2、串珠鐮刀菌素的標(biāo)準(zhǔn)品由高標(biāo)稀釋而成，稀釋液為PBS緩沖液。0.1MPBS:1000mL 蒸餾水中 Nacl 9 g, Na2HPO4.1ffi2O 6 g，NaH2PO4.2H20 0.4 g , pH -J.2 ；
3、串珠鐮刀菌素的酶標(biāo)二抗的酶由辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記；
4、洗滌液的制備:十二水磷酸氫鈉68.8 g加磷酸二氫鈉6.9 g，氯化鈉45 g, Tween-20
0.5 mL,加雙蒸水至I L,調(diào)節(jié)pH至7.4 ;
5、顯色液的制備:顯色液A:無(wú)水乙酸鈉8.2 g, β-糊精2.5 g,過(guò)氧化氫脲428.6 mg,加雙蒸水至I L，調(diào)節(jié)PH至5.0，4°C保存，使用時(shí)達(dá)室溫。顯色液B:100 mg TMB溶于10 mLDMSO中，棕色瓶保存。使用時(shí)將14.6 mL顯色液A與0.45 mL顯色液B混合15分鐘；
6、終止液制備:2M硫酸，取I份濃硫酸加到8份去離子水中，即為2M硫酸。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0008]附圖1為本發(fā)明串珠鐮刀菌素標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度曲線示意圖。
具體實(shí)施方案
[0009]樣本前處理
處理前須知:
Ca)實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭；
(b)實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否潔凈，必須使用潔凈實(shí)驗(yàn)器具，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
(c)未處理的樣本冷凍保存；
Cd)處理后的樣本可在2-8°C避光保存24 h ;所有樣品應(yīng)于2-8°C避光保存。
[0010]前處理步驟:
1、玉米等糧食作物處理方法
(1)取3g粉碎樣品，加入30 mL樣品提取液(用去離子水將甲醇按7:3體積比進(jìn)行稀釋，即7份甲醇加3份去離子水，用于提取樣本中的串珠鐮刀菌素)；
(2)劇烈振蕩5min ；
(3)4000 r/min離心5 min,或用普通濾紙過(guò)濾；
(4)上清液或?yàn)V液用去離子水按1:19比例稀釋；取稀釋后液體待測(cè)。
[0011]2、飼料處理方法
(1)取3g粉碎樣品，加入30 mL樣品提取液(用去離子水將甲醇按7:3體積比進(jìn)行稀釋，即7份甲醇加3份去離子水，用于提取樣本中的串珠鐮刀菌素)；
(2)劇烈振蕩5min ；
(3)4000 r/min離心5 min,或用普通濾紙過(guò)濾；
(4)上清液或?yàn)V液用去離子水按1:49比例稀釋；取稀釋后液體待測(cè)。
[0012]測(cè)定步驟:
1、將所需試劑和微孔板從冷藏環(huán)境中取出，在室溫下平衡30min，每種液體使用前均須搖勻。注意標(biāo)準(zhǔn)液均需做2個(gè)平行試驗(yàn)；
2、加標(biāo)準(zhǔn)品:加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μ L到對(duì)應(yīng)的微孔中，再加入酶標(biāo)記物50 μ L/孔，然后再加入50 μ L/孔抗體工作液，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)30 min ；
3、洗板:小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加洗滌液250μ L/孔，每次浸泡15?30s，充分洗漆4?5次,用吸水紙拍干；
4、顯色:加入顯色A，B液各50μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境反應(yīng)15 min ；
5、測(cè)定:每孔各加50μ L終止液，設(shè)定酶標(biāo)儀在450 nm處，測(cè)定OD值(建議用450/630nm雙波長(zhǎng)檢測(cè),在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))；
6、結(jié)果分析
所測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)液或樣品吸光度的平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液(O標(biāo)準(zhǔn)液)的吸光度(B。)值再乘以100%，得到百分吸光度值，
百分吸光度值(％) = B/B0X100%
以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的10為底的對(duì)數(shù)為X軸，百分吸光值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將樣本的百分吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的值，為10的冪，乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中所含串珠鐮刀菌素的量。
【權(quán)利要求】
1.串珠鐮刀菌素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制備，包括洗滌液，顯色液，終止液；其特征在于:包有串珠鐮刀菌素固相抗原的包被板、串珠鐮刀菌素標(biāo)準(zhǔn)品，串珠鐮刀菌素單克隆抗體、串珠鐮刀菌素酶標(biāo)二抗。
2.串珠鐮刀菌素固相抗原的包被板制作，包括包被原的制作、封閉液的配置、以及孵育；把包被原加入包被液用作固相抗原的包板制作；包被液:稱取1.6 g碳酸鈉加上2.9 g碳酸氫鈉，加雙蒸水至1000 mL，調(diào)節(jié)pH至9.6 ;封閉液:稱取I g100 mL PBS緩沖液中；包板時(shí)每孔100 μ L包板液，37°C下孵育2 h,后取出洗板兩次,加封閉液,每孔180yL，37°C下孵育1.5 h，取出甩干，加干燥劑2 - 8°C保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)第一條所述，串珠鐮刀菌素的標(biāo)準(zhǔn)品由高標(biāo)稀釋而成，稀釋液為PBS 緩沖液；0.1M PBS:1000 mL 蒸餾水中加 NaCl 9g, Na2HPO4.12H20 6g，NaH2PO4.2H200.4g, PH:7.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)第一條所述，串珠鐮刀菌素的酶標(biāo)二抗的酶由辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)所述，串珠鐮刀菌素的檢測(cè)步驟如下:取包被板，加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 μ I到對(duì)應(yīng)的微孔中，再加入酶標(biāo)記物50 μ L/孔，然后再加入50 μ L/孔抗體工作液，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)30 min ;小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加洗滌液250 μ L /孔，每次浸泡15?30 S，充分洗滌4?5次，用吸水紙拍干；加入顯色Α,Β液50 μ L/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境反應(yīng)15 min ;每孔各加50 μ L終止液，設(shè)定酶標(biāo)儀在450 nm處，測(cè)定OD值(建議用450/630 nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))；從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算樣品中串珠鐮刀菌素的含量。
【文檔編號(hào)】G01N33/531GK103808920SQ201210436706
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月6日
【發(fā)明者】杜道林, 尚蘇林 申請(qǐng)人:江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司