專利名稱：以兩相酶生物傳感器實時監(jiān)測葡萄糖氧化酶活力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測氧化還原酶催化活性的方法。具體涉及到采用溶液中的葡萄糖氧化酶(GOx)和固定化的辣根過氧化物酶(HRP)所構(gòu)成的雙相酶生物傳感器對GOx酶的活力進(jìn)行不間斷監(jiān)測的工藝方法。
背景技術(shù)：
GOx酶多是從黑曲霉、青霉素、米曲霉等中提取，已廣泛用于食品加工和血糖的醫(yī)學(xué)測量。在食品工業(yè)中，GOx酶已普遍在牛奶、啤酒、水果、肉類等的去氧保鮮，以及蛋類和油炸食品的脫糖等領(lǐng)域得到了應(yīng)用。在血糖檢測中，葡萄糖傳感器就是將難以直接測定的葡萄糖進(jìn)行氧化，生成易于測定的02或!1202。O2可利用瓦勃呼吸儀進(jìn)行測量(第一代傳感器)，而H2O2可以通過在625nm下檢測H2O2與鄰聯(lián)甲苯胺的藍(lán)色生成物進(jìn)行測定。后來，用二茂鐵等電子媒介體代替了 O2 (第二代傳感器)，這不僅解決了溶液中溶解氧缺乏的問 題，也使其他電極代替鉬電極成為了可能。有學(xué)者將GOx酶和HRP酶同時固定在電極上設(shè)計出雙酶傳感器[劉海鷹，鄧家祺·分析化學(xué)1995，23 :154-158 ;Lomillo MAA et al.，Anal. Chim. Acta2005,547 :209-214 ；Delvauxa M et al. , Biosens.Bioelec. 2005, 20 1587-1594 ;李春香，曾云龍.分析科學(xué)學(xué)報 2006，22 :339-341 ;Vanesa Sanz V et al.，Biosens. Bioelec. 2007，22 :2876-2883 ;郭小麗等·物理化學(xué)學(xué)報 2007，23 :585-589 ;李于善等·化學(xué)世界2009，11 :657-664 ;林潔華等·中國科學(xué)B輯化學(xué)2008，38 :1011-1017 ;李峰等.中國科學(xué)B輯化學(xué)2009，39 :640-645]。將GOx酶催化產(chǎn)生的H2O2再經(jīng)HRP酶的催化進(jìn)一步還原成H2O,同時測量電信號。再后，有人嘗試采用直接電子傳遞法進(jìn)行測量(第三代傳感器)。作為一類重要的氧化還原酶，對GOx酶的活力測定和反應(yīng)動力學(xué)研究是生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品工業(yè)等領(lǐng)域必不可少的手段?，F(xiàn)有的GOx酶活性測定可分為氣壓法、化學(xué)滴定法和電極法。其中，氣壓法依據(jù)的是以瓦勃呼吸儀測量GOx酶催化葡萄糖氧化為葡萄糖酸時的耗氧量?；瘜W(xué)滴定法是用過量的氫氧化鈉滴定中和生成的葡萄糖酸，然后用鹽酸進(jìn)行反滴定。氧電極法則是用鉬電極的電化學(xué)信號測量H2O2的生成。檢測方法通常分為終態(tài)測量和連續(xù)測量。前者包括氣壓法、顯色法、液相色譜法、傳感器法等，在對糖尿病人的血糖檢測方面，當(dāng)前普遍使用的血糖儀亦是一種終態(tài)測量方法。這些檢測多是在催化反應(yīng)進(jìn)行一段時間后，通過蛋白質(zhì)變性、冷卻、稀釋等方法停止反應(yīng)，在反應(yīng)的終態(tài)對底物或產(chǎn)物進(jìn)行測量。它們不能對酶活性的實時變化進(jìn)行連續(xù)跟蹤；而后者包括紫外光譜、熒光光譜、動力學(xué)分析等方法，它們可以對酶活性進(jìn)行連續(xù)跟蹤。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是設(shè)計一種兩相雙酶傳感器。本發(fā)明的目的之二是為連續(xù)監(jiān)測葡萄糖氧化酶的活力提供一種實驗方法。
傳統(tǒng)的雙酶傳感器是GOx酶與HRP酶一同固定在電極上，目的是測定葡萄糖的濃度，而不是酶的活力。本發(fā)明所檢測的目標(biāo)則是溶液中的游離酶。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明將GOx酶溶解于電解液中；只將HRP酶固定在電極表面上，形成兩相酶體系。在該體系中，β -D-吡喃葡萄糖分子在GOx酶的催化下被溶液中的溶解氧氧化生成葡萄糖酸和Η202。H2O2進(jìn)一步被固定在電極上的HRP還原成H2O,而HRP則被氧化成兩種HRP中間體。氫醌分子將HRP氧化中間體重新還原 成HRP，自身氧化成苯醌。苯醌分子在負(fù)電極上得到電子重新還原為氫醌，而電極失去電子產(chǎn)生電流。這一連串的反應(yīng)的總體結(jié)果是，GOx酶催化葡萄糖分子氧化為葡萄糖酸，同時產(chǎn)生電流。電流能夠敏感地反映出氧化反應(yīng)的相對速率，并能夠通過反應(yīng)速率來計算酶催化活力。具體工藝如下電化學(xué)傳感器采用酶生物傳感器三電極系統(tǒng)將玻碳電極作為工作電極，鉬絲作為對電極，甘汞電極(SCE)作為參比電極(附圖I)。將HRP酶與牛血清白蛋白(BSA)混合并覆蓋在玻碳電極上，加入戊二醛使BSA交聯(lián)成膜。將酶修飾后的玻碳電極浸入到含有氫醌的電解液中，同時浸入對電極和參比電極。加入微量H2O2，使電化學(xué)工作站在-O. 4 O. 2V的電壓范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，以確定生物傳感器的還原峰值電壓，并在隨后進(jìn)行電流-時間曲線測定中施加這一電壓。在峰值電壓下，測定電流隨時間的變化，得到背景電流-時間曲線(計時安培線)。在溶液中，加入GOx酶和微量的β-D-吡喃葡萄糖后電流呈現(xiàn)出線性上升的趨勢(附圖2)，這說明酶催化反應(yīng)已經(jīng)開始。由于酶催化葡萄糖氧化過程中不斷生成H2O2，其生成的速率等于葡萄糖氧化的速率。而生成的H2O2在HRP酶的催化下將氫醌氧化為苯醌，苯醌可奪取電極上的電子而還原，這樣H2O2在電極表面的濃度正比于電子的流速(即電流)。電流上升的斜率反映了 H2O2濃度的增高。從H2O2濃度上升的速率可計算出葡萄糖氧化酶的活力。攪拌或旋轉(zhuǎn)圓盤電極可明顯改善傳感器體系的傳質(zhì)效應(yīng)，使電極擴(kuò)散層變薄。對流使H2O2分子更容易接近電極表面，電極表面的H2O2濃度更接近于本體濃度，從而使固定HRP酶的效率上升，輸出電流也隨之整體抬升。但傳質(zhì)的改善并不影響GOx酶的催化效率。在加入葡萄糖大約20s后，電流則以較慢的速率平穩(wěn)上升，在測試期間(特別是在反應(yīng)的初期)呈線性。在葡萄糖濃度O. 25、0. 5、0. 75、1和1.25mm0l/L下，斜率分別為-I. 013,-1. 97,-2. 845,-3. 825和-4. 484 μ A/s。它們代表了反應(yīng)的初速率，并且反映了酶在該底物濃度下的相對活力。傳感器電流⑴上升斜率的變化與β -D-吡喃葡萄糖的濃度[GOx]有關(guān)，它符合Michaelis-Menten方程。將附圖2的數(shù)據(jù)代入Lineweaver-Burk方程，擬合得到直線1/i=O. 24(±1· 79X10_3)/[G0x]+0. 028( + 3. 87X 1(Γ3)，相關(guān)系數(shù)為 O. 999，ρ < O. 0001，由此得到動力學(xué)常數(shù) imax = -O. 24/0. 028 = -3. 57 μ A 和 K111 = 1/0. 24 = 8. 57 X l(T3mol/L。如果標(biāo)定了在實際葡萄糖濃度下的傳感器電流，并繪制了標(biāo)準(zhǔn)校對曲線，即可將電流值換算成葡萄糖濃度，由此可換算成Michaelis常數(shù)Km和最大速率Vmax (轉(zhuǎn)換數(shù)keat)。值得注意的是傳質(zhì)會影響動力學(xué)電流的測量。但根據(jù)Levich方程，當(dāng)攪拌或電極的轉(zhuǎn)數(shù)恒定時，傳質(zhì)控制電流亦為定值，并不對動力學(xué)方程的形式產(chǎn)生影響。本發(fā)明所構(gòu)建的傳感器提供了一種新型的葡萄糖氧化酶活性檢測方法，特別適用于對酶動力學(xué)和酶機(jī)理的分析研究，并可對酶活性的變化進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測。本發(fā)明的優(yōu)點在于I.本發(fā)明所述的方法可用于酶活性檢測。為酶活性實驗，特別是為需要對酶活性進(jìn)行精密的，不間斷的監(jiān)測的研究和應(yīng)用領(lǐng)域提供了一種新的方法，同時為酶傳感器提供了一種新的應(yīng)用途徑。2.本發(fā)明所述的方法可對酶動力學(xué)、酶抑制和酶催化機(jī)理的研究提供一種實驗技術(shù)。特別適用于在外界刺激下酶活性的變化進(jìn)行實時跟蹤。3.本發(fā)明所述的方法也可用于微量葡萄糖濃度的測量，為發(fā)展能夠?qū)ρ沁M(jìn)行連續(xù)測量的儀器提供了一種可借鑒的途徑。


圖I是兩相酶傳感器結(jié)構(gòu)示意圖。GOx為葡萄糖氧化酶，HRP為辣根過氧化物酶。圖2描繪了在不同葡萄糖濃度下電流隨時間變化的曲線。在HRP傳感器中，向電解液中加入葡萄糖氧化酶，并分別在不同的測量體系中加入β -D-吡喃葡萄糖，使葡萄糖的濃度分別為O. 25,0. 5,0. 75、I. O和I. 25mmol/L，得到5條以不同斜率上升的計時安培線。
具體實施方式
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實施例I :在修飾前，用砂布上覆蓋O. 05mm的氧化鋁糊漿對玻碳電極的表面進(jìn)行打磨拋光，隨后分別用丙酮、50% NaOH溶液、50%硝酸、雙蒸水對玻碳電極進(jìn)行超聲清洗，室溫干燥。將2. 5mg300U/mL HRP 和 4mg BSA 溶于 O. 2mL 的磷酸鹽緩沖液(O. 05mol/L, pH 值7.0)中形成混合液。然后將20 μ L的混合液滴加到玻碳電極表面。再將電極置于一個含有25%戊二醛蒸汽的封閉的容器內(nèi)進(jìn)行交聯(lián)4h，室溫干燥lh，在4°C下儲藏待用。實施例2 用電化學(xué)工作站(ChemLab-IO)和一套常規(guī)的三電極系統(tǒng)進(jìn)行循環(huán)伏安實驗。其中，以修飾過的玻碳電極作為工作電極；鉬絲作為對電極；飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極；PBS(0. 05mol/L, pH值7· O)作為支持電解液。循環(huán)伏安實驗的電勢掃描范圍(相對于SCE)為-0.4 0.2V，掃描速率100mV/s。實驗在室溫下進(jìn)行。實施例3 考察底物影響的實驗在盛有IOmL支持電解液的反應(yīng)池中進(jìn)行。在攪拌或旋轉(zhuǎn)圓盤電極作用下，加入O. 2mg/L的GOx (EC1. I. 3. 4，35U/mg，來自黑曲霉)和lmmol/L氫醌，在-O. 25V電壓下記錄初始電流的基線。待基線平穩(wěn)后(約50s后)，分別加入濃度為O. 25、
O.5、0. 75、I和I. 25mmol/L的β -D-吡喃葡萄糖溶液，分別得到呈逐漸上升趨勢的電流_時間曲線。實施例4 求出在反應(yīng)初期給定葡萄糖濃度下電流-時間曲線上升的斜率。將不同葡萄糖濃度下的斜率代入Lineweaver-Burk方程，即可求出常數(shù)imax和Km。如果標(biāo)定了在實際葡萄糖濃度下的傳感器電流，即可將電流值換算成葡萄糖濃度。
權(quán)利要求
1.一種檢測葡萄糖氧化酶活力的工藝方法，其特征在于所述的工藝方法是采用電化學(xué)傳感器通過連續(xù)測量葡萄糖氧化反應(yīng)的速率來獲得葡萄糖氧化酶活力的。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種檢測葡萄糖氧化酶活力的工藝方法，其特征在于電化學(xué)酶傳感器是一種兩相酶體系；葡萄糖氧化酶溶解在溶液中，而辣根過氧化物酶固定在電極表面上。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種檢測葡萄糖氧化酶活力的工藝方法，其特征在于辣根過氧化物酶是通過牛血清白蛋白與戊二醛的交聯(lián)固定在電極表面上的。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種檢測葡萄糖氧化酶活力的工藝方法，其特征在于溶液中含有作為底物的β-D-吡喃葡萄糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種檢測葡萄糖氧化酶活力的工藝方法，其特征在于溶液中含有作為電子媒介體的氫醌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種電化學(xué)測量葡萄糖氧化酶(GOx)催化活性的工藝方法。所述的工藝方法是構(gòu)建一種兩相酶電化學(xué)傳感器通過對H2O2濃度的不間斷測量來實現(xiàn)的，而H2O2濃度的連續(xù)上升則來源于葡萄糖在GOx酶催化下的氧化反應(yīng)。體系中GOx酶溶解在電解液中，辣根過氧化物酶(HRP)固定在電極上。溶液中的GOx酶將葡萄糖氧化為葡萄糖酸同時生成H2O2。HRP酶則催化氫醌將擴(kuò)散到電極表面的H2O2還原，而被氧化的氫醌在電極上獲取電子而產(chǎn)生電流。在這一反應(yīng)序列中，傳感器的輸出電流與葡萄糖和H2O2的濃度有著化學(xué)計量關(guān)系，由此可計算出GOx酶的活力。此方法可作為GOx酶活力檢測的一種新手段具有靈敏、簡便和設(shè)備成本低的特點。
文檔編號G01N27/48GK102901767SQ20121040760
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月24日
發(fā)明者黃積濤, 黃薇, 宮澤, 李敏 申請人:南開大學(xué)