缺血修飾白蛋白組合測(cè)定試劑、測(cè)定方法及試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】缺血修飾白蛋白組合測(cè)定試劑、測(cè)定方法及試劑盒，其組合測(cè)定試劑包括試劑1：包括10～500mg/100m1氯化鈷溶液、pH7.0～8.0為鹽酸三乙醇胺緩沖液；試劑2：二硫蘇糖醇0.01～2%的水溶液；試劑3：0.25～3.5mg/m1DTT顯色劑；試劑盒包括盒體，所述盒體內(nèi)部具有用以盛裝檢測(cè)試劑的腔體，所述盒體具有檢測(cè)試劑出口，且所述出口設(shè)置有封蓋，所述盒體的外壁設(shè)置有隔熱層。本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果較之傳統(tǒng)技術(shù)更加準(zhǔn)確。
【專(zhuān)利說(shuō)明】缺血修飾白蛋白組合測(cè)定試劑、測(cè)定方法及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種缺血修飾白蛋白組合測(cè)定試劑及利用其對(duì)缺血修飾白蛋白的測(cè)定方法，以及盛裝所述試劑的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]缺血修飾白蛋白(Ischemia-modified albumin,簡(jiǎn)稱(chēng)IMA)是指在臨床缺血或再灌注醫(yī)療手段發(fā)生時(shí)，由于自由基等破壞了血清白蛋白的氨基酸序列而導(dǎo)致白蛋白與過(guò)渡金屬的結(jié)合能力改變，這種因缺血而發(fā)生與過(guò)渡金屬結(jié)合能力改變的白蛋白稱(chēng)為缺血修飾白蛋白。
[0003]人血清白蛋白(Human serum albumin簡(jiǎn)稱(chēng)HSA)是一種循環(huán)蛋白，由585個(gè)氨基酸序列(66500Da)組成,其氨基末端(N-terminus)是人類(lèi)所特有的一段序列。己有研究證實(shí)HSA的氨基末端即為過(guò)渡金屬鈷、銅和鎳等離子的結(jié)合位點(diǎn)。HSA上這些金屬的結(jié)合點(diǎn)、位點(diǎn)與其他動(dòng)物的白蛋白相比容易被生物化學(xué)因素降解而破壞。當(dāng)發(fā)生缺血時(shí)，細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外氧供給減少、酸性代謝產(chǎn)物增多、細(xì)胞膜能量依賴(lài)的鈉泵破壞、鈣泵失控，這些因素將導(dǎo)致HSA氨基末端結(jié)構(gòu)改變，使HSA與金屬的結(jié)合能力降低。短暫缺血后發(fā)生的再灌注會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，同時(shí)游離銅離子和鐵離子暴露，將進(jìn)一步加重HSA這種改變，這是機(jī)體“犧牲”白蛋白以對(duì)抗缺氧、避免和盡量減少組織損傷的一種機(jī)制。
[0004]美國(guó)Bar-Or D (以下簡(jiǎn)稱(chēng)Bar-Or D方法)等發(fā)明了 IMA的快速檢測(cè)方法和試劑盒。該發(fā)明的基本原理為:正常對(duì)照組的血清樣品中白蛋白以活性形式存在，加入過(guò)度已知量的鈷離子溶液后，鈷離子即可與白蛋白結(jié)合，溶液中未結(jié)合鈷離子濃度較低；而心肌缺血病人的血清樣品中含有較多缺血性修飾白蛋白，加入同樣濃度鈷離子溶液后，由于IMA與鈷離子結(jié)合的能力弱，溶液中存在較高濃度的未結(jié)合鈷離子，未結(jié)合鈷離子與顯色劑發(fā)生顏色反應(yīng)后，采用分光光度比
色儀在450-500nm處檢測(cè)樣品吸光度，所得數(shù)據(jù)與一已知標(biāo)準(zhǔn)IMA曲線(xiàn)進(jìn)行對(duì)照，即可得出IMA值，其測(cè)定值用每毫升單位(U/ml )表示。具體測(cè)試步驟如下:在被測(cè)血清中加入過(guò)度已知量的鈷離子溶液形成混合液，搖勻在18-37°C溫育至少4-5分鐘，反應(yīng)pH7-9較佳；將二硫蘇糖醇(1，4-Dithiothreitol,簡(jiǎn)稱(chēng)DTT)顯色劑與上述混合液搖勻反應(yīng),隨后加入氯化鈉溶液，采用全自動(dòng)生化分析儀，在450-500nm處檢測(cè)樣品吸光度，所得OD值與一個(gè)已知標(biāo)準(zhǔn)的IMA動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)進(jìn)行對(duì)照，即可得到IMA值，其測(cè)定值用每毫升單位(U/ml)表不。
[0005]雖然IMA的檢測(cè)在診斷心肌缺血方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但是目前上述已有技術(shù)的缺血性修飾白蛋白的檢測(cè)方法明顯存在下列的不足，嚴(yán)重影響了臨床的進(jìn)一步推廣使用:
1.已有技術(shù)IMA試劑盒及檢側(cè)方法不能在中小型生化分析儀或分光光度儀上使用目前美國(guó)Inverness公司銷(xiāo)售的IMA檢測(cè)試劑盒只能在極少數(shù)幾種日立和羅士型號(hào)的全自動(dòng)生化儀上使用，而這幾種型號(hào)的全自動(dòng)生化儀在我國(guó)醫(yī)院中沒(méi)有。一般來(lái)說(shuō)，只要有上機(jī)參數(shù)，生化試劑盒就應(yīng)能在各個(gè)廠牌的全自動(dòng)生化儀上使用，已有技術(shù)不能在一般生化儀上使用可能的原因是其IMA試劑盒檢測(cè)的IMA陰陽(yáng)性O(shè)D值沒(méi)有很明顯的差異，信號(hào)太弱需要特別放大。由于手工分光光度儀上或中小型生化分析儀不能將微小的光電信號(hào)差別進(jìn)行成一千上萬(wàn)倍的有效
放大，不適合使用。而我國(guó)醫(yī)院的急診化驗(yàn)室一般不配備大型生化分析儀，但ACS都為急診病人，這為IMA指標(biāo)在臨床快速診斷心肌缺血方面推廣使用形成了障礙。
[0006]2.已有技術(shù)IMA動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)OD值很小的變動(dòng)就可使IMA值在很大的范圍內(nèi)變動(dòng) 根據(jù)Bar-Or D方法IMA動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，橫座標(biāo)OD值從陰性低值到陽(yáng)性高值只在小于0.3
范圍內(nèi)變動(dòng)，而縱座標(biāo)IMA值在200左右單位的大范圍內(nèi)變動(dòng)，就是說(shuō)OD值輕微變動(dòng)，會(huì)引起IMA值很大的變化，這樣，IMA陰性高值樣品很容易變成陽(yáng)性，IMA陽(yáng)性低值樣品很可能被高估，這種變化可能是由系統(tǒng)誤差引起的，并不一定是由樣品本身內(nèi)在差異所引起，從而會(huì)造成病人缺血性狀況的高估或低估，會(huì)使臨床判斷造成錯(cuò)誤。
[0007]3.己有技術(shù)試劑盒及檢測(cè)方法特異性不高
已有技術(shù)試劑盒檢測(cè)IMA的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(Positive Predictive Value,簡(jiǎn)稱(chēng)PPV)較低，主要是IMA陰性樣品OD值非特異性升高，當(dāng)背景干擾足夠大時(shí)就可使IMA陰性結(jié)果超過(guò)臨界值變成IMA假陽(yáng)性，使得IMA的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較低，某種程度上降低了 IMA在臨床上的使用價(jià)值。
[0008]綜上所述，急性冠狀動(dòng)脈綜合癥病情險(xiǎn)惡，IMA是早期缺血的理想?yún)⒖贾笜?biāo)，但已有技術(shù)試劑盒及檢測(cè)方法上的不足又限止了其進(jìn)一步推廣使用，因此迫切需要開(kāi)發(fā)一種檢測(cè)IMA的試劑盒并通過(guò)去除背景干擾，特別是能降低IMA陰性樣品的OD值從而能提高IMA的特異性；需要一種不會(huì)由于OD值微小變化就使IMA值產(chǎn)生較大變化的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)；需要一種能滿(mǎn)足普遍的中小型自 動(dòng)生化分析儀甚至一般分光光度儀手工檢測(cè)IMA的試劑盒；一種床邊快速試劑以滿(mǎn)足臨床ACS診斷急切、簡(jiǎn)便和正確的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種缺血修飾白蛋白組合測(cè)定試劑及測(cè)定方法，從而解決上述【背景技術(shù)】中的問(wèn)題。
[0010]本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
一種缺血修飾白蛋白組合測(cè)定試劑，包括
試劑I
包括10~500mg/100ml氯化鈷溶液、pH7.0~8.0為鹽酸三乙醇胺緩沖液；
試劑2
二硫蘇糖醇0.01~2%的水溶液；
試劑3
0.25 ~3.5mg/mlDTT 顯色劑。
[0011]一種缺血修飾白蛋白測(cè)定方法，其特征在于，包括如下步驟:
(1)配制試劑I，在波長(zhǎng)取值范圍在34(T700nm的生化分析儀或分光光度計(jì)下，將試劑I與病人生物樣品混合，在18-37°C孵育5分鐘，成第一混合液，然后在上述波長(zhǎng)范圍之波長(zhǎng)下比色，讀取第一混合液光密度Al ；
(2)使用離心超濾、免疫磁珠、親和層析柱、免疫層析膜或免疫滲濾膜分離，從混合液中分離去除背景干擾物質(zhì)，得第二混合液；
(3)配制試劑2，在波長(zhǎng)取值范圍在34(T700nm的生化分析儀或分光光度計(jì)下，將20~400μ1的試劑2加入至步驟(2)所述的第二混合液中，反應(yīng)5分鐘，得到第三混合液，然后再在上述波長(zhǎng)范圍之波長(zhǎng)下比色，讀取第三混合液的光密度Α2 ；
(4)依據(jù)Al、Α2，按下述計(jì)算式計(jì)算測(cè)定第一結(jié)果:
【權(quán)利要求】
1.一種缺血修飾白蛋白組合測(cè)定試劑，其特征在于:包括 試劑I 包括10~500mg/100ml氯化鈷溶液、pH7.0~8.0為鹽酸三乙醇胺緩沖液； 試劑2 二硫蘇糖醇0.01~2%的水溶液； 試劑3
0.25 ~3.5mg/mlDTT 顯色劑。
2.如權(quán)利要求1所述組合測(cè)定試劑對(duì)缺血修飾白蛋白測(cè)定方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)配制試劑1，在波長(zhǎng)取值范圍在34(T700nm的生化分析儀或分光光度計(jì)下，將試劑I與病人生物樣品混合，在18-37°C孵育5分鐘，成第一混合液，然后在上述波長(zhǎng)范圍之波長(zhǎng)下比色，讀取第一混合液光密度Al ； (2)使用離心超濾、免疫磁珠、親和層析柱、免疫層析膜或免疫滲濾膜分離，從混合液中分離去除背景干擾物質(zhì)，得第二混合液； (3)配制試劑2，在波長(zhǎng)取值范圍在34(T700nm的生化分析儀或分光光度計(jì)下，將20~400μ1的試劑2加入至步驟(2)所述的第二混合液中，反應(yīng)5分鐘，得到第三混合液，然后再在上述波長(zhǎng)范圍之波長(zhǎng)下比色，讀取第三混合液的光密度Α2 ； (4)依據(jù)Al、Α2，按下述計(jì)算式計(jì)算測(cè)定第一結(jié)果:
3.—種盛裝如權(quán)利要求1所述組合測(cè)定試劑的試劑盒，其特征在于:包括盒體，所述盒體內(nèi)部具有用以盛裝檢測(cè)試劑的腔體，所述盒體具有檢測(cè)試劑出口，且所述出口設(shè)置有封蓋，所述盒體的外壁設(shè)置有隔熱層。
4.一種盛裝如權(quán)利要求3所述組合測(cè)定試劑的試劑盒，其特征在于:所述隔熱層包括內(nèi)層泡沫板和外層隔熱板。
5.一種盛裝如權(quán)利要求4所述組合測(cè)定試劑的試劑盒，其特征在于:所述外層隔熱板內(nèi)部為真空腔體。
【文檔編號(hào)】G01N21/78GK103674938SQ201210331744
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月10日
【發(fā)明者】蔣洪敏, 吳白平, 卿子駒, 張衛(wèi)華, 鄧君虎 申請(qǐng)人:長(zhǎng)沙頤康科技開(kāi)發(fā)有限公司