一種利用細(xì)菌全細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)銅濃度的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于銅離子濃度檢測(cè)的惡臭假單胞菌生物傳感器，以及利用所述生物傳感器定量檢測(cè)水溶液中銅離子濃度的方法。所述生物傳感器采用熒光蛋白所發(fā)熒光作為檢測(cè)信號(hào)，采用銅特異性操縱子（啟動(dòng)子）序列調(diào)控?zé)晒獾鞍椎谋磉_(dá)，將銅離子濃度信號(hào)轉(zhuǎn)化為熒光強(qiáng)度信號(hào)，通過對(duì)熒光蛋白熒光強(qiáng)度的檢測(cè)達(dá)到檢測(cè)銅離子濃度的目的。
【專利說明】—種利用細(xì)菌全細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)銅濃度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物監(jiān)測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種利用細(xì)菌全細(xì)胞生物傳感器定量檢測(cè)水溶液中銅離子濃度的技術(shù)。【背景技術(shù)】
[0002]隨著市現(xiàn)代工業(yè)的高速發(fā)展，采礦、電鍍、印刷電路板等行業(yè)中產(chǎn)生大量的含銅廢水，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染。水溶液中銅離子濃度的儀器檢測(cè)方法包括原子吸收法、等離子發(fā)射光譜法、電化學(xué)極譜法、和分光光度法等，以上方法具有成本高、操作繁瑣、耗時(shí)長等缺點(diǎn)。因此，開發(fā)成本低、操作簡(jiǎn)便、快速的定量檢測(cè)銅的方法是一個(gè)關(guān)鍵問題。
[0003]與傳統(tǒng)的儀器分析方法相比，生物傳感器具有以下特點(diǎn):1)體積小、響應(yīng)快、準(zhǔn)確度高，可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)在線檢測(cè)；2)—般不需進(jìn)行樣品的預(yù)處理，可將樣品中被測(cè)組分的分離和檢測(cè)統(tǒng)一為一體，使整個(gè)測(cè)定過程簡(jiǎn)便迅速，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)分析；3)可進(jìn)行活體分析；4)成本遠(yuǎn)低于大型分析儀器，便于推廣普及。
[0004]細(xì)菌在獲取生長所需金屬的同時(shí)，面臨著被高濃度金屬所毒害的威脅。細(xì)菌的重金屬抵抗(Heavy metal resistance,HER)系統(tǒng)負(fù)責(zé)對(duì)這些有害金屬進(jìn)行排除或解毒。細(xì)菌面對(duì)胞內(nèi)條件變化而執(zhí)行適當(dāng)細(xì)胞應(yīng)答的關(guān)鍵機(jī)制是對(duì)轉(zhuǎn)錄起始的控制。許多細(xì)菌持有特定金屬離子調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。結(jié)合特定金屬的蛋白識(shí)別并結(jié)合啟動(dòng)子當(dāng)中或附近的特定DNA序列,MerR家族蛋白就是這種轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白之一。MerR家族蛋白中，CueR蛋白能夠特異性識(shí)別銅離子，并在銅離子誘導(dǎo)的情況下調(diào)控相應(yīng)銅抵抗基因的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明以CueR調(diào)控系統(tǒng)為基礎(chǔ)，構(gòu)建惡全細(xì)胞生物傳感器，達(dá)到檢測(cè)銅濃度的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]提供一種用于銅離子濃度檢測(cè)的細(xì)菌全細(xì)胞生物傳感器，以及利用所述生物傳感器定量檢測(cè)水溶液中銅離子濃度的方法。
[0006]所述生物傳感器采用綠色熒光蛋白(或其他易于檢測(cè)的熒光蛋白)所發(fā)熒光作為檢測(cè)信號(hào)。
[0007]所述生物傳感器采用銅特異性操縱子(啟動(dòng)子)序列調(diào)控綠色熒光蛋白的表達(dá)，將銅離子濃度信號(hào)轉(zhuǎn)化為熒光強(qiáng)度信號(hào)，通過對(duì)綠色熒光蛋白熒光強(qiáng)度的檢測(cè)達(dá)到檢測(cè)銅離子濃度的目的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1是質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；
圖2是本發(fā)明實(shí)施例中測(cè)得的熒光強(qiáng)度隨銅離子濃度變化曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0009]本發(fā)明所用宿主菌包括但不限于惡臭假單胞菌，以下實(shí)施例中，宿主菌為惡臭假單胞菌:
生物傳感器的制備:
利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，以具有銅特異性操縱子序列(見核苷酸或氨基酸序列表)的細(xì)菌基因組DNA為模板，擴(kuò)展所述操縱子(啟動(dòng)子)序列，將所述操縱子(啟動(dòng)子)序列和綠色熒光蛋白編碼基因構(gòu)建入表達(dá)質(zhì)粒，使得操縱子序列位于綠色熒光蛋白編碼基因上游(見圖1)。
[0010]所述操縱子(啟動(dòng)子)序列和綠色熒光蛋白編碼基因序列除用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法獲得外，還可用人工化學(xué)合成以及其他該領(lǐng)域技術(shù)人員所常用的方法。
[0011]將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒按如下方法轉(zhuǎn)化入惡臭假單胞菌:
1)取生長良好的對(duì)數(shù)期惡臭假單胞菌菌液，4°C條件下3000Xg離心5分鐘，棄上清；
2)用1/2體積的預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸，4°C條件下3000 Xg離心5分鐘，棄上清；
3)用1/10體積的含20%甘油的0.1M CaCl2重懸菌體，制成惡臭假單胞菌感受態(tài)細(xì)胞；
4)取質(zhì)粒0.1-0.g加入到100 ill感受態(tài)細(xì)胞，混勻，冰置I小時(shí)(多余的感受態(tài)細(xì)胞可放置-80°C凍存)；
5)42°C水浴熱激2分鐘；
6)冰置2分鐘；
7)加入900ill無菌LB培養(yǎng)基(1% NaCl，1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物)，30 °C溫浴60-90分鐘；`
8)取100-200u I菌液均勻涂布于選擇性LB平板。
[0012]上述實(shí)施例所用宿主菌惡臭假單胞菌中含有CueR蛋白的編碼基因，若所用宿主菌中無CueR蛋白的編碼基因，則還應(yīng)將含有CueR蛋白編碼基因的多核苷酸序列構(gòu)建入與上述表達(dá)質(zhì)粒相同或相異的質(zhì)粒中(或插入到宿主菌的基因組中)，使宿主菌能夠產(chǎn)生具有生物活性的CueR蛋白。
[0013]銅離子濃度檢測(cè)方法如下:
1)取轉(zhuǎn)化所述質(zhì)粒的惡臭假單胞菌單菌落，接種于含有30-50mg/l卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基；
2)取對(duì)數(shù)期菌液(OD6tltl= 0.5-1.0)，4°C條件下3000Xg離心5分鐘后棄上清，使用相同體積的含有銅離子的LB培養(yǎng)基重懸,30°C條件下振蕩培養(yǎng)2小時(shí)；
3)4°C條件下3000Xg離心5分鐘后棄上清，使用1/2體積的PBS (137 mM NaCl, 2.7mM KCl，10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4)重懸；
4)取IOOiU菌液加入到酶標(biāo)板中，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各菌液的熒光強(qiáng)度。
[0014]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于銅離子濃度檢測(cè)的細(xì)菌全細(xì)胞生物傳感器，以及利用所述生物傳感器定量檢測(cè)水溶液中銅離子濃度的方法。
2.一種鎘離子誘導(dǎo)的熒光蛋白報(bào)告系統(tǒng)，其特征在于，采用基于銅特異性操縱子(啟動(dòng)子)多核苷酸序列(SEQ ID NO:1)及CueR蛋白(SEQ ID NO: 2)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控?zé)晒獾鞍谆虻霓D(zhuǎn)錄，將銅離子濃度信號(hào)轉(zhuǎn)化為熒光強(qiáng)度信號(hào)。
3.如權(quán)利要求2所述熒光蛋白，其特征在于，包括但不限于綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白和青色熒光蛋白等。
4.一種宿主細(xì)菌，其特征在于，包含權(quán)利要求2所述的報(bào)告系統(tǒng)并能夠正常轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將熒光蛋白所發(fā)的熒光強(qiáng)度和銅離子濃度制成工作曲線，從而通過 檢測(cè)熒光強(qiáng)度達(dá)到檢測(cè)銅離子濃度的目的。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103627666SQ201210309671
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2012年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月28日
【發(fā)明者】李鵬松, 陶虎春, 彭智文, 蘇捷, 于太安 申請(qǐng)人:北京大學(xué)深圳研究生院