專利名稱：一種測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種醫(yī)藥試劑，具體的說(shuō)是ー種測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的試劑。
背景技術(shù)：
由于血液中的糖化血紅蛋白反映了生物中血糖值過(guò)去的情況，因此被作為糖尿病的診斷和治療的重要指標(biāo)。對(duì)于檢測(cè)糖化血紅蛋白，例如HPLC、電泳法、免疫法等。但是對(duì)于上述的HPLC法、電泳法，需要專用的儀器設(shè)備，檢測(cè)成本高昂，目前對(duì)于我國(guó)普及面不大，對(duì)于上述的免疫法等，成本雖然比較低，但是存在準(zhǔn)確度和靈敏度低的缺點(diǎn)。因此，對(duì)于測(cè)定糖化血紅蛋白，酶法具備了不需要專用的儀器，檢測(cè)成本低，且通過(guò)特異性蛋白酶對(duì)糖化血紅蛋白切斷為糖化多肽及糖化氨基酸，并通過(guò)特異性的氧化還原反應(yīng)進(jìn)行顯色測(cè)定，因此準(zhǔn)確度及靈敏度都較高，穩(wěn)定性能較好。
采用的酶法測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的方法，即首先，蛋白酶作用于糖化血紅蛋白，通過(guò)切下含β鏈N基末端的糖化纈氨酸或糖化多肽片段，在通過(guò)果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)作用于上述切斷的糖化片段，產(chǎn)生過(guò)氧化氫。通過(guò)過(guò)氧化物酶的氧化作用和顯色劑的顯色反應(yīng)得到的過(guò)氧化氫的量與上述糖化血紅蛋白的百分比成正比例關(guān)系。目前測(cè)定糖化血紅蛋白百分比用的比較多的方法是在雙通道測(cè)定糖化血紅蛋白百分比，即反應(yīng)分兩步進(jìn)行，第一歩反應(yīng)是測(cè)定樣本中的總血紅蛋白的量，第二步反應(yīng)是測(cè)定樣本中糖化血紅蛋白的量，最后得到兩步反應(yīng)后數(shù)值的比值，即糖化血紅蛋白的百分比，這種形式對(duì)于儀器需要占用兩個(gè)通道，這樣的方法對(duì)于醫(yī)院的應(yīng)用帶來(lái)了很多的不便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的試劑。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明設(shè)計(jì)了ー種測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的試劑，其特征在干由以下物質(zhì)組成，(a)從血液樣品中的紅細(xì)胞釋放血紅蛋白的溶解緩沖劑；(b)能夠切斷糖化血紅蛋白β鏈N基末端的糖化纈氨酸或糖化多肽片段的蛋白酶；(C)能夠氧化并消除樣本中干擾物質(zhì)的氧化劑；(d)能夠?qū)⒀t蛋白變性并且能夠加快蛋白酶反應(yīng)速率的氧化劑；(e)能夠加快蛋白酶反應(yīng)速率的加速反應(yīng)劑；(f )與物質(zhì)a中能夠切斷糖化血紅蛋白β鏈N基末端的糖化纈氨酸或糖化多肽片段進(jìn)行氧化還原反應(yīng)的果糖基氨基酸氧化酶；(g)能夠與產(chǎn)生的過(guò)氧化氫發(fā)生顯色反應(yīng)的顯色劑；(h)能夠催化過(guò)氧化氫和顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)的過(guò)氧化物酶。所述物質(zhì)a中的緩沖劑為TritonX-100、Tween_20、Brij35中的ー種；添加的濃度為O. 1%-1%的重量，室溫下靜置3-10分鐘即可溶血完全。
所述物質(zhì)b中的蛋白酶為木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K、豬胰蛋白酶、氨肽酶、嗜熱菌蛋白酶、蛋白酶E、中性蛋白酶、弾性蛋白酶中的ー種；蛋白酶的濃度范圍為100-5000KU/L。所述物質(zhì)c中的氧化劑是戴斯馬丁氧化劑或者高碘酸鈉，其濃度范圍為O. 5~1 Ommol/I,η
所述的物質(zhì)d中的氧化劑為四唑鎗鹽。所述的四唑鎗鹽是2- (4-碘苯基)-3- (4-硝基苯基)-5- (2，4_ ニ磺酸苯基)-2H-四唑鹽、2- (4-碘苯基)-3- (2，4-ニ硝基苯基)-5- (2，4-ニ磺酸苯基)-2H-四唑鹽、2- (2-甲氧基-4-硝基苯基)-3- (4-硝基苯基)-5- (2，4-ニ磺酸苯基)-2H-四唑鹽、2- (4-碘苯基)-3- (4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鹽、2，5-ニ苯基-3-(間甲苯基)四唑鹽、2，5-ニ苯基-3-(對(duì)甲苯基)四唑鹽、2，3-ニ苯基-5- (2-噻吩基)四唑鹽、鐵氰化鉀、碘酸鉀。其中優(yōu)選2- (4-碘苯基)-3- (4-硝基苯基)-5- (2，4-ニ磺酸苯基)-2H-四唑鹽、2- (4-碘苯基)-3- (2，4-ニ硝基苯基)-5- (2，4-ニ磺酸苯基)-2H-四唑鹽中的一種，其濃度范圍為O. 05-10mmol/Lo所述物質(zhì)e中的加速反應(yīng)劑為葡萄糖、蔗糖、甘露糖、麥芽糖、正十二烷基-β-D-麥芽糖、亞硝酸鉀、亞硝酸鈉、硝基苯中的ー種，其濃度范圍為O. 01-lmmol/L。所述物質(zhì)f中果糖基氨基酸氧化酶是純化的或是重組產(chǎn)生的。所述果糖基氨基酸氧化酶為作用于a_氨基被糖化的氨基酸或肽，同時(shí)催化產(chǎn)生過(guò)氧化氫的酶，其濃度為O. 2-100KU/L。所述物質(zhì)h中的過(guò)氧化物酶為辣根過(guò)氧化物酶，其濃度范圍為20-800KU/L。所述物質(zhì)g中的顯色劑為N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’ -雙(ニ甲氨基)ニ苯基胺鈉(DA-64)、10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-雙(ニ甲氨基)吩噻嗪鹽(DA-67 )、Trinder試劑中的ー種，其濃度范圍為O. 02-10mmol/Lo本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，在不需要単獨(dú)測(cè)定血液樣品中總血紅蛋白的條件下，可以直接對(duì)糖化血紅蛋白進(jìn)行測(cè)定。


圖I為本發(fā)明方法及測(cè)定試劑盒與東曹HPLC法測(cè)試結(jié)果相關(guān)性趨勢(shì)圖。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步描述。本發(fā)明是利用氧化還原反應(yīng)測(cè)定試樣中的糖化血紅蛋白的方法，提高了現(xiàn)有糖化血紅蛋白測(cè)定方法的準(zhǔn)確度和精密度，并且本方法提供了測(cè)定糖化血紅蛋白準(zhǔn)確度、精密度、操作性能均優(yōu)良的糖化血紅蛋白測(cè)定試劑盒。本發(fā)明的測(cè)定方法中，作為溶血緩沖液，可以使用Triton系表面活性剤、Triton系表面活性剤、Brij系表面活性劑等非離子表面活性剤，具體而言，所述的表面活性劑為TritonX-100, Tween-20, Brij35中的ー種。具體添加量為，在處理溶液中血細(xì)胞的濃度為1%-10%時(shí)，添加上述表面活性劑的濃度為O. 1-1%的重量，室溫下靜置3-10分鐘即可溶血完全，上述表面活性劑的濃度不受特別限制，優(yōu)選O. 1-5%之間。
作為蛋白酶，可以使用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K、豬胰蛋白酶、氨肽酶、嗜熱菌蛋白酶、蛋白酶E、中性蛋白酶、弾性蛋白酶中的至少ー種蛋白酶。其中優(yōu)選枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶E，更加優(yōu)選枯草桿菌蛋白酶中的ー種，使用這種蛋白酶測(cè)定糖化血紅蛋白，其中糖化血紅蛋白以外的糖化蛋白質(zhì)或者糖化肽很難被分解，而且，所采用的果糖基氨基酸氧化酶也只作用于糖化血紅蛋白分解的糖化氨基酸，因此這種方法測(cè)定的只有糖化血紅蛋白，蛋白酶的濃度不受特別限制，優(yōu)選100-5000KU/L之間。 作為能夠氧化并消除樣本中的干擾物質(zhì)的氧化劑為戴斯馬丁氧化劑或者高碘酸鈉，主要氧化血液中ー些低分子量的還原物質(zhì)，例如抗壞血酸、膽紅素、尿酸等一些干擾物質(zhì)，其氧化劑的濃度不受特別限制，優(yōu)選O. 5-10mmol/L之間。作為能夠?qū)⒀t蛋白變性并且能夠加快蛋白酶反應(yīng)速率的氧化劑是四唑鎗鹽，可以使用2- (4-碘苯基)-3- (4-硝基苯基)-5- (2，4_ ニ磺酸苯基)-2H-四唑鹽、2- (4-碘苯基)-3- (2，4-ニ硝基苯基)-5- (2，4_ ニ磺酸苯基)-2H-四唑鹽、2- (2-甲氧基-4-硝基苯基)-3- (4-硝基苯基)-5- (2，4_ ニ磺酸苯基)-2H-四唑鹽、2- (4-碘苯基)-3- (4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鹽、2，5-ニ苯基-3-(間甲苯基)四唑鹽、2，5-ニ苯基-3-(對(duì) 甲苯基)四唑鹽、2，3_ ニ苯基-5- (2-噻吩基)四唑鹽、鐵氰化鉀、碘酸鉀中的ー種。其中優(yōu)選2- (4-碘苯基)-3- (4-硝基苯基)-5- (2，4_ ニ磺酸苯基)-2H-四唑鹽、2- (4-碘苯基)-3- (2，4-ニ硝基苯基)-5- (2，4-ニ磺酸苯基)-2H-四唑鹽中的ー種。除了氧化血液中的血紅蛋白大分子外，還可以加快蛋白酶的酶切反應(yīng)，能夠使反應(yīng)迅速達(dá)到終點(diǎn)，其濃度不受特別限制，優(yōu)選O. 05-10mmol/L之間。作為能夠加快蛋白酶反應(yīng)速率的加速反應(yīng)劑，可以使用葡萄糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、正十二烷基-β-D-麥芽糖、亞硝酸鉀、亞硝酸鈉、硝基苯等，其中優(yōu)選亞硝酸鉀、亞硝酸鈉中的ー種，在這些加速反應(yīng)劑的存在下對(duì)糖化血紅蛋白進(jìn)行處理時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)蛋白酶處理的高效率和時(shí)間縮短化，并且由于可以高效的進(jìn)行蛋白酶酶切，可以不需要増加使用的蛋白酶量，進(jìn)而使試劑克服了由于增加蛋白酶濃度而產(chǎn)生的一系列不利的作用。優(yōu)選亞硝酸鉀、亞硝酸鈉，且濃度范圍不受特別限制，優(yōu)選O. ΟΙ-lmmol/L之間。作為能夠與上述切斷的糖化血紅蛋白β鏈N基末端的糖化纈氨酸或糖化多肽片段進(jìn)行氧化還原反應(yīng)的果糖基氨基酸氧化酶，可以使用任意的果糖基氨基酸氧化酶，可以是純化的或是重組產(chǎn)生的，其中優(yōu)選作用于a -氨基被糖化的氨基酸或肽，同時(shí)催化產(chǎn)生過(guò)氧化氫的酶，且濃度范圍不受特別限制，優(yōu)選O. 2-100KU/L。將上述步驟中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫與顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色劑可以選用N-(羧甲基氨基羰基)-4，4 ’ -雙(ニ甲氨基)ニ苯基胺鈉(DA-64 )、10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-雙(ニ甲氨基)吩噻嗪鹽(DA-67)、Trinder試劑中的ー種，優(yōu)選N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’ -雙(ニ甲氨基)ニ苯基胺鈉(DA-64)中的ー種，其濃度范圍不受特別限制，優(yōu)選O. 02-10mmol/L之間。而過(guò)氧化物酶是指能夠催化過(guò)氧化氫和顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)的酶，也可以使用商購(gòu)的辣根過(guò)氧化物酶。其濃度范圍不受特別限制，有限濃度范圍為20-800KU/L。通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)ー步說(shuō)明。實(shí)施例I :將新鮮血液樣品用Triton X-100溶血緩沖液溶血處理3分鐘后，將溶血后的樣品用嗜熱菌蛋白酶處理，通過(guò)果糖基氨基酸氧化酶進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，對(duì)生成的過(guò)氧化氫進(jìn)行顯色測(cè)定。測(cè)定所用的新鮮全血樣品是糖化血紅蛋白糖化率為10. 9%的人全血，其糖化率是通過(guò)東曹HPLC法求得。試樣前處理液組成
MES 緩沖液，pH7. O50mmol/L
嗜熱菌蛋白酶(蛋白酶)1800KU/L
戴斯-馬丁氧化劑(氧化劑)2mmol/L
亞硝酸鉀(加速反應(yīng)劑)Immol/L
WST-3IOmmoI/L 經(jīng)氧化還原反應(yīng)液組成
果糖基氨基酸氧化酶20KU/L
POD (過(guò)氧化物酶)115KU/L
DA-64 (通色摘)2. 5mmol/L
Tris-HCl 緩沖液，pH8. 5100 mmol/L取Iml上述溶血后的10. 9%的糖化血紅蛋白樣品，向其中添加4ml試樣前的處理液，并在37°C下反應(yīng)3分鐘，向以上反應(yīng)液中添加Iml的氧化還原反應(yīng)液，繼續(xù)在37°C下反應(yīng)5分鐘后，通過(guò)紫外分光光度計(jì)對(duì)主波長(zhǎng)700nm、副波長(zhǎng)SOOnm處進(jìn)行吸光度的測(cè)定。實(shí)施例2 將實(shí)施例I中的嗜熱菌蛋白酶替換為蛋白酶E，其他反應(yīng)條件與實(shí)施例I相同，對(duì)上述溶血后的10. 9%的糖化血紅蛋白樣品進(jìn)行吸光度測(cè)定。實(shí)施例3 將實(shí)施例I中的嗜熱菌蛋白酶替換為枯草桿菌蛋白酶，其他反應(yīng)條件與實(shí)施例I相同，對(duì)上述溶血后的10. 9%的糖化血紅蛋白樣品進(jìn)行吸光度測(cè)定。實(shí)施例4 將實(shí)施例I中的嗜熱菌蛋白酶替換為中性蛋白酶，其他反應(yīng)條件與實(shí)施例I相同，對(duì)上述溶血后的10. 9%的糖化血紅蛋白樣品進(jìn)行吸光度測(cè)定。實(shí)施例5:將實(shí)施例I中的嗜熱菌蛋白酶替換為豬胰蛋白酶，其他反應(yīng)條件與實(shí)施例I相同，對(duì)上述溶血后的10. 9%的糖化血紅蛋白樣品進(jìn)行吸光度測(cè)定。實(shí)施例6 將實(shí)施例I中的嗜熱菌蛋白酶替換為氨肽酶，其他反應(yīng)條件與實(shí)施例I相同，對(duì)上述溶血后的10. 9%的糖化血紅蛋白樣品進(jìn)行吸光度測(cè)定。
實(shí)施例7 將實(shí)施例I中的嗜熱菌蛋白酶替換為菠蘿蛋白酶，其他反應(yīng)條件與實(shí)施例I相同，
對(duì)上述溶血后的10. 9%的糖化血紅蛋白樣品進(jìn)行吸光度測(cè)定。如下表所示，為以上實(shí)施例I至實(shí)施例7對(duì)吸光度的測(cè)定結(jié)果。表一
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的試劑，其特征在干由以下物質(zhì)組成， (a)從血液樣品中的紅細(xì)胞釋放血紅蛋白的溶解緩沖劑； (b)能夠切斷糖化血紅蛋白β鏈N基末端的糖化纈氨酸或糖化多肽片段的蛋白酶； (c)能夠氧化并消除樣本中干擾物質(zhì)的氧化劑； Cd)能夠?qū)⒀t蛋白變性并且能夠加快蛋白酶反應(yīng)速率的氧化劑； Ce)能夠加快蛋白酶反應(yīng)速率的加速反應(yīng)劑； (f)與物質(zhì)a中能夠切斷糖化血紅蛋白β鏈N基末端的糖化纈氨酸或糖化多肽片段進(jìn)行氧化還原反應(yīng)的果糖基氨基酸氧化酶； (g)能夠與產(chǎn)生的過(guò)氧化氫發(fā)生顯色反應(yīng)的顯色劑； (h)能夠催化過(guò)氧化氫和顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)的過(guò)氧化物酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的試劑，其特征在于所述物質(zhì)a中的緩沖劑為TritonX-100、Tween-20、Brij35中的ー種；添加的濃度為O. 1%_1%的重量，室溫下靜置3-10分鐘即可溶血完全。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的試劑，其特征在于所述物質(zhì)b中的蛋白酶為木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K、豬胰蛋白酶、氨肽酶、嗜熱菌蛋白酶、蛋白酶E、中性蛋白酶、弾性蛋白酶中的ー種；蛋白酶的濃度范圍為100-5000KU/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的試劑，其特征在于所述物質(zhì)c中的氧化劑是戴斯馬丁氧化劑或者高碘酸鈉,其濃度范圍為O. 5-10mmol/Lo
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的試劑，其特征在于所述的物質(zhì)d中的氧化劑為四唑鎗鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的ー種測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的試劑，其特征在于所述的四唑鎗鹽是2- (4-碘苯基)-3- (4-硝基苯基)-5- (2，4-ニ磺酸苯基)-2H-四唑鹽、2-(4-碘苯基)-3- (2，4-ニ硝基苯基)-5- (2，4-ニ磺酸苯基)-2H-四唑鹽、2- (2-甲氧基-4-硝基苯基)-3- (4-硝基苯基)-5- (2，4-ニ磺酸苯基)-2H-四唑鹽、2- (4-碘苯基)-3- (4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鹽、2，5-ニ苯基-3-(間甲苯基)四唑鹽、2，5-ニ苯基-3-(對(duì)甲苯基)四唑鹽、2，3-ニ苯基-5- (2-噻吩基)四唑鹽、鐵氰化鉀、碘酸鉀。其中優(yōu)選2- (4-碘苯基)-3- (4-硝基苯基)-5- (2，4_ ニ磺酸苯基)-2H-四唑鹽、2- (4-碘苯基)-3- (2，4-ニ硝基苯基)-5- (2，4-ニ磺酸苯基)-2H-四唑鹽中的ー種，其濃度范圍為 O. 05-1 Ommol /I,η
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的試劑，其特征在于所述物質(zhì)e中的加速反應(yīng)劑為葡萄糖、蔗糖、甘露糖、麥芽糖、正十二烷基-D-麥芽糖、亞硝酸鉀、亞硝酸鈉、硝基苯中的ー種或多種混合物，其濃度范圍為O. 01-lmmol/Lo
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的試劑，其特征在于所述物質(zhì)f中果糖基氨基酸氧化酶是純化的或是重組產(chǎn)生的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的ー種測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的試劑，其特征在于所述果糖基氨基酸氧化酶為作用于a-氨基被糖化的氨基酸或肽，同時(shí)催化產(chǎn)生過(guò)氧化氫的酶，其濃度為 O. 2-100KU/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的試劑，其特征在于所述物質(zhì)h中的過(guò)氧化物酶為辣根過(guò)氧化物酶，其濃度范圍為20-800KU/L。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的試劑，其特征在于所述物質(zhì)g中的顯色劑為N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-雙(ニ甲氨基)ニ苯基胺鈉(DA-64)、10-(羧甲基氨基羰基)_3，7-雙(ニ甲氨基)吩噻嗪鹽(DA-67)、Trinder試劑中的ー種，其濃度范圍為 O.02-10mmol/Lo
全文摘要
本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥試劑，具體的說(shuō)是一種測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的試劑，由以下物質(zhì)組成，從血液樣品中的紅細(xì)胞釋放血紅蛋白的溶解緩沖劑；能夠切斷糖化血紅蛋白β鏈N基末端的糖化纈氨酸或糖化多肽片段的蛋白酶；能夠氧化并消除樣本中的干擾物質(zhì)的氧化劑；能夠?qū)⒀t蛋白變性并且能夠加快蛋白酶反應(yīng)速率的氧化劑；能夠加快蛋白酶反應(yīng)速率的加速反應(yīng)劑；與物質(zhì)a中能夠切斷糖化血紅蛋白β鏈N基末端的糖化纈氨酸或糖化多肽片段進(jìn)行氧化還原反應(yīng)的果糖基氨基酸氧化酶；能夠與產(chǎn)生的過(guò)氧化氫發(fā)生顯色反應(yīng)的顯色劑；能夠催化過(guò)氧化氫和顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)的過(guò)氧化物酶。本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，可以直接對(duì)糖化血紅蛋白進(jìn)行測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N21/78GK102692411SQ201210189180
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月8日
發(fā)明者孫明禮, 李子樵 申請(qǐng)人:上海藍(lán)怡科技有限公司