一種檢測糖化血紅蛋白的一體化試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及糖化血紅蛋白檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測糖化血紅蛋白的一體 化試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一組病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明了的內(nèi)分泌代謝疾病，目前發(fā)病率僅次 于心血管疾病和腫瘤。目前，糖尿病的發(fā)病率呈不斷上升趨勢，是嚴(yán)重威脅人類健康的世界 性公共衛(wèi)生問題。傳統(tǒng)的糖尿病診斷和治療監(jiān)測采用空腹血糖、餐后血糖和口服葡萄糖耐 量試驗等，但是血糖參數(shù)僅代表抽血時的瞬間血糖水平，而糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin, GHb)作為反映長期血糖水平的金標(biāo)準(zhǔn)，也是監(jiān)測糖尿病治療的重要指標(biāo) GHb是指結(jié)合了任何形式碳水化合物的血紅蛋白（hemoglobin，Hb)。人類Hb主要是HbA (95%~97%)、!《^2(〈3%)、肋？(〈1%)。!《^中未結(jié)合糖的為肋40(90%)、結(jié)合糖的為肋八1 (5%~7%)即GHb。其中HbAl包括結(jié)合果糖-1，6_二磷酸葡萄糖的HbAlal、結(jié)合葡萄糖-6-磷 酸的HbAla2、結(jié)合未知碳水化合物的HbAlb和結(jié)合葡萄糖的HbAlc，HbAlc占 GHb的70%~ 90%。池六1(：在組織中由葡萄糖的游離醛基與HbA的β鏈N末端纈氨酸的氨基進(jìn)行不可逆的非 酶促的反應(yīng)，此過程稱為糖基化，GHb的形成主要取決于血糖濃度及血糖與Hb的接觸時間。 GHb可以反映最近2~3個月的平均血糖水平。2002年美國糖尿病協(xié)會已明確規(guī)定應(yīng)定期檢 測HbAlc，并將其作為監(jiān)測糖尿病血糖控制的金標(biāo)準(zhǔn)。
[0003] GHb的測定方法有幾十種之多，目前常用的基本上可分為兩大類:一類是基于GHb 和Hb的電荷不同，如離子交換層析法、電泳法；另一類是基于Hb上糖化基團(tuán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，如 親和層析法、免疫法和酶法等。多個研究表明不同的原理測定的結(jié)果存在差別，而糖尿病患 者治療目標(biāo)要求測定值不受測定方法的影響，因此在實(shí)驗室里應(yīng)用不同GHb測定方法所產(chǎn) 生的結(jié)果可比性非常重要。
[0004] 離子交換層析法主要有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC)和手工微柱法。此方法是基于血紅蛋白β鏈N末端繳氨酸糖化后所 帶電荷不同而建立。但由于此方法所使用的儀器昂貴，難以在比較基層的醫(yī)院和實(shí)驗室普 及;微柱法手工操作步驟繁瑣，層析時間和微柱的質(zhì)量不易控制，易產(chǎn)生操作技術(shù)誤差，重 復(fù)性欠佳；而且干擾因素很多，尤其對pH值和溫度的變化敏感，HbF及變異血紅蛋白（ HbS、HbC、HbE等）對結(jié)果干擾，干擾程度根據(jù)柱的分離能力而定，所以一定要仔細(xì)觀察圖 譜。
[0005] 電泳法（以瓊脂凝膠電泳為例)Hb于酸性緩沖液條件下（pH6. 0)在瓊脂糖凝膠 上的電泳迀移取決于Hb在凝膠上的吸附情況及其所帶的電荷。該方法標(biāo)本用量少，分辨率 高，重復(fù)性好，有研究發(fā)現(xiàn)血糖值與HbAlc值有顯著相關(guān)性，且結(jié)果不受溫度及胎兒血紅蛋 白的影響。另外，因為它可測定的Hb線性范圍較寬（13.0-39.0g/L)，可發(fā)現(xiàn)異常Hb。該方法 的缺點(diǎn)是每次測定均需成批進(jìn)行樣本分析，速度比較慢，無法進(jìn)行實(shí)時個體檢測，自動化程 度較差，所測結(jié)果與技術(shù)人員掃描和對電泳的波峰判斷有關(guān)，受主觀因素影響，并且費(fèi)用昂 貴，因此并不適合臨床實(shí)驗室常規(guī)使用。
[0006] 親和層析法硼酸具有與整合在Hb分子上葡萄糖的順位二醇基作可逆結(jié)合反應(yīng)的 性質(zhì)。通常使用的是間-氨基苯硼酸瓊脂糖，將血樣本加到層析柱后，所有的GHb與硼酸結(jié)合 留在柱中，非GHb直接流出層析柱;再加入高濃度也包含順位二醇基的多羥基復(fù)合物(如山 梨醇），GHb與硼酸的結(jié)合被替換而被洗脫下來，分別測量兩組分，并計算比值。親和層析法 對變異血紅蛋白和病理血紅蛋白的影響相對其他方法不敏感，但測定的是HbAi即6池總量。 另外，金標(biāo)法和硼酸親和層析法密切相關(guān)，操作均簡便易行、快速準(zhǔn)確、試劑穩(wěn)定。據(jù)報道， 該法不受除HbS和HbC之外的任何血紅蛋白變異體和降解產(chǎn)物的干擾，結(jié)果可靠，比較適用 于臨床隨時檢測。
[0007] 免疫比濁法利用抗原、抗體反應(yīng)的原理進(jìn)行測定。GHb的β鏈N末端提供了一個容 易被抗體識別的抗原表位，可以用單克隆抗體或多克隆抗體，特異識別GHb的β鏈Ν末端最后 4~6個氨基酸組成的抗原表位，結(jié)合比色或比濁法，以GHb為標(biāo)準(zhǔn)，測定HbAlc的含量，再 測定Hb的含量，最后計算出HbAlc占總Hb的百分含量。此類方法只能作為判斷糖尿病血 糖水平的指標(biāo)，不可用于變異血紅蛋白的研究。與其相比，免疫比濁法檢測的方法更為簡 單，不需要額外添加儀器，為臨床提供了一種快速、準(zhǔn)確、可靠、簡便的常規(guī)方法，在臨床應(yīng) 用中有著更為廣闊的前景。
[0008] 酶法全血經(jīng)溶血處理后，用特異蛋白內(nèi)切酶將Hb酶解消化成果糖氨基酸，再經(jīng)果 糖氨基酸氧化酶作用下產(chǎn)生過氧化氫(hydrogen peroxide，H2〇2)，H2〇2的濃度與血液中GHb 的含量成正比，H2〇2在過氧化物酶的作用下與相應(yīng)的色原耦聯(lián)，從而根據(jù)顏色變化程度可得 H2〇2濃度，進(jìn)而得知樣本中GHb的含量；同時測定同一管消化液的總Hb濃度，計算GHb和Hb的 濃度比值，即為GHb結(jié)果。此法提供了一個像臨床生化反應(yīng)一樣快速均一的反應(yīng)系統(tǒng)（如葡 萄糖、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶），有很好的精密度，可同時檢測GHb和Hb，且與常規(guī)HPLC法和免疫 測定法有很好的相關(guān)性。
[0009] 離子捕獲法應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)原理，并聯(lián)以熒光標(biāo)志物，通過連接帶負(fù)電的多陰 離子復(fù)合物，吸附到帶正電的的纖維表面，經(jīng)過一系列徹底清洗等步驟后，測定熒光強(qiáng)度變 化率，計算GHb濃度。其檢測系統(tǒng)易于規(guī)范和重復(fù)，可減少操作技術(shù)誤差，檢測的敏感度和 特異度高，批內(nèi)、批間變異系數(shù)小。有文獻(xiàn)報道此法影響因素少，準(zhǔn)確度高，回收率達(dá)98. 85%，交叉污染率<0.01%。該方法是近幾年發(fā)展起來的新方法，采用自動分析儀，適用于批量 標(biāo)本的檢測。
[0010] 對基層醫(yī)療單位而言，上述幾種方法，要么試劑、儀器成本高，要么操作復(fù)雜、要么 準(zhǔn)確度低，穩(wěn)定性差，且均不適合社區(qū)及基層醫(yī)院。因此，需要對現(xiàn)有的測定糖化血紅蛋白 比例的方法進(jìn)行改進(jìn)，提出一種新方法來解決這些問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種檢測糖化血紅蛋白的一體 化試劑盒，只需要微量的全血樣本，即可在3~5分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)定量檢測糖化血紅蛋白的含量， 且結(jié)構(gòu)簡單，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
[0012] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種使用上述試劑盒檢測糖化血紅蛋白的檢測方法， 只需要微量的全血樣本，即可在3~5分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)定量檢測糖化血紅蛋白的含量，特異性好， 靈敏度高。
[0013]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為:提供一種檢測糖化血紅蛋白的一體 化試劑盒，包括:反應(yīng)分析墊、位于所述反應(yīng)分析墊右側(cè)的裝有親和反應(yīng)液的親和反應(yīng)液微 孔、位于所述親和反應(yīng)液微孔右側(cè)的裝有清洗液的清洗液微孔和位于所述清洗液微孔右側(cè) 的條碼區(qū)。
[0014]優(yōu)選的，上述檢測糖化血紅蛋白的一體化試劑盒中，所述親和反應(yīng)液微孔的孔徑 為5mm~6mm，高度8mm~10mm，內(nèi)裝有250yL親和反應(yīng)液。
[0015] 優(yōu)選的，上述檢測糖化血紅蛋白的一體化試劑盒中，所述親和反應(yīng)液包括如下濃 度的組分： 甘氛酸 20~150mmol/L， 氯化鋅 2~50mmol/L， 氯化鎂 5~50mmol/L， 氯化鉀 50~500mmol/L， 疊氮化鈉 0.1~1.5g/L， 藍(lán)色苯硼酸染料 0.05~0.50 mmol/L， 甲醇 體積濃度為1.5~5.0%， 乙基苯基聚乙二醇質(zhì)量體積濃度為0.05~0.1%。優(yōu)選的，上述檢測糖化血紅蛋白的一 體化試劑盒中，所述親和反應(yīng)液的PH值為8.5~10.5。
[0016] 優(yōu)選的，上述檢測糖化血紅蛋白的一體化試劑盒中，所述清洗液微孔的孔徑為5mm ~6mm，高度為8mm~10mm，內(nèi)裝有60~80yL的清洗液。
[0017] 優(yōu)選的，上述檢測糖化血紅蛋白的一體化試劑盒中，所述清洗液包括如下濃度的 組分： 三羥甲基氨基甲烷 20~200mmol/L， 疊氮化鈉 0.1~1.5g/L， 聚乙二醇辛基苯基醚體積濃度為0.05~0.5%。
[0018]