專(zhuān)利名稱(chēng)：一種結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)試劑盒，同時(shí)還涉及一種結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)試劑盒的用途。
背景技術(shù)：
結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，占胃腸道腫瘤的第3位。我國(guó)的發(fā)病率與死亡率，隨著人民生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的改變，呈逐年上升的趨勢(shì)。結(jié)直腸癌已經(jīng)成為威脅人類(lèi)生命和健康不容忽視的疾病。結(jié)直腸癌起病隱匿，早 期癥狀不明顯，許多患者在確診時(shí)已經(jīng)處于晚期。大約25%的患者初次就診時(shí)就已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，另外，40% -50%新診斷患者將繼續(xù)發(fā)展出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。僅僅少于5%的患者能存活5年以上。因此，深入對(duì)結(jié)直腸癌的基礎(chǔ)研究和提高結(jié)直腸癌的診斷率，對(duì)提高結(jié)直腸患者的生存率、降低其病死率具有相當(dāng)重要的臨床意義。目前用于結(jié)直腸癌的診斷的方法包括大便潛血試驗(yàn)、內(nèi)窺鏡檢查、影像學(xué)檢察、分子生物學(xué)檢查以及病理組織學(xué)檢查。目前在結(jié)直腸癌診斷技術(shù)中，不同的檢查手段是從不同側(cè)面不同程度反映了區(qū)別于正常組織的腫瘤形態(tài)。單一的檢查手段并不能明確病情，需要結(jié)合實(shí)際情況，選擇多種檢查手段才能做出判斷。其中病理診斷也是結(jié)直腸癌診斷中最可靠的診斷，是明確診斷以擬定治療方案所必需的依據(jù)。常規(guī)的病理形態(tài)學(xué)檢查包括脫落細(xì)胞學(xué)檢查和活體組織檢查。由于結(jié)直腸中脫落細(xì)胞常有不同程度的變性，陰性結(jié)果并不能否定腫瘤的存在，臨床上結(jié)直腸癌脫落細(xì)胞學(xué)檢查應(yīng)用范圍非常有限，主要依靠組織病理學(xué)檢查明確診斷。免疫組化是最近10多年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新興技術(shù)。它已被廣泛運(yùn)用腫瘤研究和診斷，其原理是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)來(lái)檢測(cè)組織中的未知抗原或者抗體，主要是腫瘤相關(guān)抗原(腫瘤分化抗原和腫瘤胚胎抗原)，借以判斷腫瘤的來(lái)源和分化程度，協(xié)助腫瘤的病理診斷和鑒別診斷。目前常用的染色方法有過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶法，即PAP法(peroxidaseantiperoxidase technique)和卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法，即 ABC 法(avidin-biotin-peroxidase complex technique)。利用免疫組織化學(xué)方法已經(jīng)可以對(duì)許多常規(guī)方法難以判斷其來(lái)源的腫瘤加以鑒別。例如檢測(cè)細(xì)胞骨架的中間絲(intermediate filament),其直徑平均為IOnm,介于微管和微絲之間。中間絲有五類(lèi)即神經(jīng)原纖維、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白、結(jié)蛋白(desmin)、波形蛋白(vimentin)和角蛋白(keratin)。它們各有生物化學(xué)和免疫學(xué)特性，并分別存在于不同類(lèi)型的細(xì)胞中，故具有相對(duì)的特異性，可用來(lái)協(xié)助診斷相應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、橫紋肌和平滑肌、間葉組織和上皮細(xì)胞來(lái)源的腫瘤。目前能用于腫瘤輔助診斷和鑒別診斷的抗體已不勝枚舉。此應(yīng)用基于本發(fā)明人嚴(yán)教授的實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果和通過(guò)用本抗體對(duì)一定量的結(jié)直腸癌患者的癌組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)其特異性和差異性表達(dá)的研究結(jié)果，表明可將其做為特異性診斷指標(biāo)。參考文獻(xiàn)列舉Targeting of antigens to B cellsaugments antigen-specific T—cell MUCl responses and breaks immune tolerance totumor-associated antigen, Chuanlin Ding, Li Wang, Jose Marroquin and Jun Yan,丨臨床研究結(jié)果參考本專(zhuān)利的染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)試劑盒，該試劑盒不僅可以區(qū)分癌變組織和正常組織，還可以區(qū)分癌變組織中癌變的細(xì)胞和正常的細(xì)胞。本試劑盒將MUCl這一在結(jié)直腸癌患者的癌變組織中特異性高表達(dá)的細(xì)胞因子作為用于檢測(cè)的參考指標(biāo)。MUCl在癌變細(xì)胞上皮中呈陽(yáng)性表達(dá)染色，而在正常結(jié)腸組織上皮細(xì)胞中呈陰性表達(dá)。MUCl蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)和細(xì)胞表面有棕黃色顆粒，本試劑盒檢測(cè)具有高靈敏性，高特異性和高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)，。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種用于結(jié)直腸癌免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒能有效地區(qū)分結(jié)直腸癌變的上皮細(xì)胞和正常細(xì)胞，為臨床的診斷和治療提供參考依據(jù)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)試劑盒，該試劑盒由以下物質(zhì)組成a)小鼠來(lái)源的抗人MUCl單克隆抗體；b)生物素標(biāo)記的的羊抗小鼠IgG ；c)親和素標(biāo)記的HRP ；d)正常山羊血清封閉液；e)3% (體積比)H202 ;f) DAB 顯色液；g)蘇木素；在本發(fā)明中關(guān)鍵是小鼠來(lái)源的抗人MUCl的抗體制備，其步驟為A.用大鼠抗⑶19和人MUCl的抗原肽免疫小鼠，每隔一周進(jìn)行一次免疫，共進(jìn)行3次后，收集接受過(guò)被動(dòng)免疫的小鼠血清，用ELISA的方法(所用試劑來(lái)自SouthernBiotech,Birmingham, AL 和 BioFX Laboratories, Owings Mills,MD 公司)測(cè)定抗 MUCl 應(yīng)答效價(jià)。B.處死并取出接受過(guò)被動(dòng)免疫并產(chǎn)生了高效價(jià)(ELISA法檢測(cè)其抗體濃度)抗MUCl應(yīng)答的小鼠脾臟細(xì)胞，將其與骨髓瘤細(xì)胞(provided by Dr Olivera Finn,University of Pittsburgh, PA)進(jìn)行融合得到雜交瘤細(xì)胞,并用ELISA的方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞分泌的MUCl抗體水平進(jìn)行檢測(cè)。C.對(duì)產(chǎn)生了高效價(jià)MUCl抗體的細(xì)胞克隆進(jìn)一步用ELISA的方法檢測(cè)其亞型，將明確亞型(IgG)的單克隆細(xì)胞通過(guò)雜交瘤技術(shù)進(jìn)行大量單克隆抗體生產(chǎn)。利用本專(zhuān)利提及的雜交瘤技術(shù)獲得高純度的抗體，濃度大于lmg/ml。本發(fā)明中的抗MUCl特異性的單克隆抗體，聯(lián)合免疫組織化學(xué)染色常規(guī)試劑生物素標(biāo)記的的羊抗小鼠IgG、親和素標(biāo)記的HRP、正常山羊血清封閉液、3%H202、DAB顯色液和蘇木素，能方便、高效、特異的輔助結(jié)直腸癌的病理檢測(cè)，可作為判斷患者預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)，對(duì)結(jié)直腸癌的檢測(cè)，基礎(chǔ)研究和檢測(cè)提供參考，具有臨床實(shí)用性和科學(xué)研究性。一種用于結(jié)直腸癌免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)的試劑盒，其檢測(cè)步驟是
I.組織用石蠟包 埋，切片，石蠟切片置于58_62°C烤箱中I小時(shí)后，脫蠟至水，用PBS (pH7. 4)沖洗2-4次，每次4-6分鐘。2.抗原微波修復(fù)10mM pH 5. 8-6. 2枸櫞酸鈉緩沖液倒入微波修復(fù)盒內(nèi)將切片放入修復(fù)液(枸櫞酸鈉緩沖液)內(nèi)，海爾牌普通微波爐加熱，確保修復(fù)溫度在95-98°C，并盡量避免沸騰，可采取高火3min —中火7min —低火3min的修復(fù)方式。自然冷卻后至室溫(20-25°C，以下同)，PBS沖洗2-4次，每次4-6分鐘。3.切片放入3% (體積比)H202溶液，室溫下孵育15分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。PBS沖洗2-4次，每次4-6分鐘。4.甩去PBS液，滴加質(zhì)量比為5% BSA,室溫靜置28_32分鐘。5.甩去BSA，將小鼠抗人MUCl的單克隆抗體按I : 200的體積濃度稀釋。每張切片加入100 U I稀釋液覆蓋組織，4°c過(guò)夜。PBS沖洗2-4次，每次4-6分鐘。6.甩去PBS液，每張切片加100 U I羊抗小鼠的二抗，室溫下孵育45分鐘。PBS沖洗2-4次，每次4-6分鐘。7.甩去PBS液，每張切片加50-100iil新鮮配制的DAB溶液(質(zhì)量體積比為
0.025% -0. 05% )，室溫20-25°C下孵育4_6分鐘，顯微鏡控制顯色約lmin。8.顯色完全后，蒸餾水或自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染l_3min，自來(lái)水洗。9.切片經(jīng)過(guò)梯度酒精(70-100%，體積百分比)脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。結(jié)果的觀察MUCl蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)和細(xì)胞表面有棕黃色顆粒。在癌變的腸上皮細(xì)胞中表達(dá)，而在正常腸上皮細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果采用以下判斷標(biāo)準(zhǔn)。將染色程度評(píng)分無(wú)色記0分、淡黃色記I分、棕黃色記2分和棕褐色記3分；再將陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比評(píng)分0分為陰性、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)< 10%記I分、11 % 50 %記2分、51 % 75 %記3分、> 75 %記4分，然后計(jì)算兩者的乘積。乘積<3分為陰性，彡3分為陽(yáng)性。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果本發(fā)明中的小鼠抗人MUCl的單克隆抗體進(jìn)行了人源化改進(jìn)，和其他非人源化抗體比較，除具有診斷價(jià)值外，還可應(yīng)用到臨床，進(jìn)行治療腫瘤，減少非人源化抗體帶來(lái)的免疫排異反應(yīng)。目前，該抗體用于結(jié)直腸癌的檢測(cè)具有高靈敏性，高特異性和高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)，不僅可以區(qū)分癌變組織和正常組織，還可以區(qū)分癌變組織中癌變的細(xì)胞和正常的細(xì)胞。MUCl在癌變細(xì)胞上皮中呈陽(yáng)性染色，而在正常結(jié)腸組織上皮細(xì)胞中呈陰性。


圖I為一種免疫組織化學(xué)染色示意IA為癌變病灶區(qū)結(jié)腸組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，不加MUCl抗體圖；圖IB為正常的結(jié)腸組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，不加MUCl抗體圖；圖IC為癌變病灶區(qū)結(jié)腸組織切片用MUCl抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色圖；圖ID為正常的結(jié)腸組織切片用MUCl抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色圖。所述的正常的結(jié)腸組織切片為病人手術(shù)切除標(biāo)本的末端、遠(yuǎn)離病灶區(qū)的正常組織。所述的癌變病灶區(qū)結(jié)腸組織為病人手術(shù)切除標(biāo)本的中間、病灶中心區(qū)的癌變組織。 圖2為一種免疫組織化學(xué)染色示意圖。表示結(jié)腸癌不同分期病人手術(shù)切除標(biāo)本中病灶區(qū)域的癌變組織和癌旁正常組織免疫組織化學(xué)染色圖。圖I和圖2結(jié)果顯示癌變組織上皮細(xì)胞胞漿和細(xì)胞膜高表達(dá)MUCl，而正常結(jié)腸組織上皮細(xì)胞表達(dá)量低或是基本不表達(dá)MUCl。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明的具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如精編分子生物學(xué)指南，F(xiàn).M.奧斯柏等主編，科學(xué)出版社，1995 ;細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南，呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例I :一種結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色試劑盒，包括a)小鼠來(lái)源的抗人MUCl單克隆抗體；b)生物素標(biāo)記的的羊抗小鼠IgG ；c)親和素標(biāo)記的HRP ；d)正常山羊血清封閉液；e)3% (體積比)H202 ;f) DAB 顯色液；g)蘇木素；b-g為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。小鼠來(lái)源的抗人MUCl的抗體制備，其步驟是A)用大鼠抗 CD19 (eBioscience)和人 MUCl (Applied Biosystems, Foster City,CA)的抗原肽免疫小鼠，每隔一周進(jìn)行一次免疫，共進(jìn)行3次后，收集接受過(guò)被動(dòng)免疫的小鼠血清，用ELISA的方法測(cè)定抗MUCl應(yīng)答效價(jià)。B)取接受過(guò)被動(dòng)免疫并產(chǎn)生了高效價(jià)抗MUCl應(yīng)答的小鼠脾臟細(xì)胞，將其與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合得到雜交瘤細(xì)胞，并用ELISA的方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞分泌的MUCl抗體水平進(jìn)行檢測(cè)。C)對(duì)產(chǎn)生了高效價(jià)MUCl抗體的細(xì)胞克隆進(jìn)一步用ELISA的方法檢測(cè)其亞型，將明確亞型(IgG)的單克隆細(xì)胞通過(guò)雜交瘤技術(shù)進(jìn)行大量單克隆抗體生產(chǎn)。實(shí)施例2 一種用于結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒包含a)小鼠來(lái)源的抗人MUCl單克隆抗體；b)生物素標(biāo)記的的羊抗小鼠IgG ；c)親和素標(biāo)記的HRP ；d)正常山羊血清封閉液；
e)3% (體積比)的 H2O2 ；f) DAB 顯色液； g)蘇木素；檢測(cè)步驟是I.組織用石蠟包埋，切片，石蠟切片置于60°C烤箱中I小時(shí)后，脫蠟至水，用PBS (pH7. 4)沖洗三次，每次5分鐘。2.抗原微波修復(fù)10mM pH 6. 0±0. I枸櫞酸鈉緩沖液倒入微波修復(fù)盒內(nèi)將切片放入修復(fù)液內(nèi)，海爾牌普通微波爐加熱，確保修復(fù)溫度在95-98°C，并盡量避免沸騰，可采取高火3min —中火7min —低火3min的修復(fù)方式。自然冷卻至室溫(20_25°C )后，PBS沖洗三次，每次5分鐘。3.切片放入3% (體積比)11202中，室溫下孵育15分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。PBS沖洗三次，每次5分鐘。4.甩去PBS液，滴加質(zhì)量比5% BSA室溫靜置30分鐘。5.甩去BSA，將抗人MUCl的單克隆抗體按I : 200的濃度稀釋。每張切片加入100 u I稀釋液覆蓋組織，4°C過(guò)夜。PBS沖洗三次，每次5分鐘。6.甩去PBS液，每張切片加100 U I羊抗小鼠的二抗，室溫下孵育45分鐘。PBS沖洗三次，每次5分鐘。7.甩去PBS液，每張切片加50-100iil新鮮配制的DAB溶液(質(zhì)量體積比為
0.025% -0. 05% )，室溫20-25°C下孵育5分鐘，顯微鏡控制顯色約lmin。8.顯色完全后，蒸餾水或自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染2min，自來(lái)水洗。9.切片經(jīng)過(guò)梯度酒精(體積百分比為70-100% )脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。結(jié)果的觀察MUCl蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)和胞膜上有棕黃色顆粒。在癌變的腸上皮細(xì)胞中表達(dá)，而在正常腸上皮細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)(圖I和圖2)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果采用以下判斷標(biāo)準(zhǔn)。將染色程度評(píng)分無(wú)色記0分、淡黃色記I分、棕黃色記2分和棕褐色記3分；再將陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比評(píng)分0分為陰性、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(10%記I分、11% 50%記2分、51% 75%記3分、> 75%記4分，然后計(jì)算兩者的乘積。乘積<3分為陰性，>3分為陽(yáng)性。通過(guò)組織芯片技術(shù)分析了 75離結(jié)直腸癌病人手術(shù)切除標(biāo)本中的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)75例結(jié)腸癌組織芯片中，癌變組織MUCl的陽(yáng)性表達(dá)水平顯著高于正常組織73. 33% 30. 67%。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有 a)小鼠來(lái)源的抗人MUCl單克隆抗體； b)生物素標(biāo)記的的羊抗小鼠IgG； c)親和素標(biāo)記的HRP； d)正常山羊血清封閉液； e)3%體積比H2O2 ； f)DAB顯色液； g)蘇木素。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的小鼠來(lái)源的抗人MUCl單克隆抗體的制備步驟是 A.用抗大鼠CD19和人MUCl的抗原肽免疫小鼠，每隔一周進(jìn)行一次免疫，共進(jìn)行3次后，收集接受過(guò)被動(dòng)免疫的小鼠血清，用ELISA的方法測(cè)定抗MUCl應(yīng)答效價(jià)； B.取接受過(guò)被動(dòng)免疫并產(chǎn)生了高效價(jià)抗MUCl應(yīng)答的小鼠脾臟細(xì)胞，將其與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合得到雜交瘤細(xì)胞，并用ELISA的方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞分泌的MUCl抗體水平進(jìn)行檢測(cè)； C.對(duì)產(chǎn)生了高效價(jià)MUCl抗體的細(xì)胞克隆進(jìn)一步用ELISA的方法檢測(cè)其亞型，將明確亞型=IgG的單克隆細(xì)胞通過(guò)雜交瘤技術(shù)進(jìn)行單克隆抗體生產(chǎn)。
3.一種用于結(jié)直腸癌免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)的試劑盒，含有小鼠來(lái)源的抗人MUCl單克隆抗體、生物素標(biāo)記的的羊抗小鼠IgG、親和素標(biāo)記的HRP、正常山羊血清封閉液、3%體積比H2O2、DAB顯色液和蘇木素。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用，該試劑盒含有a)小鼠來(lái)源的抗人MUC1單克隆抗體，b)生物素標(biāo)記的的羊抗小鼠IgG；c)親和素標(biāo)記的HRP；d)正常山羊血清封閉液；e)3%體積比H2O2；f)DAB顯色液；g)蘇木素。該檢測(cè)具有高靈敏性，高特異性和高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)，不僅可以區(qū)分癌變組織和正常組織，還可以區(qū)分癌變組織中癌變的細(xì)胞和正常的細(xì)胞。MUC1在癌變細(xì)胞上皮中呈陽(yáng)性表達(dá)染色，而在正常結(jié)腸組織上皮細(xì)胞中呈陰性表達(dá)，有效地區(qū)分結(jié)直腸癌變的上皮細(xì)胞和正常細(xì)胞，為臨床的診斷和治療提供參考依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102621324SQ20121009737
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月5日
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