專利名稱：基于lamp的微生物目視化熒光顯色基因檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物基因檢測方法，尤其涉及一種基于LAMP的微生物目視化熒光顯色基因檢測方法，適用于微生物定性檢測。
背景技術(shù)：
微生物是包括細菌、病毒、真菌以及一些小型的原生動物和顯微藻類等在內(nèi)的一大類生物群體。微生物個體微小，卻與人類生活關(guān)系密切，涵蓋了有益有害的眾多種類，廣泛涉及健康、食品、醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)和環(huán)保等諸多領(lǐng)域。微生物對人類最重要的影響之一是導(dǎo)致傳染病的流行，在人類疾病中有50%是由病毒引起。食品污染嚴重威脅人類身體健康，食源性致病菌是引起細菌性食物中毒的病原體。因此，微生物檢測在人類社會生活中具有極其重要的意義，開發(fā)一種快速靈敏的微生物基因檢測方法十分必要。傳統(tǒng)檢測微生物的培養(yǎng)方法，需要分離、篩選和生化鑒定，必要時還需要血清學(xué)鑒定，一般為4 6d，費時費力，具有靈敏度低、特異性差、假陽性和耗時費力等缺點。各種常規(guī)PCR(Polymerase Chain Reaction聚合酶鏈式反應(yīng))方法具有敏感性強、特異性高、簡便和快速等優(yōu)點，有較多應(yīng)用于微生物基因檢測的報道，但由于存在PCR 后處理產(chǎn)生污染導(dǎo)致的假陽性等問題以及需要特殊的儀器設(shè)備而限制了其在基層單位的應(yīng)用。近年來發(fā)展起來的LAMP (loop-mediated isothermal amplification,環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù))以其靈敏度高、速度快和特異性強等優(yōu)點在基因定性檢測方面得到廣泛應(yīng)用，并且已經(jīng)成為當前核酸定性檢測的重要方法之一。LAMP是一種新型的等溫核酸擴增方法，該方法針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒溫條件(65°C左右)保溫約60min，即可完成核酸擴增反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可見的反應(yīng)副產(chǎn)物一白色焦磷酸鎂沉淀。該方法具有不需要PCR儀、肉眼可判斷結(jié)果及反應(yīng)時間短、特異性強和靈敏度高等優(yōu)因此隳待開發(fā)一種精確、靈敏、快速和無污染的臨床檢驗方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點和不足，并針對LAMP出現(xiàn)的白色焦磷酸鎂沉淀肉眼難以辨別問題做出改進，提供一種基于LAMP的微生物目視化熒光顯色基因檢測方法(簡稱檢測方法)。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的基本思路本檢測方法先按照國標法用緩沖蛋白胨水增菌培養(yǎng)待檢樣品，然后利用水煮法提取樣品DNA，接著將提取到的樣品DNA進行恒溫擴增，最后通過熒光顯色法用肉眼直接判斷檢測結(jié)果。
具體地說，本檢測方法包括下列步驟①用緩沖蛋白胨水(Buffer Peptone Water簡稱BPW)按照國標法培養(yǎng)待檢樣品 4h ；②用水煮法從待測樣品中提取DNA ；③將DNA加入到LAMP反應(yīng)體系中，65°C保溫Ih ；④通過與對照組比較，肉眼觀察待測樣品結(jié)果，對樣品進行定性分析；所述LAMP反應(yīng)體系包括LAMP反應(yīng)液和熒光顯色劑；a) LAMP 反應(yīng)液LAMP 反應(yīng)液由 LAMP IOXbuffer 2. 5 μ 1，20 μ mol/L 內(nèi)引物 FIP、BIP 各 2. O μ 1， 20ymol/L 夕卜引物 F3、Β3 各 I. 0μ l，25mmol/L dNTPs 3. O μ l,50mmol/L MgS043. O μ I,
I.OmoI/L甜菜堿5 μ 1，Bst DNA聚合酶大片段I. O μ I，無菌雙蒸水2. O μ I組成，反應(yīng)液總體積 22. 5 μ I ；b)熒光顯色劑突光顯色劑是由10 μ mol/L-20mmol/L 的I丐黃綠素 I μ I 和 60 μ mol/L—0· Imol/ LMnCl2 O. 5μ I 組成。本發(fā)明的工作原理在本發(fā)明提供的LAMP反應(yīng)體系中含有熒光顯色劑(鈣黃綠素和MnCl2)，在等溫擴增反應(yīng)之初，鈣黃綠素與熒光淬滅劑MnCl2結(jié)合而不發(fā)熒光。由于反應(yīng)生成的焦磷酸根離子更容易與錳離子結(jié)合從而釋放了鈣黃綠素，游離的鈣黃綠素就可以自發(fā)熒光，在鎂離子存在的條件下，這種熒光效果得到了加強。因此，當使用本發(fā)明檢測樣品時，在恒溫條件(65°C 左右)保溫約Ih后，在日光燈下陽性樣本管呈綠色，陰性樣本管呈橙色，在紫外燈下，陽性樣本管顯示強熒光，陰性樣本管則不顯示熒光。在本發(fā)明中，針對微生物檢測中的特殊性，對不同的靶片段進行反應(yīng)體系，如引物、dNTPs、Mg2+濃度、甜菜堿、鈣黃綠素及MnC12濃度的優(yōu)化，通過優(yōu)化方案，反復(fù)實驗，建立了本檢測方法，其靈敏度可在每個反應(yīng)體系中檢出10拷貝，可以滿足快速檢測病源微生物的要求，并且通過熒光顯色判斷的結(jié)果與瓊脂糖電泳的結(jié)果完全一致。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和效果I、與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，檢測速度快，僅5h，加上樣品DNA的提取制備，總共不超過 6h ；2、特異性好，靈敏度高；3、步驟簡單，可重復(fù)性高；4、可同時進行多個樣品檢測。在本發(fā)明可對微生物進行定性檢測，并可替代一直沿用的傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和血清學(xué)檢測方法。


圖I為沙門氏菌紫外燈下觀察結(jié)果圖，圖中I-標準陽性模板， 2-陰性對照，3-沙門氏菌陽性樣本，4-沙門氏菌陽性樣本，5-沙門氏菌陽性樣本，6-沙門氏菌陰性樣本，
7-沙門氏菌陰性樣本，8-沙門氏菌陰性樣本；圖2為沙門氏菌I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖，圖中I-DNA Marker,2_標準陽性模板， 3_陰性對照，4-沙門氏菌陽性樣本，5-沙門氏菌陽性樣本，6-沙門氏菌陽性樣本，7-沙門氏菌陰性樣本，8-沙門氏菌陰性樣本，9-沙門氏菌陰性樣本；圖3為志賀氏菌紫外燈下觀察結(jié)果圖，圖中I-標準陽性模板， 2-陰性對照，3-志賀氏菌陽性樣本，4-志賀氏菌陽性樣本，5-志賀氏菌陽性樣本，6-志賀氏菌陰性樣本，7-志賀氏菌陰性樣本，8-志賀氏菌陰性樣本；圖4為志賀氏菌I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖，圖中I-DNA Marker,2_標準陽性模板， 3_陰性對照，4-志賀氏菌陽性樣本,5-志賀氏菌陽性樣本,6-志賀氏菌陽性樣本，7-志賀氏菌陰性樣本，8-志賀氏菌陰性樣本，9-志賀氏菌陰性樣本；圖5為紫外燈下靈敏度實驗觀察圖，圖中I-稀釋10 1倍,2-稀釋10 2倍,3-稀釋10 3倍，4-稀釋10 4倍,5-稀釋10 5倍,6_稀釋10 6倍，7-稀釋10 7倍,8-稀釋10 8倍,9-稀釋10 9倍， ο-稀釋 Kr1。倍；圖6為I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測靈敏度實驗結(jié)果圖，圖中I-DNA Marker, 2-稀釋 10 1 倍，3_ 稀釋 10 2 倍，4-稀釋10 3倍，5-稀釋10 4倍,6_稀釋10 5倍，7-稀釋10 6倍，8-稀釋10 7倍,9_稀釋10 8倍，10-稀釋 10 9 倍，11-稀釋 10 10 倍。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實驗指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社， 2001，細胞實驗指南；呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或按照制造廠商所建議的條件。實施例I :反應(yīng)體系組成a) LAMP 反應(yīng)液LAMP 反應(yīng)液由 LAMP IOXbuffer 2. 5 μ 1，20 μ mol/L 內(nèi)引物 FIP、BIP 各 2. O μ 1， 20ymol/L 夕卜引物 F3、Β3 各 I. 0μ l，25mmol/L dNTPs 3. O μ l,50mmol/L MgS043. 0 μ I, I. OmoI/L甜菜堿5 μ 1，Bst DNA聚合酶大片段I. O μ I，無菌雙蒸水2. O μ I組成，反應(yīng)液總體積 22. 5 μ I0b)突光顯色劑突光顯色劑是由10 μ mo I /T-20mmo1 /I,的隹丐黃綠素 1μ I 和 60 μ mol/L-0· Imo I/ LMnCl2 O. 5μ I 組成。
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實施例2 :利用本檢測方法檢測食品中沙門氏菌a、食物樣品預(yù)處理取3種被沙門氏菌污染的食物樣品和3種無污染食物樣本分別稱取25g (mL)放入 6個盛有225mT, BPff的無菌均質(zhì)杯中，以8000r/min 10000r/min均質(zhì)Imin 2min,或置于盛有225mL BPW的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打Imin 2min ;若樣品為液態(tài),不需要均質(zhì)，振蕩混勻即可；無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500mL錐形瓶中，如使用均質(zhì)袋，可直接進行培養(yǎng)，于36°C ±1°C培養(yǎng)4h ;如為冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在45°C以下不超過15min解凍。b、細菌模板DNA的制備分別取100 μ L細菌培養(yǎng)物，12000r/min離心2min，去上清，加入50 μ L無菌水，充分混勻，IOCTC水浴IOmin, 12000r/min離心2min,上清即為模板DNA。C、等溫擴增取1μ I步驟b中樣本上清分別加入到22.5μ I含有沙門氏菌內(nèi)外引物的 LAMP反應(yīng)液中，再加入1.5μ I熒光顯色劑，65°C恒溫擴增60min ;同時用標準陽性模板 pMD18-T-invA質(zhì)粒和無菌雙蒸水分別做陽性對照和陰性對照。d、結(jié)果判定在紫外燈下觀察，陽性樣本管顯示強熒光，陰性樣本管則不顯示熒光，取5 μ ILAMP 產(chǎn)物用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性樣本都有條帶，陰性樣本則無條帶(見圖I、圖2)。 圖I為沙門氏菌紫外燈下觀察結(jié)果，圖2為沙門氏菌I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。e、結(jié)論重復(fù)試驗3次，所得檢測結(jié)果相同，并且通過熒光顯色判斷的結(jié)果與瓊脂糖電泳的結(jié)果完全一致。說明其不同批次之間的檢測結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性，而且依據(jù)熒光顯色法判斷結(jié)果的方法可靠。①沙門氏菌外引物序列Sal F3 5/ -CGGCCCGATTTTCTCTGG-3'；Sal B3 5/ -CGGCAATAGCGTCACCTT-3'；②沙門氏菌內(nèi)引物序列Sal FIP 5/ -ATCCGCATCAATAATACCGGCCTTTGGTATGCCCGGTAAACAGA-3'；Sal BIP 5/ -GAACGGCGAAGCGTACTGGACATCGCACCGTCAAAGGAA—3'；③標準陽性模板pMD18-T_invA質(zhì)粒包含沙門氏菌invA基因5' -CCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGCGTCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGG ATGGTATGCCCGGTAMCAGATGAGTATTGATGCCGATTTGAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCTGCGCGCGAA-CGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTTTACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGC TATTGCCGGCATCATTATTATCTTTGTGAACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACCCGCCATGGTAT-3/ 。實施例3 :利用本檢測方法檢測食品中志賀氏菌a、食物樣品預(yù)處理取3種被志賀氏菌污染的食物樣品和3種無污染食物樣本分別稱取25g (mL)樣品放入6個盛有225mT, BPff的無菌均質(zhì)杯中，以8000r/min 10000r/min均質(zhì)Imin 2min, 或置于盛有225mL BPW的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打Imin 2min ;若樣品為液態(tài), 不需要均質(zhì)，振蕩混勻即可；無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500mL錐形瓶中，如使用均質(zhì)袋，可直接進行培養(yǎng)，于36°C ±1°C培養(yǎng)4h ;如為冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在45°C以下不超過15min解凍。b、細菌模板DNA的制備分別取100 μ L細菌培養(yǎng)物，12000r/min離心2min，去上清，加入50 μ L無菌水，充分混勻，10CTC水浴IOmin, 12000r/min離心2min,上清即為模板DNA。C、等溫擴增取Ιμ 步驟b中樣本上清分別加入到22. 5μ I含有志賀氏菌內(nèi)外引物的 LAMP反應(yīng)液中，再加入1.5μ I熒光顯色劑，65°C恒溫擴增60min ;同時用標準陽性模板 pMD18-T-ipaH質(zhì)粒和無菌雙蒸水分別做陽性對照和陰性對照。d、結(jié)果判定在紫外燈下觀察，陽性樣本管顯示強熒光，陰性樣本管則不顯示熒光；取 5 μ ILAMP產(chǎn)物用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性樣本都有條帶，陰性樣本則無條帶(見圖 3、圖4)。圖3為志賀氏菌紫外燈下觀察結(jié)果，圖4為志賀氏菌I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。e、結(jié)論重復(fù)試驗3次，所得檢測結(jié)果相同，并且通過熒光顯色判斷的結(jié)果與瓊脂糖電泳的結(jié)果完全一致；說明其不同批次之間的檢測結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性，而且依據(jù)熒光顯色法判斷結(jié)果的方法可靠。①志賀氏菌外引物序列Shi F3 5/ -TCTGGAGGACATTGCCCG-3'；Shi B3 5/ -GCTTCTGACCATGGCTTCG-3'；②志賀氏菌內(nèi)引物序列Shi FIP 5/ -GCATGGTCTGGAAGGCCAGGAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGG-3'；Shi BIP 5/ -TCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCCGGAGGTCATTTGCTGTCAC-3/ ；③標準陽性模板pMD18-T_ipaH質(zhì)粒包含志賀氏菌ipaH基因5 ' -CCTGGGCAGGGAAATGTTCCGCCTCGAAATTCTGGAGGACATTGCCCGGGATAAAGTCAGAACT CTCCATTTTGTGGATGAGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCCAGACCATGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCACTGC CGTGAAGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCGGGAGTGACAGCAAATGACCTCCGCACTGCCGAAGCCATGGTCAGAA GCCGTGAAGAGAATGA-3'。實施例4 :本檢測方法的靈敏度實驗a、取Iml過夜培養(yǎng)的沙門氏菌培養(yǎng)液做10倍倍比稀釋，稀釋至10_9 ;取每個稀釋度的菌液10 μ 1,12000r/min離心2min,去上清,加入50 μ L無菌水，充分混勻，100°C水浴 IOmin, 12000r/min 離心 2min,上清即為模板 DNA。b、等溫擴展取I μ I步驟a中樣本上清加入到22. 5 μ I含有沙門氏菌內(nèi)外引物的LAMP反應(yīng)液中，再加入I. 5μ I熒光顯色劑，65°C恒溫擴增60min ;同時用標準陽性模板 pMD18-T-invA質(zhì)粒和無菌雙蒸水分別做陽性對照和陰性對照；C、結(jié)果判定在紫外燈下觀察，稀釋倍數(shù)為KT1-KT8號的樣本管顯示強熒光，稀釋倍數(shù)為10_9-10,號的樣本管則不顯示熒光(見圖5);取5 μ I LAMP產(chǎn)物用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，稀釋倍數(shù)為10-1-10-8號的樣本管都有條帶，稀釋倍數(shù)為10-9-10-10號的樣本管則無條帶(見圖6)。圖5為紫外燈下靈敏度實驗觀察圖，圖6為I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測靈敏度實驗結(jié)果圖。d、結(jié)論結(jié)果顯示當菌液稀釋至10 8時仍能檢測出，最低檢測極限為50CFU/ ml ο上述實驗說明本發(fā)明具有良好的靈敏度?？傊?，本檢測方法特異性好，靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡便，結(jié)果肉眼可辨，而且對樣品的檢測僅需不到6個小時就能完成，而傳統(tǒng)的培養(yǎng)法約需I周左右才能完成，因此， 使用本檢測方法可以大大縮短檢測時間。本檢測方法的操作只需I人即可完成整個操作過程，一次可檢測多個(由實際檢測需要決定)樣品，這樣也減少了人力資源的浪費。
權(quán)利要求
1.一種基于LAMP的微生物目視化熒光顯色基因檢測方法，其特征在于包括下列步驟①用緩沖蛋白胨水(BPW)按照國標法培養(yǎng)待檢樣品4h；②用水煮法從待測樣品中提取DNA；③將DNA加入到LAMP反應(yīng)體系中，65°C保溫Ih；④通過與對照組比較，肉眼觀察待測樣品結(jié)果，對樣品進行定性分析。所述LAMP反應(yīng)體系包括LAMP反應(yīng)液和熒光顯色劑；a)LAMP反應(yīng)液LAMP 反應(yīng)液由 LAMP IOXbuffer 2. 5 μ 1，20 μ mol/L 內(nèi)引物 FIP、BIP 各 2. O μ 1， 20ymol/L 夕卜引物 F3、B3 各 I. O μ 1，25mmol/L dNTPs 3. O μ l,50mmol/L MgS043. 0 μ I,I.OmoI/L甜菜堿5 μ 1，Bst DNA聚合酶大片段I. O μ I，無菌雙蒸水2. O μ I組成，反應(yīng)液總體積 22. 5 μ I ；b)突光顯色劑突光顯色劑是由10 μ mol/L-20mmol/L的I丐黃綠素I μ I和60 μ mol/L-0. Imo I/ LMnCl2O. 5 μ I 組成。
2.按權(quán)利要求I所述的一種基于LAMP的微生物目視化熒光顯色基因檢測方法，其特征在于沙門氏菌外引物序列Sal F3，如SEQ NO. I所示；沙門氏菌外引物序列Sal B3，如SEQ NO. 2所示；沙門氏菌內(nèi)引物序列Sal FIPjn SEQ NO. 3所示；沙門氏菌內(nèi)引物序列Sal BIP JBSEQ NO. 4所示;標準陽性模板pMD18-T-invA質(zhì)粒包含沙門氏菌invA基因，如SEQ NO. 5所示。
3.按權(quán)利要求I所述的一種基于LAMP的微生物目視化熒光顯色基因檢測方法，其特征在于志賀氏菌外引物序列Shi F3，如SEQ NO. 6所示；志賀氏菌外引物序列Shi B3，如SEQ NO. 7所示；志賀氏菌內(nèi)引物序列Shi FIPJn SEQ NO. 8所示；志賀氏菌內(nèi)引物序列Shi BIP, SEQ NO. 9所示；標準陽性模板pMD18-T-ipaH質(zhì)粒包含志賀氏菌ipaH基因，如SEQ NO. 10所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于LAMP的微生物目視化熒光顯色基因檢測方法，涉及一種微生物基因檢測方法。本檢測方法是①用緩沖蛋白胨水(BPW)按照國標法培養(yǎng)待檢樣品4h；②用水煮法從待測樣品中提取DNA；③將DNA加入到LAMP反應(yīng)體系中，65℃保溫1h；④通過與對照組比較，肉眼觀察待測樣品結(jié)果，對樣品進行定性分析。本發(fā)明與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，檢測速度快，僅5h，加上樣品DNA的提取制備，總共不超過6h；特異性好，靈敏度高；步驟簡單，可重復(fù)性高；可同時進行多個樣品檢測。本發(fā)明可對微生物進行定性檢測，并可替代一直沿用的傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和血清學(xué)檢測方法。
文檔編號G01N21/64GK102586438SQ20121004771
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日
發(fā)明者盧暄, 王業(yè)富, 鄭虎 申請人:武漢大學(xué)