專利名稱：一種基于薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞分析技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及薄膜纖維材料的微流控芯片技術(shù)領(lǐng)域，特別提供了一種基于薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞分析技術(shù)。
背景技術(shù)：
微流控芯片實(shí)驗(yàn)室作為本世紀(jì)一項(xiàng)重要的科學(xué)技術(shù)已經(jīng)在包括化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)了其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，更因其同細(xì)胞尺寸匹配、環(huán)境同生理環(huán)境相近、傳熱傳質(zhì)快、通量高可以集成等特點(diǎn)而成為新一代細(xì)胞研究的重要平臺(tái)，隨著近二十年的發(fā)展，基于微流控芯片系統(tǒng)的細(xì)胞研究已經(jīng)有所突破，同細(xì)胞相關(guān)的多種應(yīng)用型研究已經(jīng)開始在芯片領(lǐng)域出現(xiàn)，其中細(xì)胞分析技術(shù)成為其中備受關(guān)注的重要分支研究?，F(xiàn)有階段的基于微流控芯片的細(xì)胞分析平臺(tái)大多是利用同生物相容性好的PDMS硅膠材料作為芯片材料，利用軟刻蝕技術(shù)形成微通道實(shí)現(xiàn)芯片內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)和各種生物物理、生物化學(xué)刺激以便得到在不同細(xì)胞外微環(huán)境下細(xì)胞的行為變化，諸如存活、增殖、凋亡、分化等。隨著微流控芯片制造技術(shù)的不斷發(fā)展，除了·上述利用PDMS硅膠作為材料的芯片外，利用紙制品、纖維素膜等薄膜纖維材料構(gòu)建新型的微流控“紙”芯片，因其具有工藝簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉、攜帶方便等多種優(yōu)勢(shì)逐漸成為微流控芯片制造領(lǐng)域的重要研究方面，特別是將其用于更為廣闊的細(xì)胞研究成為近期的熱點(diǎn)研究問(wèn)題之一。而利用該種新型微流控“紙”芯片進(jìn)行細(xì)胞分析還處于空白階段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞分析技術(shù)。本發(fā)明提供了一種基于薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞分析技術(shù)，該技術(shù)主要包括三個(gè)基本方面:第一個(gè)基本方面是薄膜纖維材料微流控芯片的制作技術(shù)，第二個(gè)基本方面是薄膜纖維材料微流控芯片的無(wú)菌處理技術(shù)與表面修飾，第三個(gè)基本方面是薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞培養(yǎng)、刺激與分析評(píng)價(jià)。本發(fā)明提供的基于薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞分析技術(shù)，該技術(shù)具體說(shuō)是利用噴蠟打印機(jī)在紙、硝酸纖維素膜上進(jìn)行蠟打印，使其表面形成圖案化微流控通道圖案，經(jīng)過(guò)一系列無(wú)菌處理后在其上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并給予細(xì)胞不同藥物配伍的藥物進(jìn)行刺激，利用細(xì)胞學(xué)常用的檢測(cè)方法對(duì)細(xì)胞的各種行為進(jìn)行分析。本發(fā)明以噴蠟打印機(jī)為主要加工器械，以紙、硝酸纖維素膜為芯片制作材料，利用噴蠟打印的方法在纖維薄膜材料表面形成親疏水性質(zhì)不同的圖案，并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、藥物刺激、生物學(xué)檢測(cè)等。該微流控芯片制作方法適用于多種纖維薄膜材料，方法簡(jiǎn)單易操作，圖案樣式靈化，制備后的“紙”芯片易于無(wú)菌消毒處理，可用于多種細(xì)胞的培養(yǎng)與多種藥物的刺激，具有一定的普適性。此外，在細(xì)胞試驗(yàn)過(guò)程中，由于微流控芯片本身所具有的特點(diǎn)，還具有細(xì)胞及試劑消耗量低等優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明提供的基于薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞分析技術(shù)，所述薄膜纖維材料微流控芯片的制作技術(shù)為利用噴蠟打印機(jī)將圖案印染在選定的薄膜纖維材料上。所述的薄膜纖維材料為打印紙、濾紙、纖維素膜、硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜中的一種或多種。所述的圖案可利用制圖軟件按照預(yù)設(shè)樣式進(jìn)行繪圖，可用的制圖軟件為Auto Computer AidedDesign (AutoCAD)、Macromedia Freehands CorelDRAW 中的一種或多種。本發(fā)明提供的基于薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞分析技術(shù)，所述薄膜纖維材料微流控芯片的無(wú)菌處理技術(shù)與表面修飾中的無(wú)菌處理技術(shù)包括紫外光照對(duì)薄膜材料兩面進(jìn)行照射消毒、臭氧消毒、根據(jù)材料本身性質(zhì)不同也可進(jìn)行高壓滅菌。所述薄膜纖維材料微流控芯片的無(wú)菌處理技術(shù)與表面修飾中的表面修飾為細(xì)胞貼附的薄膜纖維材料可被涂覆修飾，修飾方法為直接浸泡入可用于增加細(xì)胞貼附的試劑；其中可用于增加細(xì)胞貼附的試劑為以下試劑的一種或多種:一型膠原、二型膠原、四型膠原、層粘蛋白、纖維粘連蛋白、明膠。本發(fā)明提供的基于薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞分析技術(shù)，所述薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞培養(yǎng)、刺激與分析評(píng)價(jià)為先對(duì)進(jìn)行過(guò)表面修飾的薄膜微芯片進(jìn)行清洗，然后根據(jù)所選用的細(xì)胞類型采用相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)薄膜微芯片進(jìn)行浸泡，最后采用生物學(xué)上常用的細(xì)胞檢測(cè)手段對(duì)藥物刺激后的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。所述清洗所使用的溶液為無(wú)菌水、PBS、Hanks溶液中的一種或多種。所述細(xì)胞類型為腫瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞、干細(xì)胞中的一種。所述細(xì)胞培養(yǎng)基為高糖DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基、低糖DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、Alpha-MEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基中的一種。所述細(xì)胞檢測(cè)手段包括細(xì)胞死活標(biāo)記染色、免疫熒光染色、PCR檢測(cè)、蛋白質(zhì)檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是提供一種新型的基于薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞分析技術(shù)，其操作簡(jiǎn)便，成本低廉，試劑及細(xì)胞消耗量低，是一種可廣泛用于各種細(xì)胞分析的新技術(shù)。


圖1為硝酸纖維素膜材料微流控芯片示意圖；圖2為打印紙材料微流控芯片示意圖；圖3為薄膜纖維材料微流控芯片細(xì)胞顯微照片，其中，1:ACCM人涎樣囊性癌細(xì)胞，2 =GES人正常胃粘膜細(xì)胞，3:MSC小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；圖4為薄膜纖維材料微流控芯片細(xì)胞藥物刺激后熒光照片；圖5為薄膜纖維材料微流控芯片間充質(zhì)干細(xì)胞分化圖片，其中，1:成骨ALP染色結(jié)果，2:成脂肪Oi1-Red O染色結(jié)果。
具體實(shí)施例方式按照?qǐng)D1所示在電腦上用Freehand軟件進(jìn)行繪圖，利用噴蠟打印機(jī)將該圖案打印于硝酸纖維素薄膜上，將該圖案剪裁為22*22毫米大小的方塊并置于無(wú)菌6-孔板中，在無(wú)菌臺(tái)內(nèi)紫外雙面照射各12小時(shí)。用水配制10微克/毫升一型膠原溶液，并將其加入孔板中，使硝酸纖維素膜完全浸泡在其中，放置于37度培養(yǎng)箱中2個(gè)小時(shí)。用無(wú)菌PBS沖洗硝酸纖維素膜三次，靜置。加入2毫升1640培養(yǎng)基于孔板中，使硝酸纖維素膜完全浸沒，置于37度培養(yǎng)箱中備用。取長(zhǎng)勢(shì)良好的ACCM人涎樣囊性癌細(xì)胞進(jìn)行消化、傳代處理，按照沒孔IX IO5個(gè)/mL細(xì)胞將其接種 于備用的硝酸纖維素膜上，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，待24小時(shí)后細(xì)胞完全帖附，如圖3所示。換用含有藥物的條件培養(yǎng)基，條件培養(yǎng)基為分別含有O微摩爾每升、I微摩爾每升、5微摩爾每升的放射菌素D，藥物作用24小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞死活染色，細(xì)胞凋亡染色。采用羅丹明123、DAP1、PI三種物質(zhì)的染色，分別確定細(xì)胞線粒體膜電位、核大小、細(xì)胞死亡三種情況，以確定ACCM細(xì)胞的凋亡情況，如圖4所示。實(shí)施例1利用實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)并制作的微流控芯片，構(gòu)型如圖1所示。采用一型膠原進(jìn)行表面修飾后芯片接種ACCM細(xì)胞，接種密度I X IO5個(gè)/mL，24小時(shí)細(xì)胞貼壁之后換用含O微摩爾每升、I微摩爾每升、5微摩爾每升的放射菌素D的1640培養(yǎng)基，24小時(shí)之后細(xì)胞死活、凋亡等方面的相關(guān)染色，顯微鏡拍照，Image Pro軟件分析。其結(jié)果如圖3所示。實(shí)施例2利用實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)并制作的微流控芯片系統(tǒng)，構(gòu)型如圖2所示。采用層粘蛋白修飾后芯片接種GES，接種密度I X IO5個(gè)/mL，24小時(shí)細(xì)胞貼壁之后換用含O微摩爾每升、
I微摩爾每升、5微摩爾每升的放射菌素D的高糖DMEM培養(yǎng)基，24小時(shí)之后對(duì)細(xì)胞死活、凋亡等方面進(jìn)行染色，顯微鏡拍照，Image Pro軟件分析。實(shí)施例3利用實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)并制作的 微流控芯片系統(tǒng)，構(gòu)型如圖1所示。芯片接種小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，接種密度I X IO5個(gè)/mL，24小時(shí)細(xì)胞貼壁之后換用多種配伍的LG-DMEM+10%FBS+1 μ M地塞米松+胰島素成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，每天換液，7天之后成脂肪Oil Red染色，顯微鏡拍照，Image Pro軟件分析。其結(jié)果如圖5所示，間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生了不同情況的成脂肪、成骨分化。實(shí)施例4胚胎干細(xì)胞:利用實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)并制作的微流控芯片系統(tǒng)，其俯視圖如圖2所示。芯片接種小鼠胚胎干細(xì)胞，接種密度I X IO5個(gè)/mL，24小時(shí)細(xì)胞貼壁之后，每天換液，并施加不同時(shí)間的多種藥物刺激，分別為有道神經(jīng)分化、誘導(dǎo)骨分化、誘導(dǎo)脂肪分化的條件誘導(dǎo)分化劑，刺激7天之后可檢測(cè)到胚胎干細(xì)胞的分化情況，比如成骨分化、成神經(jīng)分化、成脂肪細(xì)胞分化等。
權(quán)利要求
1.一種基于薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞分析技術(shù)，其特征在于該技術(shù)主要包括三個(gè)基本方面第一個(gè)基本方面是薄膜纖維材料微流控芯片的制作技術(shù)，第二個(gè)基本方面是薄膜纖維材料微流控芯片的無(wú)菌處理技術(shù)與表面修飾，第三個(gè)基本方面是薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞培養(yǎng)、刺激與分析評(píng)價(jià)。
2.按照權(quán)利要求I所述基于薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞分析技術(shù)，其特征在于所述薄膜纖維材料微流控芯片的制作技術(shù)為利用噴蠟打印機(jī)將圖案印染在選定的薄膜纖維材料上。
3.按照權(quán)利要求2所述基于薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞分析技術(shù)，其特征在于所述的薄膜纖維材料為打印紙、濾紙、纖維素膜、硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜中的一種或多種。
4.按照權(quán)利要求2所述基于薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞分析技術(shù)，其特征在于所述的圖案可利用制圖軟件按照預(yù)設(shè)樣式進(jìn)行繪圖，可用的制圖軟件為AutoCAD、Freehand、CorelDRAW 中的一種或多種。
5.按照權(quán)利要求I所述基于薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞分析技術(shù)，其特征在于所述薄膜纖維材料微流控芯片的無(wú)菌處理技術(shù)與表面修飾中的無(wú)菌處理技術(shù)包括紫外光照射消毒、臭氧消毒、高壓滅菌。
6.按照權(quán)利要求I所述基于薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞分析技術(shù)，其特征在于 所述薄膜纖維材料微流控芯片的無(wú)菌處理技術(shù)與表面修飾中的表面修飾為將薄膜纖維材料直接浸泡入可用于增加細(xì)胞貼附的試劑中；其中可用于增加細(xì)胞貼附的試劑為以下試劑的一種或多種一型膠原、二型膠原、四型膠原、層粘蛋白、纖維粘連蛋白、明膠。
7.按照權(quán)利要求I所述基于薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞分析技術(shù)，其特征在于所述薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞培養(yǎng)、刺激與分析評(píng)價(jià)為先對(duì)進(jìn)行過(guò)表面修飾的薄膜微芯片進(jìn)行清洗，然后根據(jù)所選用的細(xì)胞類型采用相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)薄膜微芯片進(jìn)行浸泡，最后采用生物學(xué)上常用的細(xì)胞檢測(cè)手段對(duì)藥物刺激后的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。
8.按照權(quán)利要求7所述基于薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞分析技術(shù)，其特征在于所述的清洗所使用的溶液為無(wú)菌水、PBS、Hanks溶液中的一種或多種。
9.按照權(quán)利要求7所述基于薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞分析技術(shù)，其特征在于所述細(xì)胞類型為腫瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞、干細(xì)胞中的一種。
10.按照權(quán)利要求7所述基于薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞分析技術(shù)，其特征在于所述細(xì)胞檢測(cè)手段包括細(xì)胞死活標(biāo)記染色、免疫熒光染色、PCR檢測(cè)、蛋白質(zhì)檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞分析技術(shù)，該技術(shù)主要包括三個(gè)基本方面第一個(gè)基本方面是薄膜纖維材料微流控芯片的制作技術(shù)，第二個(gè)是薄膜纖維材料微流控芯片的無(wú)菌處理技術(shù)與表面修飾，第三個(gè)是薄膜纖維材料微流控芯片的細(xì)胞培養(yǎng)、刺激與分析評(píng)價(jià)；本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便，成本低廉，試劑及細(xì)胞消耗量低等優(yōu)點(diǎn)，是一種可廣泛用于各種細(xì)胞分析的新技術(shù)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK103255195SQ201210037430
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2012年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月20日
發(fā)明者秦建華, 高興華, 張敏, 張旭, 馬慧朋 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所