專利名稱：生脈注射液的質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥注射劑的質(zhì)量控制方法，具體是指生脈注射液的質(zhì)量控制方法。本質(zhì)量控制方法包括含量測定方法及特征峰的定性和定量方法。
背景技術(shù)：
生脈注射液的處方源自古方生脈散，由紅參、麥冬、五味子三味藥材經(jīng)過提取后制成的滅菌水溶液。該品種最初由華西醫(yī)科大學(xué)研制，現(xiàn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十五冊(WS3-B-2865-98)，2001年被列為國家中藥保護(hù)品種?，F(xiàn)階段可生產(chǎn)生脈注射 液的企業(yè)有十余家，已申請該品種中藥保護(hù)的企業(yè)有8家。由于其在臨床上用于治療氣陰兩虧，脈虛欲脫的心悸、氣短、四肢厥冷、汗出、脈欲絕及心肌梗塞、心源性休克、感染性休克等具有上述證候者所取得的良好的效果。其應(yīng)用也越來越廣泛。但是隨著臨床研究的不斷深入及國家關(guān)于中藥注射劑安全性再評價工作的展開，對于生脈注射液的質(zhì)量控制的研究越來越深入。生脈注射液主要是由三味藥紅參、麥冬及五味子制成。其組成成分復(fù)雜，人參中的成分就分為9類，主要成分為皂苷、糖類。楊華元等用薄層掃描法測及采用薄層層析-比色法測定生脈注射液中有效成分人參總皂苷含量。隨著研究技術(shù)的不斷發(fā)展，高效液相色譜法在測定物質(zhì)的含量應(yīng)用越來越廣泛。王秀蘭等采用高效液相色譜法測定生脈注射液中人參皂苷Rgl，Re的含量，色譜柱為用十八烷基硅烷鍵合相柱，流動相為乙睛一0.05%磷酸溶液(18 82)，檢測波長203nm，并對萃取方法進(jìn)行了探討。張梅等高效液相色譜法測定生脈注射液中人參皂甙Rbl的含量。其流動相為乙腈-甲醇-水(255 744 11)，用磷酸調(diào)pH至3.0，柱溫30°C，流速為0.8ml/min,檢測波長205nm，量程0. 02A UFS0聞俐毓等用HPLC法測定生脈注射液中人參皂苷Re的含量，以C18柱，乙睛-0.05%磷酸(19 81)為流動相，檢測波長203nm。石雪萍等采用HPLC法測定生脈注射液中五味子醇甲的含量，流動相為甲醇-水￠5 35)為流動相，紫外檢測波長254nm進(jìn)行測定,柱溫30°C,流速I. Oml/min。于敏等建立新生脈注射液中人參阜苷Rg2的含量測定方法，采用高效液相法，色譜柱為C18柱，流動相為甲醇-水￠5 35)，檢測波長203nm，流速I. Oml/min,柱溫為25°C。王琴等采用RP-HPLC測定生脈注射液中皂苷Rbl含量。張伶等建立測定生脈注射液中人參皂苷Rgl和Re含量的RP-HPLC分析方法.以RP-C18色譜柱為固定相，以乙腈-磷酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%) (19 81)為流動相，檢測波長為203nm，流速為I. OmL/min。白晶等采用RP-HPLC法同時測定生脈注射液中人參皂苷及Rbl與五味子醇甲的含量。李章萬等用3，5-二硝基苯甲酞氯(3，5-DNB)為衍生化劑，以高效液相色譜衍生化法測定紅參及生脈注射液中人參二醇和人參三醇的含量，供試品經(jīng)提取，水解和衍生化等處理后，測得紅參中人參二醇及人參三醇的含量約為0. 9%和0. 5%;生脈注射液中分別約為0. 7mg/ml和0. 5mg/ml，甲醇-水(95 5)為流動相，檢測波長230nm。在衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十五冊(WS3-B-2865-98)生脈注射液標(biāo)準(zhǔn)中的含量測定規(guī)定了人參皂甙Re及Rgl的測定，根據(jù)以上研究還應(yīng)該對其它成分的含量(例如五味子醇甲)進(jìn)行測定。隨著指紋圖譜技術(shù)在中藥材質(zhì)量控制中的應(yīng)用，對于生脈注射液的指紋圖譜的也有研究。夏晶等以 Waters symmetryshield TM-RP18 (4. 6mmX 250mm ;5. 0 u m)色譜柱為分析柱，以乙腈(A).水(B)為流動相，梯度洗脫，0 30min(B :100 — 90% ) ；30 40min(B 90 — 77%) ;40 50min(B :77% ) ;50 85min (B :77 — 40% ) ;85 95min(B 40^0% )；95 105min(B 0% ) ; 105 115 min(B 0 — 100% );檢測波長為 203nm。應(yīng)用 HPLC 色譜法建立了生脈注射液(紅參、麥冬、五味子)的指紋圖譜。并應(yīng)用LC-MS/MS法，以Waterssymmetryshield TMRP-RP18 (4. 6mmX 250mm ；5. 0 u m)色譜柱為分析柱，以乙腈-水為流動相，梯度洗脫；檢測波長為203nm。離子阱質(zhì)譜。對生脈注射液20個特征峰進(jìn)行確認(rèn)，使其中的10個特征峰得到了確認(rèn)。目前該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于生脈的質(zhì)量控制。2004年I月I日至2011年9月30日，國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心病例報告數(shù)據(jù)庫共收到生脈注射液嚴(yán)重不良反應(yīng)/事件病例報告508例。嚴(yán)重不良反應(yīng)/事件病例報告 中，過敏反應(yīng)問題較為突出，臨床主要表現(xiàn)為過敏性休克、嚴(yán)重過敏樣反應(yīng)、呼吸困難、喉水腫、剝脫性皮炎等。其中表現(xiàn)為過敏性休克的90例，表現(xiàn)為嚴(yán)重過敏樣反應(yīng)的89例，過敏性休克和嚴(yán)重過敏樣反應(yīng)共計179例，約占嚴(yán)重病例的35. 2%?；谝陨锨闆r，國家食品藥品監(jiān)督管理局建議中強(qiáng)調(diào)了要完善生產(chǎn)工藝、提高產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并開展相應(yīng)的安全性研究。本發(fā)明對于提高產(chǎn)品質(zhì)量及為進(jìn)行相應(yīng)的安全性研究奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種多指標(biāo)成分定性定量控制生脈注射液質(zhì)量的方法。該方法簡便易行，可以直接對生脈注射液進(jìn)行6種成分進(jìn)行定性和定量分析，且方法具有良好的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性。為實現(xiàn)本發(fā)明，提供如下技術(shù)方案A.供試液樣品的制備方法取生脈注射液，過0.45 y微孔濾膜后備用；B.對照溶液的制備取人參皂苷Rf 、人參皂苷Rbl、人參皂苷Re、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rd和五味子醇甲對照品適量，精密稱定，加甲醇制成混合溶液，即得；C.液相檢測條件固定相采用C18 ;柱溫30°C，以乙腈為流動相A，以0. 05%磷酸水為流動相B，按梯度洗脫；檢測波長為203nm。液相色譜法中梯度洗脫條件為0 10分鐘，26%乙腈；10 45分鐘，26%—32%乙腈；45 60分鐘，32%—40%乙腈;60 70分鐘，40%—60%乙腈;70 72分鐘，60%—100%乙腈；72 90分鐘，100%乙腈。上述方法優(yōu)選的技術(shù)方案為A.供試液樣品的制備方法取生脈注射液，過0. 45 y微孔濾膜后備用；B.對照品溶液的制備方法取人參皂苷Rf、人參皂苷Rbl、人參皂苷Re、人參皂苷Rb2、人參阜苷Rd和五味子醇甲對照品適量,精密稱定，加甲醇制成每Iml分別含0. 05mg、0. 20mg、0. 10mg、0. 10mg、0. IOmg 和 0. 02mg 的混合溶液；C.液相檢測條件固定相采用C18柱；柱溫30°C，以乙腈為流動相A，以0. 05%磷酸水為流動相B，按梯度洗脫；檢測波長為203nm。流動相流速I. Oml/min,紫外檢測器檢測,進(jìn)樣量20 ii I,運行90min。
液相色譜法中梯度洗脫條件為0 10分鐘，26%乙腈；10 45分鐘，26%—32%乙腈；45 60分鐘，32%—40%乙腈;60 70分鐘，40%—60%乙腈;70 72分鐘，60%—100%乙腈；72 90分鐘，100%乙腈。上述固定相米用的C18柱為Waters symmetry shieldTM RP18色譜柱，4. 6mmX 250mm ；5. 0 u m。從色譜圖中得到色譜峰分別為人參皂苷Rf、人參皂苷Rbl、人參皂苷Re、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rd和五味子醇甲。見附圖I。
本發(fā)明生脈注射液的質(zhì)量控制方法有益之處與現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)相比具有測定條件較簡單、測定成分較多、方法的精密度、重復(fù)性等均較好的優(yōu)點。本發(fā)明的供試品制備簡便，對峰的定性和定量較為準(zhǔn)確。本測定方法簡便易行，為生脈的質(zhì)量控制檢測節(jié)省時間與步驟，為企業(yè)檢測化驗降低成本。


圖I生脈注射液6種成分含量測定色譜2不同的流動相梯度對峰的影響圖3不同的流速對峰的影響圖4生脈注射液中6個峰及其保留時間
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。實施例I :10批生脈注射液質(zhì)量控制方法確定I. I儀器與試劑儀器Agilent1100高效液相色譜，G1322A DEGASSER，G1311A QUAT PUMP，G1313AALS檢測器G1314A VWD檢測器工作站LC系統(tǒng)化學(xué)工作站柱溫箱HCT-360HPLC COLUMN COOLER/HEATER色譜柱Waterssymmetry shieldTM RP18 色譜柱(4. 6mmX 250mm ;5. 0 U m)檢測波長203nm ;流速為I. Oml/min ;柱溫30°C ;進(jìn)樣量20 yl。試劑乙腈為色譜純(product of Tedia，USA)，其它試劑均為分析純，水為飲用純凈水。對照品人參皂苷Rbl :四川維克奇生物科技有限公司，HPLC彡98%，批號110323 ；人參皂苷Rb2 :四川維克奇生物科技有限公司，HPLC彡98%，批號101114 ;人參皂苷Re :四川維克奇生物科技有限公司，HPLC彡98%，批號110604 ；人參皂苷Rd :四川維克奇生物科技有限公司，HPLC彡98%，批號110801 ；人參皂苷Rf :四川維克奇生物科技有限公司，HPLC彡98%，批號110904 ；五味子醇甲中國藥品生物制品檢定所，批號110857-201010。供試品
生脈注射液江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號10070504、10030304、10062504、09031904、11031205、10043003、10051909、10040805、10121503、10102804。I. 2色譜條件優(yōu)化I. 2. I檢測波長的選擇據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)及《生脈注射液修訂標(biāo)準(zhǔn)(草案)》中的含量測定方法，測定人參中所含特征成分人參皂苷的波長均為203nm。在對生脈注射液的指紋圖譜研究中發(fā)現(xiàn)隨著波長的增加，色譜峰減少且峰面積變小，在203nm波長處色譜峰數(shù)最多且峰響應(yīng)值最高，故選擇人參皂苷Rf、人參皂苷Rbl、人參皂苷Re、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rd和五味子醇甲的檢測波長為203nm。
I. 2. 2流動相篩選《生脈注射液修訂標(biāo)準(zhǔn)(草案)》中的含量測定方法中以乙腈-水為流動相。而文獻(xiàn)中報道流動相為乙腈-水相和乙腈-0. 05%磷酸水。為了考查兩個流動相對本含量測定方法的影響，進(jìn)行了這2個流動相體系的考查。(I)乙腈-0.05%磷酸水梯度，0 15min,乙臆 23% ;15 30min,乙臆 23 — 29% ；30 50min,乙臆 29% ；50 65min,乙臆 29 — 34%;71 — 66min,乙臆 65 70%；34 — IOOmin,乙臆 66 — 0% IOOmin,
乙腈0%。(2)乙腈-0.05%磷酸水梯度0 15min,乙臆 23% ;15 30min,乙臆 23 — 30% ；30 50min,乙臆 30% ；50 60min,乙臆 30 — 34% ；60 70min,乙臆 34 — 100% ；70 80min,乙臆 100%(3)乙腈-0.05%磷酸水梯度0 15min,乙臆 23% ;15 30min,乙臆 23 — 29% ；30 55min,乙臆 29% ；55 70min,乙臆 29 — 34% ；70 80min,乙臆 34 — 100% ；80 90min,乙臆 100%。(4)乙腈-0.05%磷酸水梯度0 IOmin,乙臆 26 ; 10 45min,乙臆 26 — 32 ;45 60min,乙臆 32 — 100 % ；60 70min,乙臆 100 %。(5)乙腈-0.05%磷酸水梯度 0 IOmin,乙臆 25; 10 45min,乙臆 25 — 32;45 55min,乙臆 32 — 60;55 65min,乙臆 60 — 100 % ；65 ~ 80min,乙臆 100 %。(6)乙腈-0.05%磷酸水梯度0 IOmin,乙臆 26; 10 45min,乙臆 26 — 32;45 60min,乙臆 32 — 40;60 70min，乙腈 40 — 60% ；70 72min，乙腈 60 — 100% ；72 90min，乙腈 100%。(7)乙腈-水梯度0 IOmin,乙臆 26 ; 10 45 min,乙臆 26 — 32 ;45 60min,乙臆 32 — 40 ;60 70min，乙腈 40 — 60% ；70 72min，乙腈 60 — 100% ；72 90min，乙腈 100。結(jié)果顯示乙腈-0. 05%磷酸水體系中的梯度6的色譜峰較好，其分離度均各個峰符合要求。相對于乙腈-水流動相體系相比峰較好，并且色譜柱的平衡時間較短。見附圖2。I. 2. 3柱溫的選擇
在25°C、30°C、35°C柱溫下分析樣品，結(jié)果每個條件下各測試兩次。主峰的拖尾因子不大于2. 0，主峰與雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離；各條件下的含量數(shù)據(jù)(η = 6)的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于3. 0%。但柱溫過高，對色譜柱中填料會有不利影響，引起樣品中不穩(wěn)定成分的變化，綜合考慮各方面因素，色譜分析柱溫選擇30°C。1.2.4流速的選擇考查流速為O. 8ml/min, I. Oml/min, I. 2ml/min時儀器色譜行為的變化,其結(jié)果是流速對于峰的分離度有重要影響，流速為O. 8ml/min和I. 2ml/min時峰的分離度不好。結(jié)果見附圖3I. 2. 5圖譜峰的指認(rèn)根據(jù)前期的實驗結(jié)果，對單個的對照品進(jìn)行進(jìn)樣，根據(jù)保留時間，確定其特征峰。 結(jié)果見附圖4。實施例2生脈注射液質(zhì)量控制方法論證I. I系統(tǒng)適用性實驗取6份供試品溶液按照高效液相色譜法進(jìn)行測定，考查6個待測成分峰的峰面積、 保留時間、峰的拖尾因子及理論塔板數(shù)等。結(jié)果6個峰的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差均不大于 2. 0%，6個峰保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)差均不大于I. 0%。各峰的拖尾因子不得大于2. O，6個峰達(dá)到基線分離，主峰的理論塔板數(shù)均大于20000。具體結(jié)果見表I、表2。表I生脈注射液含量測定系統(tǒng)適用性結(jié)果(峰面積)
權(quán)利要求
1.一種生脈注射液的質(zhì)量控制方法，其特征在于包括如下步驟 A.供試液樣品的制備方法取生脈注射液，過O.45 μ微孔濾膜后備用； B.對照品溶液的制備方法取人參皂苷Rf、人參皂苷Rbl、人參皂苷Re、人參皂苷Rb2、人參阜苷Rd和五味子醇甲對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每Iml分別含O. 05mg、O. 20mg、0. 10mg、0. 10mg、0. IOmg 和 0. 02mg 的混合溶液； C.液相檢測條件固定相采用C18;柱溫30°C，以乙腈為流動相A，以O(shè). 05%磷酸水為流動相B，按梯度洗脫，檢測波長為203nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的質(zhì)量控制方法，其特征在于C18色譜柱是WaterssymmetryshieldTM RP18 色譜柱。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的質(zhì)量控制方法，其特征在于梯度洗脫條件是0 10分鐘，26 %乙腈；IO 45分鐘，26 % — 32 %乙腈；45 60分鐘，32 % — 40 %乙腈；60 70分鐘，40%— 60%乙腈；70 72分鐘，60%— 100%乙腈；72 90分鐘，100%乙腈。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的質(zhì)量控制方法，其特征在于測定有6個特征峰，圖譜總長度為90mino
5.根據(jù)權(quán)利要求6所述的質(zhì)量控制方法，其特征在于圖譜中特征峰分別為人參皂苷Rf、人參皂苷Rb I、人參皂苷Re、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rd和五味子醇甲。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種注射液的質(zhì)量控制方法。特別涉及生脈注射液的質(zhì)量控制方法。本發(fā)明提供了一種采用高效液相色譜法控制生脈注射液制劑的質(zhì)量的方法，該方法能夠快速準(zhǔn)確的對生脈注射液中的人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rd和五味子醇甲進(jìn)行精確的定性和定量分析。本發(fā)明提供的質(zhì)量控制方法具有良好的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性，能夠更全面、有效、簡便的達(dá)到控制生脈注射液質(zhì)量的目的。
文檔編號G01N30/88GK102706998SQ20121003321
公開日2012年10月3日 申請日期2012年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月15日
發(fā)明者夏振江, 戴德玲, 歐陽強(qiáng), 沙美 申請人:江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司