專利名稱：一種快速篩檢動(dòng)物食品樣中抗菌藥物殘留的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗菌藥物殘留檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)屬于一種利用細(xì)菌的生長(zhǎng)受到被檢樣品中抗菌藥物抑制而快速篩檢食品樣品中青霉素藥物殘留的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
抗菌藥物殘留一直是困擾食品安全的嚴(yán)重問(wèn)題。青霉素類藥物是一類重要的 β_內(nèi)酰胺類抗生素，因其高效、低毒是目前獸醫(yī)學(xué)臨床上應(yīng)用最受青睞的藥物之一由于該類藥物的廣泛使用，使其在動(dòng)物源性食品上的殘留現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重，雖然青霉素類藥物本身對(duì)機(jī)體沒(méi)有很強(qiáng)毒性，但容易引起藥物過(guò)敏反應(yīng)，是各類過(guò)敏藥物之最同時(shí)，若長(zhǎng)期食用低濃度該類抗生素，會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，菌群失調(diào)，導(dǎo)致人體免疫力降低此外，還給動(dòng)物源性食品生產(chǎn)加工帶來(lái)不可估計(jì)的損失因此，建立針對(duì)青霉素類藥物殘留的快檢測(cè)方法， 開發(fā)價(jià)格適中的試劑盒產(chǎn)品對(duì)控制動(dòng)物源性食品衛(wèi)生質(zhì)量、保障消費(fèi)者健康、保證工業(yè)生產(chǎn)等具有重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義。目前，針對(duì)食品抗菌素殘留一般有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、分光光度計(jì)、化學(xué)發(fā)光法、酶抑制法、毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)等。用上述方法檢測(cè)存在儀器設(shè)備復(fù)雜、樣本前處理和測(cè)定操作繁瑣的缺陷，設(shè)備成本大，檢測(cè)費(fèi)用高，對(duì)檢測(cè)人員的要求也高，不適合大量樣本篩檢，不利于在基層食品檢測(cè)部門推廣應(yīng)用。開發(fā)一種操作方便、費(fèi)用低、可靠、可用大量檢測(cè)樣品中青霉素藥物殘留的檢測(cè)方法勢(shì)在必行。微生物檢測(cè)法是根據(jù)抗菌物質(zhì)對(duì)微生物的生理機(jī)能及代謝的抑制作用來(lái)定性或定量確定樣品中的抗菌物質(zhì)殘留，具有快速、敏感、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)。通常在被檢測(cè)樣中培養(yǎng)對(duì)抗生素敏感的微生物，如果樣品中沒(méi)有抗生素存在，由于微生物的生長(zhǎng)可以觀察到培養(yǎng)基變混濁、不透明或由于微生物產(chǎn)酸導(dǎo)致指示劑顏色變化；如果有抗生素或其他抑菌物質(zhì)存在則會(huì)觀察到培養(yǎng)基上有抑菌圈形成或培養(yǎng)基仍舊透明，或沒(méi)有顏色變化。目前，牛奶等液體樣的抗菌藥物殘留微生物檢測(cè)法主要有氯化三苯基四氮哇法，并已列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。但該方法的具體操作過(guò)程中，干擾因素多；待檢的食品樣品往往帶有固有微生物或外來(lái)微生物， 不能保證待檢樣品無(wú)菌狀態(tài)，這些微生物的存在會(huì)嚴(yán)重影響微生物檢測(cè)法。比如剛采集的生牛乳含有細(xì)菌，在溫度適宜的條件下，細(xì)菌繁殖很快，而且菌相出現(xiàn)交替演變的現(xiàn)象。一般剛采集的生牛乳的PH是中性，含有豐富的乳糖，有利于生牛乳中自然存在的乳酸細(xì)菌，例如乳鏈球菌(Streptococcus lactis)很快地繁殖。它們發(fā)酵乳糖產(chǎn)生乳酸，使牛乳的PH降低，并引起蛋白質(zhì)凝結(jié)成乳酪狀。低pH最終也抑制了乳鏈球菌的繁殖，被能耐受更低PH的的菌種乳桿菌(Lactobacillus)所代替，它們完成乳糖發(fā)酵，并使 PH更加降低。在這種低pH條件下酵母菌利用乳酸而生長(zhǎng)。隨著乳糖和乳酸的減少，pH再度上升，大部分假單孢菌(Pseudomonas)和芽孢桿菌(Bacillus)生長(zhǎng)繁殖。待檢的食品樣品還不能采用滅菌的方法，因?yàn)檫@樣會(huì)影響食品品質(zhì)；無(wú)菌技術(shù)，是微生物學(xué)的基本要求，這樣的現(xiàn)實(shí)情況就給才用微生物檢測(cè)法檢測(cè)法帶來(lái)很大問(wèn)題這些干擾微生物來(lái)源不清，種類繁多，嚴(yán)重影響檢測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)(抑制或促進(jìn)檢測(cè)微生物的生長(zhǎng))，或者干擾微生物大量繁殖影響到酸堿指示劑的指示結(jié)果，對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響很大，會(huì)產(chǎn)生假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)在推廣使用過(guò)程中存在的上述缺陷，提供一種不需要特定大型分析儀器設(shè)備，具有靈敏度高、可信度高、使用方法簡(jiǎn)單的篩檢方法，使其能有效降低牛奶等動(dòng)物食品樣品中固有微生物等雜菌干擾，減少產(chǎn)生假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一株對(duì)青霉素藥物敏感性高并應(yīng)用于青霉素藥物檢測(cè)的短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve) LJM-006 CGMCC No. 5418。本發(fā)明的短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve) LJM-006,于 2011 年 10 月 28 日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡(jiǎn)稱為CGMCC(地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 5418。本發(fā)明的短雙歧桿菌LJM-006分離于一名浙江省健康青年人糞便中。本發(fā)明的短雙歧桿菌LJM-006菌株具有下述微生物學(xué)特征(I)菌落形態(tài)LJM_006菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光澤、表面光滑、凸起、質(zhì)地軟、邊緣整齊，直徑1-1. 5_。(2)個(gè)體形態(tài)為不規(guī)則G+無(wú)芽孢桿菌，有直桿、彎桿、火柴頭狀、啞鈴形狀和大雁狀，其中以大雁狀為主。(3)生理生化特征D_核糖(+) ;L-阿拉伯糖(-);乳糖(+);纖維二糖(-);松三糖 (+);棉籽糖(+);山梨醇(-);淀粉(-);葡萄糖酸鈉(-);木糖(-);甘露糖(+);果糖(+); 半乳糖(+);蔗糖(+);麥芽糖(+);海藻糖(-);密二糖(+);甘露醇(+);菊糖(-);水楊素 (-);F6PPK酶(+);對(duì)氧的反應(yīng)(在好氣固體培養(yǎng)基上不生長(zhǎng))；硝酸鹽還原(_);觸酶(_)； 靛基質(zhì)反應(yīng)(_)。厭氧下生長(zhǎng)良好，有氧環(huán)境中不生長(zhǎng)。最適生長(zhǎng)溫度37_41°C ;最低生長(zhǎng)溫度 25-280C ;最高 43-450C ;生長(zhǎng)最適 pH 6. 5-7. 0 ;在 pH4. 5-5. 0 或 8. 0-8. 5 不生長(zhǎng)。LJM-006菌株與同屬同種標(biāo)準(zhǔn)菌株相比對(duì)青霉素藥物敏感性提高了 100倍以上。本發(fā)明還提供一種食品中抗菌藥物殘留的檢測(cè)方法，所述方法包括以下步驟(I)菌株活化將短雙歧桿菌LJM-006菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的PH值至6. 8 7. 2，于35 37°C下進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，并進(jìn)行轉(zhuǎn)種繼代培養(yǎng)；(2)菌懸液制備取步驟(I)所得短雙歧桿菌LJM-006接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，35±2°C厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，用滅菌生理鹽水將菌苔洗下，制成懸液，調(diào)整其OD6tltl值至 0. 25 0. 35，置2-8 °C冰箱中保存；(3)檢測(cè)管制備以重量計(jì)，取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸鈉 5g，K2HPO4 2g，MgSO4 7H20 0. 5g，MnSO4 4H20 0. 2g，低聚果糖 3g，檸檬酸二銨 2g，吐溫-80 lmL，蒸餾水1L，加熱溶解校正pH值至6.5，115°C高壓滅菌15-20分鐘，冷卻溫度為 50 65°C，并迅速取IOmL上述液體，注入IOmL試管內(nèi)，作為測(cè)試菌液待用；(4)樣品前處理取待檢的動(dòng)物食品樣品勻漿組織5g，用無(wú)菌I %磷酸鹽緩沖液20mL稀釋,鏇潤(rùn)混勻，于80°C水浴加熱5min,冷卻后于5，000r/min離心15min,取上清液作
為供試樣品液；(5)樣品檢測(cè)參照TTC法，檢驗(yàn)動(dòng)物食品中抗生素的殘留量。取步驟⑷所得供試樣品液20 100 μ L加到步驟(3)所述檢測(cè)管中，密閉封口后于35±2°C厭氧培養(yǎng)8 10小時(shí)，加TTC O. 3mL，36±l°C水浴培養(yǎng)30min，根據(jù)顯色狀態(tài)判定試驗(yàn)結(jié)果檢樣呈乳的原色時(shí)為陽(yáng)性，呈紅色為陰性。本發(fā)明的工作菌株為短雙歧桿菌LJM-006，已于2011年10月28日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 5418。本發(fā)明所述的動(dòng)物性食品樣品包括牛奶、豬肉、牛肉、雞肉、雞蛋等。表I顯色狀態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)
權(quán)利要求
1.一種快速篩檢動(dòng)物食品樣中抗菌藥物殘留的檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)菌株活化將雙歧桿菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的PH值至6.8 7. 2，于35 37°C下進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，并進(jìn)行轉(zhuǎn)種繼代培養(yǎng)；(2)菌懸液制備取步驟(I)所得雙歧桿菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，35±2°C厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，用滅菌生理鹽水將菌苔洗下，制成懸液，調(diào)整其0D_值至O. 25 O. 35，置 2-8 °C冰箱中保存；(3)檢測(cè)管制備以重量計(jì)，取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸鈉 5g，K2HPO4 2g，MgSO4 · 7H20 O. 5g，MnSO4 · 4H20 0. 2g，低聚果糖 3g，檸檬酸二銨 2g，吐溫-80 ImL,蒸餾水1L，加熱溶解校正pH值至6. 5，115°C高壓滅菌15-20分鐘，冷卻溫度為50 650C，并迅速取IOmL上述液體，注入IOmL試管內(nèi)，作為測(cè)試待用；(4)樣品前處理取待檢的動(dòng)物食品樣品勻漿組織5g，用無(wú)菌I%磷酸鹽緩沖液20mL 稀釋，鏇潤(rùn)混勻，于80°C水浴加熱5min,冷卻后于5,000r/min離心15min,取上清液作為供試樣品液；(5)樣品檢測(cè)參照TTC法，檢驗(yàn)動(dòng)物食品中抗生素的殘留量。取步驟(4)所得供試樣品液20 100 μ L加到步驟(3)所述檢測(cè)管中，密閉封口后于35±2°C厭氧培養(yǎng)8 10小時(shí)，加TTCO. 3mL，36±l°C水浴培養(yǎng)30min，根據(jù)顯色狀態(tài)判定試驗(yàn)結(jié)果檢樣呈乳的原色時(shí)為陽(yáng)性，呈紅色為陰性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述雙歧桿菌為短雙歧桿菌LJM-006菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述抗菌藥物為青霉素。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述動(dòng)物食品為牛奶、豬肉、牛肉、雞肉、雞蟲寸ο
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速篩檢動(dòng)物食品樣中抗菌藥物殘留的檢測(cè)方法，它包括菌株活化，菌懸液制備，檢測(cè)管制備，樣品前處理，樣品檢測(cè)；利用抗菌藥物能抑制對(duì)它敏感的細(xì)菌生長(zhǎng)或繁殖的原理，吸取待檢樣品加入檢測(cè)管中，培養(yǎng)一定時(shí)間，根據(jù)檢測(cè)管內(nèi)培養(yǎng)基顏色的變化判斷樣品中是否含有抗菌藥物殘留。與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明保持了TTC檢測(cè)法可靠性的基礎(chǔ)上解決了該方法中的食品樣品中固有微生物或雜菌干擾所造成的假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果的問(wèn)題；具有檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、干擾小、靈敏度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，適用于動(dòng)物食品樣品中抗菌藥物殘留的高通量快速篩選檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N21/78GK102590196SQ20121001420
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月6日
發(fā)明者劉佳明, 夏思思, 張志鵬, 樊曉閣, 胡瑜 申請(qǐng)人:溫州醫(yī)學(xué)院