專利名稱：用于凝血酶檢測的免疫測定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于在包含抗凝血酶III(AT-1II)的樣品中對凝血酶進行定量的免疫測定法。
背景技術(shù)：
凝血酶(α-凝血酶)為內(nèi)切型絲氨酸蛋白酶，其在凝血級聯(lián)或血栓形成中起重要作用。凝血酶由酶原凝血酶原酶切產(chǎn)生。酶切由活化因子x(因子Xa)執(zhí)行。人凝血酶由輕鏈(具有約6kDa的分子量)和重鏈(具有約31kDa的分子量)組成。凝血酶包括位于重鏈內(nèi)的活性位點。凝血酶對含有精氨酸鍵的蛋白底物具有高度特異性，并且其主要底物為纖維蛋白原。凝血酶結(jié)合纖維蛋白原并且將其轉(zhuǎn)化為血纖維蛋白。凝血酶還活化蛋白C、血小板、因子XIII和血漿羧肽酶原B(TAFI)。正常情況下，凝血酶活性在血漿中受到抑制。血漿中存在的凝血酶的主要抑制劑為抗凝血酶ΙΠ(ΑΤ-ΙΙΙ)，并且在更小范圍內(nèi)講為肝素輔因子II。在最佳濃度的肝素存在下，這兩種抑制劑的抑制率大幅增加。凝血酶的其他生理抑制劑為α 2-巨球蛋白和α 1-抗胰蛋白酶1-4。AT-1II通過結(jié)合凝血酶和因子Xa來抑制凝血級聯(lián)。AT-1II的抑制活性由于肝素的存在而顯著增加。人血漿中的正?？鼓窱II濃度較高并且為大約0.12mg/ml。由于凝血酶被誘捕到具有AT-1II的等摩爾復合物中，因此發(fā)生凝血酶失活。復合物的形成阻止凝血酶的活性位點接近其底物。抗凝血酶II1-凝血酶復合物的形成涉及凝血酶與AT-1II內(nèi)的特異性活性肽鍵之間的相互作用。在人AT-1II中，該鍵介于精氨酸(arg)393和絲氨酸(ser)394之間。循環(huán)中凝血酶的異常高水平可觸發(fā)凝血級聯(lián)，因此導致廣義的凝血功能障礙。生物醫(yī)學方面相當關(guān)注能夠快速定量確定受試生物樣品(例如，血樣)中凝血酶水平的方法。人和動物模型血漿中凝血酶的快速定量分析對于包含凝血酶的止血劑的實驗和常規(guī)用量的安全性評估也可能非常重要。在酶前體凝血酶原的量相對較大的背景中，例如在血漿樣品中，使用凝血酶特異性抗體的免疫測定法進行凝血酶檢測可能具有挑戰(zhàn)性。US4753875公開了一種測定凝血酶的方法，其中將過量的帶標簽凝血酶抑制劑(例如，帶標簽水蛭素或帶標簽AT-1II)與含凝血酶的受試樣品一起混合在溶液中，以形成帶標簽抑制劑-凝血酶復合物與游離的帶標簽抑制劑的混合物。接下來，添加抗凝血酶抗體以形成帶標簽抑制劑-凝血酶和凝血酶特異性抗體的復合物。隨后將復合物與游離的帶標簽抑制劑分離并且測量標簽。本發(fā)明舉例說明了一種通過以下方式測試血漿的樣品中凝血酶的測定法:添加3H-水蛭素并且將復合物凝血酶-水蛭素與耦合到纖維素的凝血酶特異性抗體分離。因此，該測試需要復合物分離步驟，例如，使用額外的親和色譜柱分離步驟。

US5296352公開了單克隆抗體，其靶向并識別凝血酶/水蛭素復合物及其衍生物。US5296352公開了使用單克隆抗體對凝血酶/水蛭素復合物進行檢測。其還公開了可利用單克隆抗體對受檢者中自發(fā)產(chǎn)生的少量凝血酶進行檢測。該方法包括向受檢者注射水蛭素作為示蹤劑，然后借助識別復合物的單克隆抗體對形成的復合物凝血酶/水蛭素進行測量。本發(fā)明舉例說明了一種用于確定血漿中存在的凝血酶-水蛭素復合物的ELISA測定法。該測試需要向受檢者注射水蛭素以進行凝血酶測試。需要一種體外、簡單、快速并且有效的測試來確定血樣中的凝血酶水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種在抗凝血酶III(AT-1II)存在下對樣品中的凝血酶進行定量的體外免疫測定法。在一個方面，免疫測定法包括以下步驟:使樣品與識別凝血酶的底物結(jié)合位點的小分子接觸；使凝血酶與凝血酶特異性抗體接觸，所述凝血酶特異性抗體針對在活性位點封閉的凝血酶而產(chǎn)生；以及測量結(jié)合抗體的水平。在另一方面，免疫測定法包括以下步驟:使樣品與識別凝血酶的底物結(jié)合位點的小分子接觸；向樣品中添加凝血酶特異性抗體，其中針對具有封閉活性位點的凝血酶而產(chǎn)生凝血酶特異性抗體；測量抗體與凝血酶的結(jié)合；以及確定所存在的凝血酶的量。在本發(fā)明的一個實施例中，樣品為選自血液或血液組分的生物樣本。在本發(fā)明的另一個實施例中，小分子選自天然存在的水蛭素、合成的水蛭素變體、水蛭素衍生物、重組的水蛭素變體、模擬物、以及它們的組合。在另一個實施例中，凝血酶特異性抗體為多克隆抗體或其片段。然而在本發(fā)明的另一個實施例中，針對具有封閉活性位點的凝血酶而產(chǎn)生所述抗體，所述活性位點用選自如下的肽封閉=Phe-PiO-Arg-氯甲基酮(PPACK)、4-氨基苯丙酮酸(APPA)、4-(2-氨乙基·)苯磺?；?AEBSF)、以及它們的組合。在本發(fā)明的又一個實施例中，免疫測定法為固相免疫測定法，例如夾心免疫測定法。在本發(fā)明的又一個實施例中，使用凝血酶標準曲線確定凝血酶量。本發(fā)明還提供了一種用于在包含抗凝血酶III(AT-1II)的樣品中對凝血酶進行定量的試劑盒，所述試劑盒包含凝血酶特異性多克隆抗體或其片段以及識別凝血酶的底物結(jié)合位點的小分子，其中針對具有封閉活性位點的凝血酶而產(chǎn)生凝血酶特異性抗體。


圖1示出了為確定緩沖液樣品中的凝血酶水平而建立的免疫測定法的效能(0D值)。圖2示出了通過凝血酶特異性免疫測定法在緩沖液中包含增加濃度凝血酶的樣品中獲得的OD值( )與加標有增加濃度凝血酶的血漿樣品中獲得的OD值(▲)的比較。圖3示出了通過凝血酶特異性免疫測定法在緩沖液中包含增加濃度凝血酶并且包含AT-1II的樣品中獲得的OD值(▲)，和在不存在AT-1II的情況下在緩沖液中包含增加濃度凝血酶的樣品中獲得的OD值( )。圖4至6示出了向凝血酶樣品中添加水蛭素和血漿的混合物(圖4)、水蛭素和AT-1II的混合物(圖5)或水蛭素、AT-1II和肝素的混合物(圖6)對通過免疫測定法的凝血酶檢測的影響。圖7示出了通過向樣品中添加水蛭素，使用凝血酶特異性免疫測定法檢測到血漿樣品中凝血酶水平增加。
具體實施例方式已發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明，通過凝血酶特異性免疫測定法進行的凝血酶檢測因血漿中所存在的干涉作用物質(zhì)而受到影響。另外已發(fā)現(xiàn)，血漿中檢測到的干涉作用可至少部分地歸因于AT-1II的存在。
另外，令人意外地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明，與不含水蛭素的對照樣品相比，向包含水蛭素的樣品中添加凝血酶和AT-1II，導致凝血酶特異性免疫測定法檢測樣品中的凝血酶的能力提高。這些結(jié)果表明，在存在抗凝血酶III的情況下，水蛭素增強了凝血酶檢測。鑒于凝血酶分子中的水蛭素和AT-1II的結(jié)合位點不同并且與AT-1II相反，水蛭素為小分子，這些發(fā)現(xiàn)令人意外。凝血酶中水蛭素的結(jié)合位點與凝血酶的纖維蛋白原結(jié)合位點重疊(Chang JY., The hirudin-binding site of human alpha-thrombin,Identification of lysyl residues which participate in the combining site ofhirudin-thrombin complex,《生物化學雜志》，1989年5月5日；第264卷，第13期，第 7141-7146 頁；Huntington JA., Molecular recognition mechanisms of thrombin,《血栓形成與止血雜志》，2005年8月，第3卷，第8期，第1861-1872頁)，而AT-1II的結(jié)合位點與凝血酶的催化位點重疊(Griffith MJ.，Kinetics of the heparin-enhancedantithrombin III/thrombin reaction, Evidence for a template model for themechanism of action of heparin,《生物化學雜志》，1982年7月10日，第257卷，第13期，第 7360-7365 頁；和 Markwardt 等人,The influence of synthetic thrombin inhibitorson the thrombin-anti thrombin reaction,《血栓研究》，1973年，第 2卷，第 343 至 348 頁)。另外已發(fā)現(xiàn)，與不含水蛭素的對照相比，在將凝血酶與AT-1II混合之后添加水蛭素導致凝血酶檢測增強。測試包含AT-1II的血漿樣品或其他樣品時，水蛭素減少了在凝血酶特異性免疫測定法中遇到的干涉作用。不受該機制的束縛，似乎凝血酶與AT-1II締合隱藏和/或改變了凝血酶中的抗原基團，并且添加水蛭素減少了 AT-1II對免疫測定法造成的干涉作用，從而增強了免疫測定法的凝血酶檢測。這些發(fā)現(xiàn)為免疫測定法方法的建立鋪平了道路，從而能夠在AT-1II高水平條件(即血漿樣品中存在的普遍條件)下確定凝血酶水平。本發(fā)明提供了一種在AT-1II存在下對樣品中的凝血酶進行定量的體外免疫測定法，所述方法包括以下步驟:使樣品與識別凝血酶的底物結(jié)合位點(例如纖維蛋白原結(jié)合位點)的小分子接觸；向樣品中添加凝血酶特異性抗體；測量抗體與凝血酶的結(jié)合；以及確定所存在的凝血酶的量。術(shù)語“接觸”是指使小分子與樣品產(chǎn)生接觸的結(jié)合行為，更具體地講，是指以使小分子與樣品中存在的凝血酶之間發(fā)生結(jié)合相互作用的方式，使小分子與凝血酶產(chǎn)生接觸的結(jié)合行為。術(shù)語“小分子”是指例如分子量在400至100，000道爾頓范圍內(nèi)的分子，所述分子量諸如在400至50，000道爾頓、或400至40，000道爾頓、或400至8，000道爾頓、或400至1000道爾頓、或5，000至40，000道爾頓、或1，000至8，000道爾頓的范圍內(nèi)。小分子可
為具有類似三維結(jié)構(gòu)但顯示非重復序列的水蛭素的合成模擬物?？赏ㄟ^篩選例如隨機肽的例如噬菌體展示庫來鑒定水蛭素的模擬物。篩選可依賴用于將水蛭素結(jié)合至凝血酶中的底物結(jié)合位點的肽的競爭。在本發(fā)明的一個實施例中，使用ELISA夾心測定法?？墒褂媚复呋稽c的特異性單克隆抗體包被ELISA微量滴定板。所述板上樣有封閉溶液中的凝血酶并且通過若干次洗滌去除過量凝血酶。接下來,上樣封閉溶液中的水蛭素,并且沖洗掉過量的水蛭素。然后，使用標記的多克隆抗水蛭素抗體檢測結(jié)合至所述板的水蛭素(水蛭素100%結(jié)合)。也可通過使用標記的水蛭素(例如，3H-水蛭素)檢測水蛭素的結(jié)合。在各測試孔中將單獨的肽包括在ELISA中，并且存在給定肽時所述板的水蛭素結(jié)合減少表明肽為可能的模擬肽。在一個實施例中，識別凝血酶中的底物結(jié)合位點的小分子抑制凝血酶與纖維蛋白原的結(jié)合的至少50%。本發(fā)明方法中所用的小分子可以為肽、合成化合物、天然存在的水蛭素、合成的水蛭素變體、水蛭素衍生物和/或重組的水蛭素變體，其保持對凝血酶的底物結(jié)合位點的結(jié)合能力。變體包括那些水蛭素多肽，其相對于天然存在的水蛭素含有氨基酸置換、缺失和/或添加。通常，氨基酸置換、缺失和/或添加不改變變體結(jié)合至凝血酶的底物結(jié)合位點的能力。變體還可包括非天然存在的氨基酸殘基。衍生物包括糖基化改變、?；淖兒?或其他化學改變；非氨基酸置換，例如共價或非共價結(jié)合至多肽的氨基酸序列的報告分子和/或其他配體。模擬物包含很大數(shù)目的小分子，所述小分子能夠再現(xiàn)水蛭素的三維構(gòu)象而不必復制其結(jié)構(gòu)。該模擬物無需為完整的復制，也可為與水蛭素的模擬物充分類似的近似物，使得該模擬物能夠結(jié)合凝血酶。

在本發(fā)明的一個實施例中，按照使樣品中存在的凝血酶中和的量將小分子添加到受試樣品中。在本發(fā)明的另一個實施例中，樣品中水蛭素與凝血酶的摩爾比高于或等于 0.64，例如摩爾比為 0.67,1.27,2.55,5.10,10.20,12.76,20.41,25.52,40.82,51.05、81.63,102.56,205.13,410.26,816.36 以及 1632.65 或更高。在一個實施例中，推測凝血酶以約I個單位存在于樣品中，并且以約0.64個抗凝血酶單位或更高添加水蛭素。通常，術(shù)語“中和”和“抑制”是可互換的。術(shù)語“識別凝血酶的底物結(jié)合位點的分子”是指對凝血酶的底物結(jié)合位點具有親和力的分子。在本發(fā)明的一個實施例中，凝血酶的底物結(jié)合位點處于外部位I中。在本發(fā)明的另一個實施例中，結(jié)合的一個要素為Tyr76，位于與凝血酶的活性位點相距約20A處，如同纖維蛋白原的情況(Thierry Rose和Enrico Di Cera.,Three-dimensional Modelingof Thrombin-Fibrinogen Interaction,《生物化學雜志》,2001 年，第 277 卷,第 21 期，第18875-1880 頁)。本發(fā)明的免疫測定法可在任何樣品中執(zhí)行，例如生物樣本(諸如血液)；血液組分(諸如血漿和其他血液衍生成分)；包含凝血酶和抗凝血酶III的其他體液；等等。針對具有封閉活性位點的凝血酶而產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明使用的凝血酶特異性抗體。術(shù)語“具有封閉活性位點的凝血酶”是指肽結(jié)合至其活性位點的凝血酶。在本發(fā)明的一個實施例中，凝血酶的活性位點處于P4至P2’的裂縫中(示于以下文獻的圖2中:HuntingtonJA., Molecular recognition mechanisms of thrombin,《血栓形成與止血雜志》，2005 年8月，第3卷，第8期，第1861-1872頁)。肽(本文稱為“封閉肽”)可以為例如約400至1000道爾頓范圍內(nèi)的三氨基酸肽衍生物Phe-Pro-Arg-氯甲基酮(PPACK)、4_氨基苯丙酮酸(APPA)或4-(2-氨乙基)苯磺?；?AEBSF)。術(shù)語“活性位點”可以與術(shù)語“催化位點”互換。凝血酶特異性抗體可以為單克隆抗體、單鏈、Fab片段(包括Fab免疫球蛋白表達文庫的產(chǎn)物)、多克隆抗體或其片段，只要它們對凝血酶顯示結(jié)合特異性和/或能夠結(jié)合凝血酶。術(shù)語“多克隆抗體”是指異質(zhì)抗體群。這可包括對凝血酶內(nèi)的不同表位具有特異性抗原結(jié)合功能的抗體?？赏ㄟ^使用人凝血酶對例如哺乳動物物種的動物例如兔、山羊、驢和綿羊進行免疫來生成多克隆抗體。可由經(jīng)純化的人凝血酶原制備用于免疫的凝血酶。免疫途徑包括但不限于真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、顱內(nèi)和/或靜脈內(nèi)。術(shù)語“單克隆抗體”是指由產(chǎn)生抗體的細胞的單個克隆體(例如雜交瘤細胞的單個克隆體)制備的抗體制品。通常，通過雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體。術(shù)語“雜交瘤”是指經(jīng)過工程化改造產(chǎn)生大量所需抗體的細胞，例如用以制備單克隆抗體。為了制備單克隆抗體，可從用凝血酶免疫的動物(例如，任何哺乳動物物種)的脾中取出B細胞。可由經(jīng)純化的人凝血酶原制備用于免疫的凝血酶。免疫途徑包括但不限于真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、顱內(nèi)和/或靜脈內(nèi)。隨后可將B細胞與可在培養(yǎng)基中無限生長的骨髓瘤細胞融合?？赏ㄟ^使細胞膜更具通透性來進行該融合。融合的細胞，由于為癌細胞，可快速和無限地繁殖并且可產(chǎn)生大量所需抗體?？蓽y試所產(chǎn)生的抗體對凝血酶的特異性和親和力。制備單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域已知的，確定其特異性的方法也是一樣(參見例如Shivanand Pandey,“HYBRID0MA TECHNOLOGY FOR PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODIES”，《國際藥物科學檢閱與研究雜志》，2010年，第I卷，第2期，第88-94頁)。多克隆和單克隆抗體的 制備和純化是本領(lǐng)域中熟知的(Immunoassay,Eleftherios P Diamandis 和 Theodore K.Christopoulos 編輯，學術(shù)出版社，1996 年，第5章)。凝血酶特異性抗體可以為重組的(Immunoassay, Eleftherios P Diamandis和Theodore K.Christopoulos 編輯，學術(shù)出版社，1996 年，第 6 章)。供檢測的標記抗體是本領(lǐng)域所熟知的(Immunoassay, Eleftherios P Diamandis和Theodore K.Christopoulos編輯，學術(shù)出版社，1996年，第8章)?！皺z測抗體”和“標記的抗體/標記抗體”是指能夠被發(fā)現(xiàn)的抗體。檢測抗體可直接或間接地(例如，通過另一個抗體)偶聯(lián)到可檢測的信號或信號生成部分。信號可以為放射性信號(例如，放射性的碘、氚、碳、硫等等)、比色信號、熒光信號等等。作用于信號生成底物的信號生成部分包括但不限于辣根過氧化物酶(HR)[合適的底物包括3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB) ；0PD '2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉)_6_磺酸二銨鹽];堿性磷酸酶[合適的底物包括對硝基苯基磷酸二鈉鹽];和β -半乳醣苷酶[合適的底物包括O-硝基苯基-β -D-吡喃半乳糖苷]?？赏ㄟ^使用抗生物素蛋白-生物素偶聯(lián)體系放大信號。依賴抗原的抗原決定簇與特異性抗體的抗原結(jié)合部分之間的結(jié)合相互作用的不同類型的免疫測定法是本領(lǐng)域熟知的(Immunoassay, Eleftherios P Diamandis和Theodore K.Christopoulos編輯,學術(shù)出版社，1996年,第8至19章)，例如固相免疫測定法，例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，例如雙位(夾心類型，其中抗原被夾在固定抗體和標記的抗體之間)免疫測定法，抗生物素蛋白-生物素免疫測定體系，蛋白質(zhì)印跡，免疫沉淀，放射性免疫測定(RIA)，酶免疫測定法，熒光免疫測定法(其中熒光標記物與抗體偶聯(lián)，例如，熒光素、羅丹明等等)，免疫沉淀，化學發(fā)光免疫測定法(其中使用在化學結(jié)構(gòu)修飾時發(fā)出光的有機分子，例如異魯米諾、連苯三酚、蟲熒光素、魯米諾等等)，生物發(fā)光免疫測定法，免疫印跡技術(shù)等等。“抗原決定簇”是指抗體所識別的抗原中的區(qū)域。為了將抗體結(jié)合(包被)至聚苯乙烯微量滴定孔，可如下面的實例中所指定，按照pH9-9.6在碳酸鹽緩沖液中稀釋抗原特異性抗體。共價結(jié)合已有報道(Immunoassay,Eleftherios P Diamandis 和 Theodore K.Christopoulos 編輯，學術(shù)出版社，1996 年，第24章)。通常通過在存在封閉溶液(例如，BSA)的情況下，在孔中孵育抗原特異性抗體來執(zhí)行包被步驟。可使用第二抗體檢測結(jié)合到包被抗體的抗原?？蓸擞浀诙贵w。接下來，可制備適當?shù)目乖?例如，凝血酶)標準品，以建立校準曲線(Immunoassay, EleftheriosP Diamandis 和 Theodore K.Christopoulos 編輯，學術(shù)出版社，1996 年，第 24 章)。術(shù)語“包被抗體”、“捕獲抗體”和“固定抗體”通常是指存在于固體載體表面上的抗體?？蓪Π豢贵w進行定向，使得其抗原結(jié)合部分可用于接觸樣品中存在的抗原。若檢測為間接的(例如，通過第二抗體 執(zhí)行)，則可在用于生成捕獲抗體的物種之外的其他物種中生成第二檢測抗體。術(shù)語“確定凝血酶的量”是指定性或定量測定。ELISA可為定性的或定量的。定性結(jié)果提供受試樣品中凝血酶存在的簡單陽性或陰性結(jié)果。通常使用兩倍或三倍標準偏差(測試中固有的誤差)區(qū)分陽性樣品與陰性樣品。在定量的ELISA中，將樣品的光密度(OD)與標準曲線相比，所述標準曲線通常為已知量的經(jīng)純化的凝血酶的系列稀釋度。在本發(fā)明的一個實施例中，不同已知濃度的凝血酶按如下方式制備:將43.9 μ g/ml濃度的凝血酶標準溶液在封閉緩沖液(含0.05%吐溫-20的PBS中的I % Ι-Block)中稀釋成6.27μ g/ml(6270ng/ml)的濃度。接下來，通過將此前稀釋液中的100 μ I轉(zhuǎn)移到含有100 μ I封閉緩沖液的管內(nèi)，對經(jīng)稀釋的凝血酶標準溶液進行兩倍連續(xù)稀釋(7次)。制備從6270下降至49ng/ml的八種稀釋液。接下來，在封閉緩沖液中對上述凝血酶稀釋液中的每一種進行進一步稀釋(I: 10)，獲得4.9、9.8、19.5、39、78、156.7,313.5和627ng/ml的最終凝血酶濃度。在下一步驟中，將最終凝血酶溶液中的每一種的100 μ I轉(zhuǎn)移到預包被的微ELISA板內(nèi)，并且如下所詳述在不添加小分子的情況下執(zhí)行免疫測定法。免疫測定法可為自動化的(Immunoassay, Eleftherios P Diamandis和Theodore K.Christopoulos 編輯，學術(shù)出版社，1996 年，第 21 章)。在本發(fā)明的一個實施例中，執(zhí)行固相免疫測定法?？墒褂貌煌墓滔啵绻?、微珠、磁性顆粒物質(zhì)、塑料微珠、塑料載體、色譜柱、小片材和測定板(例如微量滴定孔)。在本發(fā)明的一個實施例中，使用下面建立的雙位(夾心類型)免疫測定法檢測受試樣品中的凝血酶:在第一步驟中，將識別凝血酶的底物結(jié)合位點的小分子添加到受試樣品內(nèi)。小分子可以為水蛭素，其被添加至中和凝血酶的至少I個NIH單位的最終濃度，例如添加中和凝血酶的20個NIH單位的量。包含凝血酶的樣品可與小分子一起孵育約15分鐘。然后，將包含小分子的樣品移取到固相上并在固相上孵育，固相用過量的凝血酶特異性多克隆抗體(“捕獲抗體”)預包被。在該孵育過程中，樣品中的凝血酶結(jié)合至捕獲抗體并且隨后洗去所有其他樣品成分。接下來，添加過量的標記多克隆凝血酶特異性抗體。在孵育之后，沖洗掉過量的標記的抗體并且測量結(jié)合標記的抗體的信號(例如，通過測量光密度[OD])?？捎墒褂萌缟现付ǖ囊阎康慕?jīng)純化的凝血酶建立的凝血酶標準曲線進行比較和外推來執(zhí)行凝血酶水平的定量/確定。在本免疫測定法實施例中，相同的凝血酶特異性多克隆抗體充當捕獲抗體和標記的抗體。在可供選擇的實施例中，使用單克隆抗體作為捕獲抗體并作為標記的抗體。在此類實施例中，捕獲抗體和標記的抗體不同并且必須識別凝血酶上的單獨表位，以便它們不會妨礙彼此的結(jié)合。在一個實施例中，凝血酶特異性單克隆抗體不靶向底物結(jié)合位點。在示例性ELISA中，過量的捕獲凝血酶特異性抗體(例如，多克隆抗體)被預包被到微量滴定孔上。更具體地講，在包被緩沖液(50mM碳酸鹽緩沖液；pH = 9.6)中，以
1: 200至1: 100的范圍(例如1: 500)稀釋抗體溶液(例如，蛋白濃度為2mg/ml)并且將100 μ I經(jīng)稀釋的抗體添加到每個孔內(nèi)。在2-8°C下過夜孵育微量滴定板。然后，棄去包被溶液并且用200 μ I/孔的洗滌緩沖液(含0.05%吐溫-20的PBS中)對微量滴定板進行三次洗滌。隨后，將200 μ I封閉緩沖液(洗滌緩沖液中的1% Ι-Block)添加到每個孔并且在37°C下孵育微量滴定板I小時。在孵育結(jié)束時，去除封閉緩沖液。使每個受試樣品，例如生物流體，與識別凝血酶的底物結(jié)合位點的小分子接觸。樣品可與小分子一起孵育約15分鐘。可在封閉緩沖液中以1: 5稀釋受試樣品，并且隨后將100 μ I每種稀釋的樣品添加到預包被孔內(nèi)。隨后在37°C下將板孵育I小時。孵育期之后，棄去樣品溶液，用洗滌緩沖液對孔進行洗滌。接下來，隨之將100 μ I包含偶聯(lián)HRP的凝血酶檢測多克隆抗體的溶液添加到每個孔內(nèi)，所述抗體已在封閉緩沖液(例如，從具有2mg/ml蛋白濃度的儲備溶液)中以1: 200至1: 100的范圍(諸如1: 500)內(nèi)稀釋。在37°C下將板孵育I小時，如上所述在洗滌緩沖液中進行洗滌，并且將用于ELISA的100 μ I 3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)液體底物體系(HRP底物)添加至每個孔。在室溫下將板孵育約60分鐘(直至在包含高凝血酶濃度的孔中觀察到深藍顏色)。通過向每個孔添加100 μ I終止液(1Μ鹽酸)終止反應。在OD45tlnm處讀取板，并且可通過與由上述已知凝血酶濃度建立的凝血酶標準曲線進行比較來推斷樣品中的精確凝血酶濃度。通常，使用凝血酶標準曲線的線性范圍計算受試樣品中的精確凝血酶濃度。在本發(fā)明的一個實施例中，捕獲抗體為多克隆抗人凝血酶綿羊抗體(例如，由Affinity Biologicals制造的抗體；目錄號SAHT-AP)。在本發(fā)明的另一個實施例中,用于產(chǎn)生多克隆抗體的免疫原為由經(jīng)純化的人凝血酶原制備的凝血酶，其中活性位點用PPACK封閉。在本發(fā)明的另一個實施例中，檢測抗體為偶聯(lián)HRP的綿羊抗人凝血酶抗體(例如，由Affinity Biologicals 制造的抗體；目錄號 SAHT-HRP)。在本發(fā)明的另一個實施例中，使用間接ELISA測定法。在示例性的間接ELISA中，使受試樣品與識別凝血酶的底物結(jié)合位點(例如纖維蛋白原結(jié)合位點)的小分子接觸，并且隨后將該樣品添加到固相，例如，微量滴定板的孔，此時給出一定時間以例如通過電荷相互作用而粘附到塑料。接下來，添加未反應蛋白的溶液，例如牛血清白蛋白或酪蛋白，以封閉孔中仍然未被受 試樣品中存在的抗原包被的任何塑料表面。在下一步驟中，將具體地結(jié)合至凝血酶的第一抗體添加到每個孔內(nèi)。此后，將結(jié)合第一抗體的第二抗體添加到每個孔內(nèi)。第二抗體具有附接到其上的酶，該酶對抗體結(jié)合特性的影響是微乎其微的。然后，添加這種酶的底物。該底物在與酶反應時改變顏色。顏色改變顯示第二抗體已結(jié)合至第一抗體。通常，在添加第一抗體和第二抗體之后，對所述板進行洗滌，從而去除未結(jié)合的抗體。在可供選擇的實施例中，使用連接到酶的一個抗體檢測樣品內(nèi)凝血酶的存在。使用分光計給出色彩強度的定量值?？蓹z測的信號可以為放射性信號(例如，放射性的碘、氚、碳、硫等等)、比色信號、熒光信號等等。本發(fā)明提供了一種用于在包含抗凝血酶III(AT-1II)的樣品中對凝血酶進行定量的試劑盒，所述試劑盒包含以下組分:凝血酶特異性多克隆抗體以及識別凝血酶的底物結(jié)合位點的小分子，其中針對具有封閉活性位點的凝血酶而產(chǎn)生凝血酶特異性抗體。試劑盒可包括使用說明和/或用于制備標準曲線的經(jīng)純化的凝血酶。試劑盒的組分可以粉末、溶液和/或其組合的形式提供。溶液可采用冷凍形式提供。以上或以下引用的專利申請、專利和出版物的公開內(nèi)容在此均以引用方式并入。以下實例為示例性的，而非限制性的。SM材料和方法。免疫測定法工序:1.用捕獲抗體包被微ELISA板。用多克隆抗人凝血酶綿羊抗體(Affinity Biologicals ；目錄號SAHT-AP ;用于制備多克隆抗體的免疫原為由經(jīng)純化的人凝血酶原制備的凝血酶，其中活性位點用PPACK封閉)包被微ELISA板(96個孔；Costar ;目錄號9018)。包被工序按如下方式執(zhí)行:在包被緩沖液(50mM碳酸鹽緩沖液；pH = 9.6 ；Sigma ;目錄號C-3041)中以1: 500稀釋抗體并且將100 μ I稀釋的抗體添加到每個孔內(nèi)。隨后在2-8°C下過夜(約16小時)孵育微ELISA板。然后，棄去包被溶液并且用200 μ I/孔的洗滌緩沖液[含0.05%吐溫-20 (Sigma ;目錄號 P-1379)的 PBS (Biological Industries ;目錄號 02-023-SA)中]對孔進行三次洗滌。隨后，將200 μ I封閉緩沖液[洗滌緩沖液中的1% 1-Block (Tropix ;目錄號ΑΙ300)添加到每個孔內(nèi)并且在37°C下將ELISA板孵育I小時。在添加受試樣品之前去除封閉緩沖液。2.將受試樣品和標記的結(jié)合抗體添加到預包被孔內(nèi)并且測暈標記的結(jié)合抗體的信號。在封閉緩沖液中以1: 5稀釋受試樣品，并且將100 μ I每種稀釋的樣品添加到預包被的微ELISA板內(nèi)。隨后在37°C下將板孵育I小時。孵育期之后，棄去樣品溶液，用如上所指定的200 μ I/孔的洗滌緩沖液對孔進行三次洗滌，并且將100 μ I偶聯(lián)HRP的抗凝血酶抗體(Affinity Biologicals ；目錄號SAHT-HR ;在封閉緩沖液中以1: 500稀釋；“標記的抗體”)添加到每個孔內(nèi)。未經(jīng)處理的豬血漿充當陰性對照。將封閉緩沖液中的已知濃度的凝血酶(4.9至627ng/ml)用作陽性對照。下面示出的結(jié)果中未展現(xiàn)陰性和陽性對照組的OD結(jié)果。在37°C下將板孵育I小時，用如上所指定的200 μ I/孔的洗滌緩沖液洗滌三次，并且將ΙΟΟμ I的3，3 '，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(ΤΜΒ，一種HR底物；Sigma，目錄號Τ-0440)添加到每個孔內(nèi)。在室溫(約22±3°C )下將板孵育約60分鐘(直至在包含最高凝血酶濃度的孔中觀察到深藍顏色)。通過將100 μ I終止液(1Μ鹽酸；Riedel de Haen ;目錄號30721)添加到每個孔中使反應終止。在OD45tol處讀取板。所獲得的OD值的增加表明樣品中的凝血酶濃度較高。通過與使用已知量的經(jīng)純化的凝血酶建立的凝血酶標準曲線進行比較來推斷樣品中的精確凝血酶濃度。使用凝血酶標準曲線的線性范圍計算樣品中的精確凝血酶濃度。
_9] 下面實例中所用的不同濃度凝血■酶的制備:為了制備不同凝血酶濃度,使用內(nèi)部標準的Omrix (43.9 μ g/ml)。為了獲得不同濃度，在封閉緩沖液(參見上述組分)中將凝血酶標準品稀釋成6.27 μ g/ml (6270ng/ml)的濃度。接下來，通過將此前稀釋液中的100 μ I轉(zhuǎn)移到含有100 μ I封閉緩沖液的管內(nèi)，對經(jīng)稀釋的凝血酶標準溶液進行兩倍連續(xù)稀釋(7次)。制備從6270下降至49ng/ml的八種稀釋液。接下來，將上述凝血酶稀釋液中的每一種進一步稀釋(I: 10)到受試樣品內(nèi)。實例1-用于檢測樣品中凝血酶的夾心ELISA建立雙位(夾心類型)免疫測定法以檢測受試樣品中的凝血酶。簡而言之,將包含凝血酶的樣品移取到固相上，所述固相用過量的多克隆抗凝血酶抗體(“捕獲抗體”)預包被，并且進行孵育，如“材料和方法”部分中所詳述。在該孵育過程中，樣品中的凝血酶結(jié)合至捕獲抗體并且隨后洗去所有其他樣品成分。接下來，添加過量的標記抗凝血酶抗體。孵育之后，沖洗掉過量的標記的抗體。在該免疫測定法中，相同的多克隆抗體充當捕獲和檢測/標記的抗體。多克隆抗體為親和經(jīng)純化的IgG綿羊抗人凝血酶。通過使用作為免疫原的經(jīng)純化的人凝血酶(由經(jīng)純化的凝血酶原制備)產(chǎn)生抗體，其中活性位點/催化位點用PPACK封閉。PPACK為結(jié)合至凝血酶的催化位點的肽。在本實驗中，對上述建立的免疫測定法檢測樣品中凝血酶水平的能力進行檢驗。出于這一目的，制備包含封閉緩沖液中的增加凝血酶濃度的樣品(樣品中的最終的凝血酶濃度為約:4.9,9.8、19.5、39、78、156.7、313.5和627ng/ml，如上所詳述制備)，并且如上述“材料和方法”部分中 所特別詳述的那樣執(zhí)行免疫測定法。在每個樣品中檢測標記的結(jié)合抗體的信號并且結(jié)果展 示于圖1中。已發(fā)現(xiàn)，結(jié)合抗體的信號與包含緩沖液中精確濃度的凝血酶的樣品中的凝血酶的濃度直接相關(guān)。最低的五種稀釋液在線性范圍內(nèi)。因此得出結(jié)論，該免疫測定法為一種工具，其可用于確定包含凝血酶的受試緩沖液樣品中凝血酶的水平(通過與使用已知量的經(jīng)純化的凝血酶建立的凝血酶標準曲線進行比較)。實例2-血.漿中存在的物質(zhì)對通過凝血■酶特異性免疫測定法進行的凝血■酶檢測的干涉作用前述實驗示出了以上免疫測定法對包含凝血酶的緩沖液樣品中凝血酶進行檢測的能力。在該實驗中，對上述建立的免疫測定法檢測豬血漿樣品(得自動物研究所(KibutzLahav Israel))中凝血酶的能力進行檢驗,所述樣品加標有增加濃度的凝血酶(與實例I中相同)。使用封閉緩沖液中的類似凝血酶濃度作為參考。如上所述執(zhí)行免疫測定法，并且兩組[即，組1-加標有凝血酶的血漿樣品(▲);和組2-包含凝血酶的緩沖液樣品( )]所獲得的OD值示于圖2中?？梢钥闯?，在相同凝血酶濃度下，血漿中的凝血酶所獲得的OD結(jié)果遠遠低于封閉緩沖液中的凝血酶所獲得的OD結(jié)果。因此已發(fā)現(xiàn)，免疫測定法因血漿中存在的干涉作用物質(zhì)而受到影響。實例3-AT-1II對通過凝血酶特異性免疫測定法進行的凝血酶檢測的干涉作用實例2示出血漿中存在干涉凝血酶特異性免疫測定法的物質(zhì)。人血漿中的正常AT-1II濃度較高并且為大約0.12mg/ml。執(zhí)行以下實驗以便檢驗血漿中存在的AT-1II是否為干涉免疫測定法的因子。出于這一目的，制備具有AT-1II的樣品(American diagnostica ;目錄號433 ;在封閉緩沖液中稀釋成lIU/ml的最終濃度)或不具有AT-1II的樣品(如上面所指出的封閉緩沖液)。接下來，將不同濃度的凝血酶添加到這些樣品中(最終濃度為4.9、9.8和
19.5ng/ml，如上所詳述制備)。如上所詳述執(zhí)行免疫測定法以檢測樣品中的凝血酶?？梢钥闯觯诖嬖贏T-1II的情況下所獲得的OD結(jié)果遠遠低于在不存在AT-1II的情況下所獲得的OD結(jié)果(圖3)。已發(fā)現(xiàn)，AT-1II對凝血酶免疫測定法產(chǎn)生干涉作用，并且因此表明，在血漿中檢測到的干涉作用(實例2)可至少部分地歸因于AT-1II的存在。實例4-免疫測定法中水蛭素添加對血■漿中凝血.酶檢測的有益.效果水蛭素為65個氨基酸的小肽，其天然存在于水蛭中并且具有血液抗凝劑特性。水蛭素結(jié)合至凝血酶中的纖維蛋白原結(jié)合位點(底物結(jié)合位點)，而AT-1II結(jié)合至凝血酶中的催化位點/活性位點。在下面一組實驗中，檢驗水蛭素添加對凝血酶特異性免疫測定法中的AT-1II干涉作用的影響。出于這一目的， 制備包含AT-1II的不同溶液[參見下面的溶液1、4和7]并且將不同濃度的水蛭素混合到不同溶液內(nèi)(參見下面的組2、3、5、6、8和9)。接下來，將不同濃度的凝血酶添加到混合物內(nèi)并且執(zhí)行免疫測定法。溶液1-9的制備:1.AT-1II (American diagnostica ;目錄號 433)在封閉緩沖液中稀釋成 lIU/ml 的最終濃度。2.一種含有1+最終濃度為lU/ml (1U水蛭素對應于IATU (抗凝血酶單位[ATU]；IATU定義為中和INIH單位凝血酶的抑制劑的量)的水蛭素(Sigma;目錄號94581)的溶液。3.一種含有1+添加至最終濃度為5U/ml的僅水蛭素的溶液。4.一種含有1+最終濃度為10IU/ml的肝素(藥物補助計劃)的溶液。肝素增強AT-1II對凝血酶的失活。5.一種含有4+最終濃度為lU/ml的水蛭素的溶液。6.一種含有4+最終濃度為5U/ml的水蛭素的溶液。7.豬血漿。8.含有7+最終濃度為lU/ml的水蛭素。9.含有7+最終濃度為5U/ml的水蛭素。接下來，采用上面所詳述的方式(參見“材料和方法”部分)以4.9,9.8、19.5、39、78、156.7,313.5和627ng/ml的最終濃度將凝血酶添加至每種溶液(1_9)。在本實驗中，將凝血酶連同AT-1II添加至包含水蛭素的溶液2、3、5、6、8和9中。將所制備的樣品(與不同凝血酶濃度混合的溶液1-9)稀釋，將其移取到預包被的ELISA板內(nèi)，并且如“材料和方法”部分中所指定的來確定OD水平。包含凝血酶的不同樣品的OD值示于圖4、5和6中。在圖4中，樣品為豬血漿(利用溶液7-9制備的樣品)。在圖5中，樣品為包含AT-1II的溶液(利用溶液1-3制備的樣品)。在圖6中，樣品為包含AT-1II和肝素的溶液(利用溶液4-6制備的樣品)。據(jù)觀察，添加的水蛭素以劑量依賴性方式降低AT-1II對凝血酶特異性免疫測定的干涉作用。這些結(jié)果表明，為了在包含AT-1II的樣品中提高通過凝血酶特異性免疫測定法進行的凝血酶檢測，有利的是向受試樣品中添加水蛭素，能夠結(jié)合至凝血酶的底物結(jié)合位點的小分子。實例5-凝血酶特異性免疫測定中水蛭素添加對血漿中凝血.酶檢測的有益.效果上述實驗的結(jié)果表明，向包含AT-1II的樣品中添加水蛭素可在特異性免疫測定中提高凝血酶檢測。在上述實驗中，將凝血酶連同AT-1II添加到包含水蛭素的樣品中。然而，受試血漿樣品已包含凝血酶，并且凝血酶中的大部分附接到抗凝血酶III。在這種情況下，水蛭素將需要作用于凝血酶-AT-1II復合物。以下實驗對水蛭素在用于檢測血漿樣品中凝血酶的免疫測定法中的有益效果進行檢驗，所述血漿樣品已經(jīng)包含凝血酶和AT-1II。在下面一組實驗中，將各種濃度的凝血酶加標到豬血漿的樣品內(nèi)(最終濃度為4.9至6271^/!111;參見“材料和方法”部分中的樣品制備)。制備三組樣品。在下一步驟中，以最終濃度lU/ml ( ■)或20U/ml (.)將水蛭素添加到其中兩組中。未向第三組添加任何水蛭素，該組用作對照(贏)。通過上述的ELISA測定法檢測不同組中的凝血酶。在本實驗中，補充有5U/ml水蛭素的未加標豬血漿用作陰性對照(未示出陰性對照的結(jié)果)。結(jié)果示于圖7中。添加至樣品中的水蛭素與樣品中存在的凝血酶之間的摩爾比示于下面的表I中。表1:受試樣品中的水蛭素與凝血酶之間的摩爾比
權(quán)利要求
1.一種用于在抗凝血酶III (AT-1II)存在下對樣品中的凝血酶進行定量的體外免疫測定法，所述免疫測定法包括以下步驟:使所述樣品與識別凝血酶的底物結(jié)合位點的小分子接觸；向所述樣品中添加凝血酶特異性抗體，其中針對具有封閉活性位點的凝血酶而產(chǎn)生所述凝血酶特異性抗體；測量所述抗體與所述凝血酶的結(jié)合；以及確定所存在的凝血酶的量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫測定法，其中所述樣品為選自血液或血液組分的生物樣本。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫測定法，其中所述小分子選自天然存在的水蛭素、合成水蛭素變體、水蛭素衍生物、重組的水蛭素變體、模擬物、以及它們的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的免疫測定法，其中所述凝血酶特異性抗體為多克隆抗體或其片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一 項所述的免疫測定法，其中針對具有封閉活性位點的凝血酶而產(chǎn)生所述抗體，所述活性位點用選自如下的肽封閉=Phe-PiO-Arg-氯甲基酮(PPACK)、4-氨基苯丙酮酸(APPA)、4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物(AEBSF)、以及它們的組口 ο
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的免疫測定法，其中所述免疫測定法為固相免疫測定法。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的免疫測定法，其中所述固相免疫測定法為夾心免疫測定法。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的免疫測定法，其中利用凝血酶標準曲線對所述凝血酶量進行確定。
9.一種用于在包含抗凝血酶III (AT-1II)的樣品中對凝血酶進行定量的試劑盒，所述試劑盒包含凝血酶特異性多克隆抗體或其片段，以及識別凝血酶的所述底物結(jié)合位點的小分子，其中針對具有封閉活性位點的凝血酶而產(chǎn)生所述凝血酶特異性抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中所述小分子選自天然存在的水蛭素、合成的水蛭素變體、水蛭素衍生物、重組的水蛭素變體、模擬物、以及它們的組合。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的試劑盒，其中針對具有封閉活性位點的凝血酶而產(chǎn)生所述抗體，所述活性位點用選自如下的肽封閉=Phe-PiO-Arg-氯甲基酮(PPACK)、4_氨基苯丙酮酸(APPA)、4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物(AEBSF)、以及它們的組合。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒為免疫測定試劑盒。
13.根據(jù)權(quán)利要求9至12中任一項所述的試劑盒，還包括經(jīng)純化的凝血酶。
14.一種用于在包含抗凝血酶III (AT-1II)和凝血酶的樣品中對凝血酶進行定量的體外免疫測定法，所述免疫測定法包括以下步驟:使所述樣品與識別凝血酶的所述底物結(jié)合位點的小分子接觸；使所述凝血酶與凝血酶特異性抗體接觸，所述凝血酶特異性抗體針對在活性位點封閉的凝血酶而產(chǎn)生；以及測量結(jié)合抗體的水平。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的免疫測定法，其中所述樣品為選自血液或血液組分的生物樣本。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的免疫測定法，其中所述小分子選自天然存在的水蛭素、合成的水蛭素變體、水蛭素衍生物、重組的水蛭素變體、模擬物、以及它們的組合。
17.根據(jù)權(quán)利要求14至16中任一項所述的免疫測定法，其中所述凝血酶特異性抗體為多克隆抗體或其片段。
18.根據(jù)權(quán)利要求14至17中任一項所述的免疫測定法，其中針對具有封閉活性位點的凝血酶而產(chǎn)生所述抗體，所述活性位點用選自如下的肽封閉=Phe-PiO-Arg-氯甲基酮(PPACK)、4_氨基苯丙酮酸(APPA)、4_(2_氨乙基)苯磺?；?AEBSF)、以及它們的組合。
19.根據(jù)權(quán)利要求14至18中任一項所述的免疫測定法，其中所述免疫測定法為固相免疫測定法。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的免疫測定法，其中所述固相免疫測定法為夾心免疫測定法。
21.根據(jù)權(quán)利要求14至20中任一項所述的免疫測定法，其中利用凝血酶標準曲線對所述凝血酶量進行確定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于在包含抗凝血酶III(AT-III)和凝血酶的樣品中對凝血酶進行定量的體外免疫測定法。所述方法包括以下步驟使所述樣品與識別所述凝血酶的底物結(jié)合位點的小分子接觸；使所述凝血酶與凝血酶特異性抗體接觸，所述凝血酶特異性抗體針對在所述活性位點封閉的凝血酶而產(chǎn)生；以及測量結(jié)合抗體的水平。
文檔編號G01N33/86GK103238072SQ201180059028
公開日2013年8月7日 申請日期2011年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者R.明茨, N.奧爾, I.努爾 申請人:奧姆里克斯生物藥品有限公司