專利名稱：用于檢測和診斷神經(jīng)變性疾病的診斷性自身抗體譜的制作方法
用于檢測和診斷神經(jīng)變性疾病的診斷性自身抗體譜相關申請的交叉引用本申請要求2010年5月13日提交的美國臨時申請第61/334，466號和2011年2月21日提交的美國臨時申請第61/444，932號的優(yōu)先權(quán)，其公開的內(nèi)容通過引用整體并入本文。
背景技術：
自身抗體是由個體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的針對個體自身蛋白抗原的抗體。正常情況下，響應體內(nèi)的外源性蛋白或物質(zhì)而產(chǎn)生抗體，所述外源性蛋白或物質(zhì)通常為作為感染性生物的病原體。正常情況下，免疫系統(tǒng)能夠識別和忽略機體的自身細胞，并且不對環(huán)境中的非威脅性物質(zhì)(例如食物)進行過度反應。然而，有時，免疫系統(tǒng)停止將一種或多種機體的正常組分識別為“本體”，導致產(chǎn)生自身抗體。這些自身抗體攻擊機體的自身細胞、組織和/或器官，導致炎癥和損傷。血清自身抗體參與多種神經(jīng)性疾病和綜合癥。已經(jīng)從源自表現(xiàn)出強迫癥、西德納姆舞蹈病、鏈球菌感染相關性兒童自身免疫神經(jīng)精神障礙(“PANDAS”)以及橋本氏腦病的個體的血清中檢測到了結(jié)合神經(jīng)元的自身抗體。精神分裂癥也與自身抗體的出現(xiàn)有關，包括數(shù)種針對神經(jīng)表面受體的自身抗體。已知由抗核抗體導致的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(“SLE”)具有與一組抗DNA抗體的出現(xiàn)相吻合的認知和記憶喪失組分，所述抗DNA抗體與N-甲基-D-天冬氨酸受體(“NMDAR”)交叉反應。另外，在將自閉癥兒童母親的腦反應性抗體施用于懷孕哺乳動物時引發(fā)了行為異常。另外，在神經(jīng)變性疾病中，發(fā)現(xiàn)自身抗體已見于帕金森氏病、自閉癥譜系障礙、肌萎縮側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化癥、吉蘭-巴雷綜合征、慢性周圍神經(jīng)病、視神經(jīng)炎、血管性癡呆以及阿爾茨海默病(“AD”)。在阿爾茨海默病的情況下，有許多文獻報道了患者具有高滴度的針對非腦和腦相關靶的自身抗體，包括結(jié)合神經(jīng)元的自身抗體。另外，已經(jīng)鑒定了數(shù)種特異性自身抗體靶，包括醛縮酶、神經(jīng)絲重亞基、組蛋白、微管蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白以及S-100。阿爾茨海默病(AD)是一種老年人的進行性和破壞性神經(jīng)變性疾病，其體現(xiàn)為顯著的記憶和認知減退，與神經(jīng)元和突觸的損失有關(Selkoe (2002) Science298，789-91)。其他的關鍵病理特征包括神經(jīng)元中沉積的淀粉樣蛋白(Αβ)，尤其是42氨基酸肽(Αβ 42)，和腦血管壁中的淀粉樣蛋白斑塊，以及出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)、神經(jīng)膠質(zhì)激活以及廣泛的炎癥(Schwab et al.(2008) J Alzheimers Disl3, 359-69 ；Thal et al.(2008)Acta Neuropathol 115, 599-609 ；ffeisman et al.(2006)Vitam Horm74, 505-30)。神經(jīng)元中的Αβ 42沉積始于疾病過程早期，之后是淀粉樣蛋白斑塊和纏結(jié)形成，在時間和空間上與人阿爾茨海默病和轉(zhuǎn)基因小鼠腦中的突觸損失相符合(D’Andrea et al.(2001)Histopathology38, 120-134 ；Nagele et al.(2002)J Neurosci110, 199-211 ；Gouras etal.(2000) Am J Path0.156，15-20)。這導致提出A β沉積物的逐漸生長可進行性破壞神經(jīng)元支持其廣泛的樹突棘的能力，由此促成早期突觸損失，最終表現(xiàn)出先兆性癥狀(telltalesymptoms)。
有研究報道，在死者的阿爾茨海默病腦組織切片中存在免疫球蛋白(Ig)免疫陽性神經(jīng)元，這極少見于在年齡匹配的非癡呆對照的相當腦區(qū)中(Stein et al.(2002)J Neuropathol Exp Neurol61, 1100-8 ;Bouras et al.(2005)Brain Res Brain ResRev48, 477-87 ；Of Andrea(2003)Brain Res Brain Res Rev982, 19-30)。還有報道在阿爾茨海默病患者血清中存在特異性腦反應性自身抗體(Bouras et al.(2005)Brain ResBrain Res Rev48, 477-87；Kulmala et al.(1987)Exp Aging Resl3, 67-72 ;Mecocci etal.(1993)Biol Psychiatry34, 380-5 ；Mecocci et al.(1995)J Neuroimmuno157, 165-70 ；Weksler et al.(2002)Exp Gerontol37, 971-979)。
自閉癥譜系障礙(“ASD”)是一組腦發(fā)育障礙的疾病，包括自閉癥、阿斯伯格綜合征、雷特病以及兒童期崩解癥(childhood disintegrative disorder)。自閉癥譜系障礙的特征為社會行為和溝通損害，通常表現(xiàn)于兒童期的最初36個月內(nèi)(American PsychiatricAssociation:Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, FourthEdition (2000))。顯著比例(20-30%)的自閉癥患者經(jīng)歷自閉性退化期，在此過程中，其經(jīng)歷了先前在語言和行為技能上所獲取的能力的喪失(Fombonne (2003) JAMA289，87-89)。令人費解的是，自閉癥譜系障礙的流行顯著增加，此發(fā)現(xiàn)并非是由于診斷改進，而是表明與某些環(huán)境因素有關。目前，自閉癥系障礙影響1:150的兒童，其病因很大程度上未知，但可能是多因素的(Fombonne, 2003)。
自閉癥患者的神經(jīng)病理學和神經(jīng)影像研究報道了腦尺寸和重量增加(Bailey etal.(1998)Psychol Med25, 63-77 ；Kemper and Bauman(1998)Neurol Clinicl, 175-87 ；Palmen et al.(2004) Brainl27, 2572-2583)。許多自閉癥腦研究報道神經(jīng)元尺寸總體減少和神經(jīng)元存儲密度增加，尤其是在海馬、腦下腳以及杏仁核中(Kemper and Bauman, 1993)。
自閉癥譜系障礙與特定的腦異常相關。神經(jīng)學觀察和神經(jīng)影像研究提供證據(jù)證明在自閉癥中可累及許多腦區(qū)，包括小腦、大腦皮質(zhì)、杏仁核、海馬、基底神經(jīng)節(jié)以及腦干(Akshoomoff et al., 2002 ；Acosta and Pearl (2004)Semin Pediatr Neurol11,205-213)。小腦異常也常見于ASD患者中，其標志為浦肯野細胞(Purkinje cell)和粒細胞的缺少(Courchesne et al., 2001)。
自身免疫和自身抗體參與自閉癥譜系障礙的發(fā)病機制(Ashwood et al.(2006) JLeukocyte Biol80, 1-11 ；ffills et al.(2007)AnnN.Y.Acad Sci 1107,79-91 ；Zimmermanet al.(2007) Brain Behav Immun21, 351-357)。自身抗體與神經(jīng)兀結(jié)合可破壞關鍵時期神經(jīng)發(fā)育的正常模式。據(jù)報道，在自閉癥兒童中有腦反應性自身抗體，并且有數(shù)種自身免疫因素，包括腦特異性自身抗體，淋巴功能受損、細胞因子調(diào)節(jié)異常以及病毒聯(lián)合(viralassociation)與其有關(Singh and Rivas (2004) Neurosci Lett355, 53-56)。例如，Singh和Rivas (2004)揭示了自閉癥兒童血清含有腦特異性自身抗體。在68名4_12歲的自閉癥兒童的研究中，分別在49%、18%以及9%的自閉癥兒童中檢測到抗尾狀核、大腦皮質(zhì)以及小腦的抗體，但在正常兒童中檢測不到。另一研究顯示患有妥瑞氏綜合征(tourettesyndrome)的兒童具有抗紋狀體抗體，將這些抗體輸注到大鼠紋狀體中導致了與妥瑞氏綜合征相似的神經(jīng)元功能障礙(Hallet et al.(2000)J Neuroimmunol 111,195-202)。在自閉癥患者中還發(fā)現(xiàn)其他抗腦抗體，包括針對5-羥色胺受體、髓磷脂堿性蛋白、軸突絲蛋白、小腦神經(jīng)絲、神經(jīng)生長因子、腦內(nèi)皮蛋白的抗體以及針對其他未鑒定腦蛋白的抗體。在兒童鏈球菌感染后病例中顯示了在抗神經(jīng)元自身抗體和神經(jīng)性疾病之間具有強關聯(lián)性，例如，強迫癥(OCD)、西德納姆舞蹈病、妥瑞氏綜合征、PANDAS、伴腫瘤效應(paraneoplasia),并且在系統(tǒng)性紅斑狼瘡老年患者中顯示了認知和記憶的喪失(Swedo et al.(1989)Am J Psychiatryl54, 110-2 ；Kalume et al.(2004)J NeurosciRes77, 82-89 ；Tanaka et al.(2004)J Neurological Sci217, 25-30)。DeGeorgio 等人(DeGeorgio et al.(2001) Nature Med 11，1189-1193)和 Kowal 等人(Kowal et al.(2004)Immunity21, 179-188)報道了通過分子模擬，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的一組抗DNA抗體與NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)亞型谷氨酸受體交叉反應，并且在體外和體內(nèi)誘導神經(jīng)元損傷和死亡。

發(fā)明內(nèi)容
在一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測受試者神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體的方法，所述方法包括:從所述受試者獲得生物樣品，進行測定以確定所述生物樣品中是否存在一種或多種神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體。在另一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種用于診斷受試者神經(jīng)變性疾病的方法，所述方法包括:從所述受試者獲得生物樣品，進行測定以確定所述生物樣品中是否存在神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體；如果存在一種或多種神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體，則診斷為所述神經(jīng)變性疾病。在一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種鑒定處于發(fā)生神經(jīng)變性疾病風險的受試者的方法，所述方法包括:從所述受試者獲得生物樣品，進行測定以確定所述生物樣品中是否存在一種或多種神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體；如果存在所述一種或多種神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體，則將所述受試者鑒定為處于發(fā)生所述神經(jīng)變性疾病風險。在另一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種生成受試者特異性神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體譜的方法，所述方法包括:從受試者獲得生物樣品，進行測定以確定所述生物樣品中是否存在一種或多種神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體，并生成存在于所述樣品中的受試者特異性神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體譜。本發(fā)明的另一種實施方式提供了一種基材，所述基材上固定有對于一種或多種神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體具有特異性的一種或多種自身抗原。本發(fā)明的另一種實施方式提供了一種微陣列，所述微陣列包含基材，所述基材上固定有對于一種或多種神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體具有特異性的一種或多種自身抗原。本發(fā)明的另一種實施方式提供了一種用于檢測神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體的試劑盒。


圖1是實施例8中例示的診斷邏輯的圖示。
具體實施例方式根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)在人血清中存在豐富和普遍的自身抗體，也稱為自身反應性抗體，與年齡或是否存在疾病無關。某些自身抗體為腦反應性，其他的自身抗體對于全身其他器官中的靶具有反應性。盡管某些自身抗體可為過往疾病和免疫活性的殘余物，但根據(jù)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，由于現(xiàn)有或發(fā)展中的疾病，血液和腦脊液(CSF)中還存在許多自身抗體。該后一組可用于現(xiàn)有疾病的早期檢測和診斷。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)因活動性神經(jīng)變性疾病的存在，包括長期和短期疾病，導致由于與進行中的病變相關的細胞損傷而產(chǎn)生和釋放出細胞產(chǎn)物，其中某些具有細胞類型和器官特異性。這些釋放的細胞產(chǎn)物(其中許多為蛋白質(zhì))，其裂解片段以及疾病相關翻譯后修飾物進入血液和淋巴循環(huán),充當抗原，引發(fā)免疫應答。該免疫應答導致血液中產(chǎn)生和出現(xiàn)較大量的自身反應性自身抗體。遍布機體的細胞共有大量蛋白質(zhì)，但僅一組較小量的自身抗體對涉及特定疾病的細胞、組織以及器官具有特異性反應性。根據(jù)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)該應答導致所涉及的各疾病和特定細胞類型所特有的疾病特異性自身抗體譜。另外，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在患有并發(fā)癥的個體中，特定的自身抗體譜反映了這些并發(fā)癥中的每一種的疾病過程。
另外，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，能夠結(jié)合腦特異性靶(包括神經(jīng)元及其支持性膠質(zhì)細胞)的自身抗體常見于血液中，實際上它們顯示為遍在的。這些自身抗體與腦中的神經(jīng)元和/或膠質(zhì)細胞的結(jié)合對于這些細胞及其所參與的功能是有害的。這不僅破壞正常細胞功能，而且還最終導致神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞死亡和從腦中永久性喪失。
一旦自身抗體位于腦組織中，則其自由選擇性結(jié)合腦中于其表面具有并呈現(xiàn)合適靶抗原的任何細胞。如果細胞表面上的自身抗體靶特別豐富，許多自身抗體分子的結(jié)合可交聯(lián)和固定該蛋白。如果所述靶是重要的受體，可使得靶和細胞不具功能性，導致更廣泛的腦功能損害。當靶細胞為神經(jīng)元時，自身抗體結(jié)合可導致神經(jīng)元功能障礙，所述神經(jīng)元障礙可最終表現(xiàn)為行為、認知、記憶以及活動損害。當所述靶為支持神經(jīng)元的膠質(zhì)細胞時，該支持的喪失可間接破壞神經(jīng)元功能。由此，人血清中的特異性腦反應性自身抗體可將人置于特定神經(jīng)變性疾病的風險中。本發(fā)明提供了一種用于檢測人生物樣品中這些自身抗體的方法。
由此，在一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種鑒定處于發(fā)生神經(jīng)變性疾病風險的受試者的方法，所述方法包括:從所述受試者獲得含有免疫球蛋白的生物樣品，進行測定以確定所述生物樣品中是否存在一種或多種神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體；如果存在一種或多種所述神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體則將所述受試者鑒定為處于發(fā)生所述神經(jīng)變性疾病風險中。
在另一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測受試者的神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體的方法，所述方法包括:從所述受試者獲得含有免疫球蛋白的生物樣品，并進行測定以確定所述生物樣品中是否存在一種或多種神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體。
在優(yōu)選的實施方式中，所述神經(jīng)變性疾病選自:阿爾茨海默病、帕金森氏病、肌萎縮側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化癥、吉蘭-巴雷綜合征、慢性周圍神經(jīng)病、視神經(jīng)炎、血管性癡呆、強迫癥、西德納姆舞蹈病、鏈球菌感染相關性兒童自身免疫神經(jīng)精神障礙(“PANDAS”)、橋本氏腦病、精神分裂癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血管性認知病、中風、亨廷頓病、視神經(jīng)脊髓炎、副癌綜合征、邊緣性腦炎、羅斯默森氏腦炎(Rasmussen encephalitis)、橋本氏腦炎、昏睡性腦炎、僵人綜合征、鏈球菌感染后運動障礙、風濕熱、麩質(zhì)性腸病、ASD、誦讀困難、HTLV-1相關性脊髓病/熱帶痙攣性輕截癱、重癥肌無力、蘭伯特-伊頓綜合征以及先天性多發(fā)性關節(jié)攣縮。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述受試者是人。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述含有免疫球蛋白的生物樣品為血清、全血、CSF、唾液或痰液。血液樣品可通過本領域已知方法獲得，包括靜脈穿刺或指穿刺。CSF可通過本領域已知的方法獲得，包括腰椎穿刺。為了由血液獲得血清，接收血液樣品，在足以沉淀所有細胞和血小板的速度下離心，由所產(chǎn)生的上清抽取待分析的血清。痰液和唾液樣品可通過本領域已知的方法收集。可使用合適的緩沖液稀釋生物樣品。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，通過如下方法進行用于檢測所述生物樣品中是否存在一種或多種神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體的測定:在允許形成自身抗原與自身抗體的免疫復合物的條件下，使所述生物樣品與神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體的一種或多種特異性自身抗原接觸，并檢測所述免疫復合物的存在。 可通過將存在于來自患有神經(jīng)變性疾病的受試者的含有免疫球蛋白的樣品中的自身抗體與存在于來自年齡匹配的無病對照受試者的含有免疫球蛋白的樣品中的自身抗體進行比較來鑒定神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體特異性的自身抗體。存在于來自患有所述疾病的受試者的樣品中而不存在于來自對照受試者的樣品中的自身抗體的靶自身抗原提供了所述疾病診斷性自身抗體的鑒定。所述樣品優(yōu)選為血清。例如，點在單樣品載玻片上的含有數(shù)千個完整或近完整人蛋白的蛋白微陣列可用于鑒定患者樣品中與微陣列中抗原靶具有反應性的自身抗體。對照樣品中的自身抗體可通過相似的方式鑒定。可將患者自身抗體譜與對照自身抗體譜進行比較以檢測所述疾病特異性自身抗體和相應的自身抗原?？捎糜阼b定神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體和自身抗原的蛋白微陣列可通過本領域已知方法制備，還可商購獲得。可商購獲得的蛋白微陣列包括，例如，Invitrogen的ProtoArray 人蛋白微陣列v5.0,該微陣列優(yōu)選根據(jù)Invitrogen ProtoArray 方案和免疫應答生物標志物譜(Immune Response Biomarker Profiling)應用來使用。用于探測和掃描此類蛋白微陣列和用于檢測所得數(shù)據(jù)的診斷性意義的方法為本領域技術人員已知，并公開在例如，Tibshirani et al.(2002)Proc Natl Acad SciUSA99, 6567-6572。一旦通過前述方法鑒定了神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體，則鑒定和篩選相應的自身抗原以用于檢測和診斷方法。自身抗原可包括蛋白抗原、多肽或其肽片段，所述蛋白抗原、多肽或其肽片段含有由所述疾病診斷性自身抗體識別的一種或多種表位，或由所述疾病診斷性自身抗體識別的表位擬肽(peptidomimetic)。自身抗原可由天然來源純化而來,或通過本領域已知的方法重組或合成性制備，可為融合蛋白形式?？墒褂脽o細胞翻譯系統(tǒng)體外制備自身抗原。在優(yōu)選的實施方式中，在哺乳動物或昆蟲表達系統(tǒng)中制備自身抗原以確保正確的折疊和功能。所有這些方法可為自動化的以用于高通量制備。用于檢測免疫復合物的測定和條件為本領域技術人員已知。這樣的測定包括，例如，競爭性測定、直接反應測定以及夾層型測定。所述測定可為定量或定性的。在優(yōu)選的實施方式中，測定利用與自身抗原直接或間接連接的固相或基材，例如微量滴定板或微量測定板、載玻片、磁珠、非磁珠、柱、基質(zhì)、膜、試紙片、過濾器、膜、針或片，可由合成性材料(例如，聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺或其他合成性聚合物)、天然聚合物(例如纖維素)、衍生性天然聚合物(例如醋酸纖維素或硝酸纖維素)以及玻璃(例如玻璃纖維)構(gòu)成。所述基材優(yōu)選包括固定于表面上的可分別定位的多種自身抗原。可分別定位的自身抗原優(yōu)選固定于表面上以形成陣列。所述基材可以以合適的形狀使用，例如薄膜、片或板，或可包被、粘合或?qū)訅褐梁线m的惰性載體上，例如紙、玻璃、塑料薄膜或織物。在優(yōu)選的實施方式中，所述基材為載玻片或微珠。
將自身抗原連接到支持物或基材上的方法為本領域已知，包括共價和非共價相互作用。例如，所應用的蛋白擴散至例如水凝膠的多孔表面允許在水凝膠結(jié)構(gòu)中未修飾蛋白的非共價結(jié)合。共價偶聯(lián)方法提供了穩(wěn)定的連接，可應用于許多蛋白。使用蛋白上的標簽(例如，六組氨酸/N1-NTA或生物素/親和素)和固定于基材表面上的配偶體(partner)試劑的生物捕獲方法提供了穩(wěn)定的連接，以可再現(xiàn)取向(reproducible orientation)特異性結(jié)合蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，將自身抗原涂覆或點至支持物或基材(例如化學衍生玻璃)上。在更優(yōu)選的實施方式中，使用硝酸纖維素包被的載玻片。
在一種優(yōu)選的實施方式中，以陣列、優(yōu)選微陣列的形式提供自身抗原。蛋白微陣列為本領域已知，并且綜述在例如Hall et al.(2007)Mech Ageing Devl28:161-167和Stoevesandt et al (2009)Expert Rev Proteomics6:145-157 中，該文獻公開的整體內(nèi)容通過引用并入本文?？赏ㄟ^使用接觸點樣器或非接觸微陣列儀將純化的自身抗原固定于基材(如處理過的顯微鏡載玻片)上來制備微陣列。還可通過由相應DNA陣列直接原位無細胞合成來制備微陣列。
外源制備和純化待點樣至陣列上的自身抗原的合適方法包括在細菌中表達(如Venkataram et al.(2008)Biochemistry47:6590-6601 所揭不的)、在酵母中表達(如 Liet al.(2007)ApplBiochem Biotechnol.142:105-124 所揭不的)、在昆蟲細胞中表達(如Altman et al.(1999)Glyco conj J 16:109-123所揭示的)以及在哺乳動物細胞中表達(如 Spampinato et al.(2007) Curr Drug Targets8:137-146 所揭不的)。
合適的原位(“芯片上”)蛋白制備方法公開在例如,Ramachandran et al.(2006)Methods Mol.Biol2328:l_14and He et al.(2008)Curr.0pin Biotechnol19:4-9
同時平行在陣列表面上表達和固定蛋白的其他方法也是本領域已知的，可用于本發(fā)明。例如，在蛋白原位陣列(PISA)方法(He et al.(2001)Nucleic Acids Res29:e73)中，直接由DNA制備溶液或固定形式的蛋白，當通過識別標簽序列而制備時連接到陣列表面。利用無細胞系統(tǒng)(通常為兔網(wǎng)織紅細胞或大腸桿菌S30)體外平行表達蛋白，以進行偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄和翻譯。在該方法中，在其上預包被有能夠結(jié)合標簽的固定劑的表面上進行蛋白表達。由此，在各蛋白翻譯后，其同時特異性固定于鄰近的表面上，而其他物質(zhì)可隨后被洗除?？赏ㄟ^將DNA與無細胞裂解物系統(tǒng)混合之后點樣，或通過首先點樣隨后與表達系統(tǒng)混合的多次點樣技術(MIST)直接將微陣列制備至載玻片上。
在已知為核酸程序化蛋白陣列(NAPPA) (Ramachandran et al.(2004)Science305:86-90)的系統(tǒng)中，由固定(與溶液相對)的DNA模板進行轉(zhuǎn)錄和翻譯允許將DNA陣列轉(zhuǎn)化為蛋白陣列。在該方法中，將編碼作為GST融合物的蛋白的生物素化cDNA質(zhì)粒與用作捕獲實體的抗GST抗體一起印至親和素包被的載玻片上。然后使用兔網(wǎng)織紅細胞裂解物覆蓋cDNA陣列以表達蛋白，所述蛋白由鄰近各DNA點的抗體捕獲，由此所述蛋白以與cDNA相同的布局固定。該技術產(chǎn)生了其中固定的蛋白與DNA和捕獲劑一起存在的蛋白陣列。另一種產(chǎn)生蛋白陣列的合適方法是DNA陣列至蛋白陣列(DAPA)方法。該原位蛋白陣列的方法使用固定的DNA陣列作為模板以在分離的表面上由DNA產(chǎn)生“純”蛋白陣列，還可由相同DNA模板產(chǎn)生多拷貝蛋白陣列(He et al.(2008)Nature Methods, 5:175-7)。在置于兩個表面(例如載玻片)之間的膜中進行無細胞蛋白合成，其中一個表面布有DNA分子陣列，而另一個表面帶有特定試劑以捕獲所翻譯的蛋白。由所布陣列的DNA平行合成各標記的蛋白，所述蛋白經(jīng)間隙擴散，之后通過其與位于相對面的標簽捕獲試劑相互作用而固定，以形成蛋白陣列。產(chǎn)生了在位置和量上準確反映DNA的離散點?？赏ㄟ^再利用DNA獲得蛋白陣列的復制拷貝。陣列構(gòu)建方法包括機器人接觸印刷、噴墨、壓電點樣以及照相平板印刷。例如，可使用柔性蛋白微陣列噴墨印刷系統(tǒng)(例如，ArrayJet, Roslin, Scotland, UK)將外源制備和純化的本發(fā)明的純化自身抗原點樣至微陣列基材上，以提供高質(zhì)量蛋白微陣列生產(chǎn)。可將精確的自身抗原的行和列轉(zhuǎn)化為標示出已結(jié)合診斷性自身抗體的存在和量的可檢測點。優(yōu)選使用經(jīng)設計以維持自身抗原三維形狀的可商購印刷緩沖液進行微陣列的制備。在一種優(yōu)選實施方式中，用于微陣列的基材是硝酸纖維素包被的載玻片?？赏ㄟ^本領域已知的方法進行測定，在所述方法中在允許形成自身抗原與抗體的免疫復合物的條件下，使一種或多種自身抗原與生物樣品接觸，并檢測所述免疫復合物?？赏ㄟ^本領域已知的方法檢測免疫復合物的存在和量，所述方法包括基于標簽和無標簽的檢測。例如，基于標簽的檢測方法包括添加第二抗體，所述第二抗體與包含產(chǎn)生信號的化合物的指示劑偶聯(lián)。所述第二抗體可為抗人IgG抗體。所述指示劑包括生色劑、諸如酶偶聯(lián)物的催化劑、諸如熒光素和若丹明的熒光化合物、諸如二氧雜環(huán)丁烷、吖啶類、菲啶類(phenanthridiniums)、釕以及魯米諾(Iuminol)的化學發(fā)光化合物、放射性元素、直接可視標簽以及輔因子、抑制劑和磁性顆粒。所述酶偶聯(lián)物的實例包括堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶以及半乳糖苷酶。無標簽檢測方法包括表面等離振子共振、碳納米管以及納米線以及干擾量度法。基于標簽和無標簽檢測方法為本領域已知，并公開于例如Hall etal.(2007)and by Ray et al.(2010)ProteomicslO:731-748?？赏ㄟ^本領域已知且適于所使用標簽的掃描方法，以及相關的分析軟件來實現(xiàn)檢測。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，使用突光標記和檢測方法來檢測免疫復合物?？墒褂每缮藤彽妮d玻片掃描儀(例如，Genepix4000B載玻片掃描儀(MolecularDevices, Inc.))和相關的分析軟件。在一種優(yōu)選實施方式中，使用突光標記(例如，Alexa-Fluor (Invitrogen))的抗人抗體探測免疫復合物,使用微陣列掃描儀檢測各蛋白點的突光強度?？墒褂每缮藤彽能浖?例如，GenePix Pro5.0軟件(Axon instruments))從掃描儀產(chǎn)生的數(shù)字圖像提取各特征的凈中值像素強度。可通過比較相同陣列的不同區(qū)域中的多個相同對照點的中值來對數(shù)據(jù)進行標準化。檢測到免疫復合物是生物樣品中存在神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體的標志，由此表明是神經(jīng)變性疾病的陽性診斷。本發(fā)明的另一種實施方式提供了一種診斷受試者神經(jīng)變性疾病的方法，所述方法包括:由所述受試者獲得含有免疫球蛋白的生物樣品，進行測定以確定所述生物樣品中是否存在一種或多種神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體，和如果存在一種或多種所述神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體，則診斷為患有所述疾病。
在優(yōu)選的實施方式中，所述神經(jīng)變性疾病選自:阿爾茨海默病、帕金森氏病、肌萎縮側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化癥、吉蘭-巴雷綜合征、慢性周圍神經(jīng)病、視神經(jīng)炎、血管性癡呆、強迫癥、西德納姆舞蹈病、PANDAS、橋本氏腦病、精神分裂癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血管性認知病、中風、亨廷頓病、視神經(jīng)脊髓炎、副癌綜合征、邊緣性腦炎、羅斯默森氏腦炎、橋本氏腦炎、昏睡性腦炎、僵人綜合癥、鏈球菌感染后運動障礙、風濕熱、麩質(zhì)性腸病、ASD、誦讀困難、HTLV-1相關性脊髓病/熱帶痙攣性輕截癱、重癥肌無力、蘭伯特-伊頓綜合征以及先天性多發(fā)性關節(jié)攣縮。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述受試者是人。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述含有免疫球蛋白的生物樣品為血清、全血、CSF、唾液或痰液。血液樣品可通過本領域已知方法獲得，包括靜脈穿刺或指穿刺。CSF可通過本領域已知的方法獲得，包括腰椎穿刺。為了由血液獲得血清，接收血液樣品，在足以沉淀所有細胞和血小板的速度下離心，由所產(chǎn)生的上清抽取待分析的血清。痰液和唾液樣品可通過本領域已知的方法收集?？墒褂煤线m的緩沖液稀釋生物樣品。
在優(yōu)選的實施方式中，通過如下所述進行用于診斷受試者神經(jīng)變性疾病的測定:在允許形成自身抗原與自身抗體的免疫復合物的條件下，使所述樣品與神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體的一種或多種特異性自身抗原接觸，并檢測所述免疫復合物的存在(上文有詳細描述)?？梢砸躁嚵谢騼?yōu)選微陣列的形式提供自身抗原。
本發(fā)明另一種實施方式包括一種生成受試者特異性的神經(jīng)變性疾病特異性自身抗體譜的方法，所述方法包括:由所述受試者獲得含有免疫球蛋白的生物樣品，進行測定以確定所述生物樣品中是否存在一種或多種神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體，和生成存在于樣品中的所述神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體的受試者特異性神經(jīng)變性疾病特異性自身抗體-1'TfeP曰。
在更優(yōu)選的實施方式中，所述神經(jīng)變性疾病選自:阿爾茨海默病、帕金森氏病、肌萎縮側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化癥、吉蘭-巴雷綜合征、慢性周圍神經(jīng)病、視神經(jīng)炎、血管性癡呆、強迫癥、西德納姆舞蹈病、PANDAS、橋本氏腦病、精神分裂癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血管性認知病、中風、亨廷頓病、視神經(jīng)脊髓炎、副癌綜合征、邊緣性腦炎、羅斯默森氏腦炎、橋本氏腦炎、昏睡性腦炎、僵人綜合癥、鏈球菌感染后運動障礙、風濕熱、麩質(zhì)性腸病、ASD、誦讀困難、HTLV-1相關性脊髓病/熱帶痙攣性輕截癱、重癥肌無力、蘭伯特-伊頓綜合征以及先天性多發(fā)性關節(jié)攣縮。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述受試者是人。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述含有免疫球蛋白的生物樣品為血清、全血、CSF、唾液或痰液。血液樣品可通過本領域已知方法獲得，包括靜脈穿刺或指穿刺。CSF可通過本領域已知的方法獲得，包括腰椎穿刺。為了由血液獲得血清，接收血液樣品，在足以沉淀所有細胞和血小板的速度下離心，由所產(chǎn)生的上清抽取待分析的血清。痰液和唾液樣品可通過本領域已知的方法收集?？墒褂煤线m的緩沖液稀釋生物樣品。
在優(yōu)選的實施方式中，通過如下所述進行用于診斷受試者神經(jīng)變性疾病的測定:在允許形成自身抗原與自身抗體的免疫復合物的條件下使所述樣品與神經(jīng)變性疾病特異性自身抗體的一種或多種特異性自身抗原接觸，和檢測所述免疫復合物的存在(上文有詳細描述)?？梢砸躁嚵谢騼?yōu)選微陣列的形式提供自身抗原。本發(fā)明的另一種實施方式提供了一種基材，所述基材上固定有神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體的一種或多種特異性自身抗原。在另一種實施方式中，本發(fā)明還提供了一種微陣列，所述微陣列包含基材，所述基材上固定有神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體的一種或多種特異性自身抗原。所述基材和微陣列可如上文所述制備，可用于制備神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體譜和診斷神經(jīng)變性疾病。自身抗原可包括蛋白抗原、多肽或其肽片段，所述蛋白抗原、多肽或其肽片段含有由所述疾病診斷性自身抗體識別的一種或多種表位，或由所述疾病診斷性自身抗體識別的表位擬肽。對于每種神經(jīng)變性疾病，所述基材和微陣列含有至少一種特異性自身抗原，優(yōu)選對每種神經(jīng)變性疾病含有約兩種至約三十種特異性自身抗原。所述基材和微陣列可含有多組(panels)自身抗原，其中各組含有對于特定神經(jīng)變性疾病的診斷性自身抗原。這樣的多基材和多陣列允許在相同測定中診斷多于一種的神經(jīng)變性疾病，還允許區(qū)分神經(jīng)變性疾病。在優(yōu)選的實施方式中，所述神經(jīng)變性疾病選自:阿爾茨海默病、帕金森氏病、肌萎縮側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化癥、吉蘭-巴雷綜合征、慢性周圍神經(jīng)病、視神經(jīng)炎、血管性癡呆、強迫癥、西德納姆舞蹈病、PANDAS、橋本氏腦病、精神分裂癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血管性認知病、中風、亨廷頓病、視神經(jīng)脊髓炎、副癌綜合征、邊緣性腦炎、羅斯默森氏腦炎、橋本氏腦炎、昏睡性腦炎、僵人綜合癥、鏈球菌感染后運動障礙、風濕熱、麩質(zhì)性腸病、ASD、誦讀困難、HTLV-1相關性脊髓病/熱帶痙攣性輕截癱、重癥肌無力、蘭伯特-伊頓綜合征以及先天性多發(fā)性關節(jié)攣縮。在另一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種用于檢測樣品中神經(jīng)變性疾病特異性自身抗體的試劑盒。所述試劑盒包含神經(jīng)變性疾病特異性自身抗體的一種或多種特異性自身抗原和用于檢測所述自身抗原與所述樣品中自身抗體結(jié)合的工具。所述試劑盒還包含包裝材料(packaging material),所述包裝材料包括指示所述試劑盒的所述一種或多種自身抗原可用于鑒定神經(jīng)變性疾病的標簽。所述試劑盒中可包含本領域技術人員已知可包含在此類試劑盒中其他組分，諸如緩沖液、對照、檢測試劑等。所述試劑盒可用于檢測神經(jīng)變性疾病特異性自身抗體和診斷神經(jīng)變性疾病。阿爾茨海默病本文中阿爾茨海默病(AD)診斷性自身抗體被定義為特異性結(jié)合蛋白或肽抗原和作為可用于區(qū)分阿爾茨海默病與沒有患有阿爾茨海默病的對照受試者的診斷指示劑的抗體。已經(jīng)鑒定為可潛在用于診斷性指示劑的蛋白抗原列于下表I中。表I中的蛋白抗原通過本領域接受的名稱及數(shù)據(jù)庫識別號而確定。數(shù)據(jù)庫識別號是指可公開獲得的美國國家生物技術信息中心(NCBI)蛋白數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫為本領域公知并為本領域普通技術人員可獲得。表I
權(quán)利要求
1.用于檢測受試者的神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體的方法，所述方法包括: (a)從所述受試者獲得含有免疫球蛋白的生物樣品；和 (b)進行測定以確定所述生物樣品中是否存在一種或多種神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體。
2.用于診斷受試者的神經(jīng)變性疾病的方法，所述方法包括: (a)從所述受試者獲得含有免疫球蛋白的生物樣品； (b)進行測定以確定所述生物樣品中是否存在一種或多種神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體；以及 (C)如果存在一種或多種所述神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體，則診斷為所述神經(jīng)變性疾病。
3.用于鑒定處于發(fā)生神經(jīng)變性疾病風險的受試者的方法，所述方法包括: (a)從所述受試者獲得含有免疫球蛋白的生物樣品； (b)進行測定以確定所述生物樣品中是否存在一種或多種神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體；以及 (C)如果存在一種或多種所述神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體，則將所述受試者鑒定為處于發(fā)生所述神經(jīng)變性疾病風險。
4.用于生成受試者特異性神經(jīng)變性疾病特異性自身抗體譜的方法，所述方法包括: (a)從受試者獲得含有免疫球蛋白的生物樣品； (b)進行測定以確定所述生物樣品中是否存在一種或多種神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體；以及 (C)生成存在于所述樣品中的疾病診斷性自身抗體的受試者特異性神經(jīng)變性疾病特異性自身抗體譜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病選自:阿爾茨海默病、帕金森氏病、肌萎縮側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化癥、吉蘭-巴雷綜合征、慢性周圍神經(jīng)病、視神經(jīng)炎、血管性癡呆、強迫癥、西德納姆舞蹈病、PANDAS、橋本氏腦病、精神分裂癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血管性認知病、中風、亨廷頓病、視神經(jīng)脊髓炎、副癌綜合征、邊緣性腦炎、羅斯默森氏腦炎、橋本氏腦炎、昏睡性腦炎、僵人綜合癥、鏈球菌感染后運動障礙、風濕熱、麩質(zhì)性腸病、ASD、孤獨癥、誦讀困難、HTLV-1相關性脊髓病/熱帶痙攣性輕截癱、重癥肌無力、蘭伯特-伊頓綜合征以及先天性多發(fā)性關節(jié)攣縮。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的方法，其中所述受試者是人。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的方法，其中所述生物樣品選自全血、血清、腦脊液、唾液和痰液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的方法，其中通過如下進行所述測定:在允許形成自身抗原與自身抗體免疫復合物的條件下，使所述樣品與神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體的一種或多種特異性自身抗原接觸，并檢測是否存在所述免疫復合物，其中存在所述免疫復合物則表明存在神經(jīng)變性疾病特異性自身抗體，其中不存在所述免疫復合物則表明不存在神經(jīng)變性疾病特異性自身抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中使所述一種或多種自身抗原連接到基材。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述一種或多種自身抗原為陣列形式。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述陣列為微陣列。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述基材為硝酸纖維素包被的載玻片。
13.—種基材，所述基材上固定有神經(jīng)變性疾病診斷性自身抗體的一種或多種特異性自身抗原。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的基材，其上固定有可分別定位的多種自身抗原，所述自身抗原對神經(jīng)變性疾病針對性自身抗體具有特異性。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的基材，其包含多組自身抗原，其中每一組含有用于一種神經(jīng)變性疾病的診斷性自身抗原。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的基材，其中所述基材為載玻片或微珠。
17.—種微陣列，所述微陣列包含基材，所述基材上固定有神經(jīng)變性疾病特異性自身抗體的一種或多種特異性自身抗原。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的微陣列，其包含多組自身抗原，其中每一組含有用于一種神經(jīng)變性疾病的診斷 性自身抗原。
19.一種試劑盒，其包含神經(jīng)變性疾病特異性自身抗體的一種或多種特異性自身抗原和用于檢測所述自身抗原與含免疫球蛋白的生物樣品中的自身抗體結(jié)合的工具。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中所述一種或多種自身抗原固定于基材上。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于檢測神經(jīng)變性疾病特異性自身抗體，用于診斷神經(jīng)變性疾病和處于發(fā)生神經(jīng)變性疾病風險，以及用于生成患者特異性神經(jīng)變性疾病的診斷性自身抗體譜的方法、組合物以及試劑盒。
文檔編號G01N33/567GK103154736SQ201180034612
公開日2013年6月12日 申請日期2011年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日
發(fā)明者羅伯特·G·納格勒 申請人:新澤西醫(yī)科和牙科大學