專利名稱：光學(xué)分析裝置、光學(xué)分析方法和用于光學(xué)分析的計(jì)算機(jī)程序的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對來自分散或溶解于溶液中的原子、分子或團(tuán)聚體(在下文中，這些均稱作“粒子”)的光進(jìn)行檢測以用于分析溶液中的粒子的狀態(tài)的光學(xué)分析裝置、光學(xué)分析方法和用于光學(xué)分析的計(jì)算機(jī)程序，更具體地，本發(fā)明涉及如下的光學(xué)分析裝置、光學(xué)分析方法和用于光學(xué)分析的計(jì)算機(jī)程序其能夠通過使用諸如共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能對來自溶液中的微小區(qū)域的光進(jìn)行檢測的光學(xué)系統(tǒng)來獲取對分析例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或其團(tuán)聚體等生物分子以及例如病毒、細(xì)胞或非生物粒子等粒狀物等等各種粒子的狀態(tài)(相互作用、結(jié)合或離解狀態(tài)，等等)有用的信息。
背景技術(shù)：
根據(jù)近年來光學(xué)測量技術(shù)的發(fā)展，通過使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和能夠?qū)庾佑?jì)數(shù)(單光子檢測)的超高靈敏度光檢測技術(shù)，使得單光子或單熒光分子水平的微弱光的檢測和/或測量成為可能。因此，提出了借助于這種微弱光檢測技術(shù)對生物分子等的分子間相互作用、結(jié)合或離解反應(yīng)進(jìn)行檢測的各種裝置或方法。例如，在熒光相關(guān)光譜分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy :FCS,參見例如專利文獻(xiàn)I和2以及非專利文獻(xiàn)1-3)中，借助于激光共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)，對進(jìn)出樣品溶液中的微小區(qū)域(顯微鏡的激光會聚的聚焦區(qū)域，稱作“共聚焦體積”)的熒光分子或熒光標(biāo)記分子(熒光分子等)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測量，并且基于由測得的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值所確定的熒光分子等在微小區(qū)域中的平均駐留時間(平移擴(kuò)散時間)和駐留分子數(shù)的平均值，實(shí)現(xiàn)了諸如熒光分子等的運(yùn)動速度、尺寸或濃度等信息的獲取和/或諸如分子的結(jié)構(gòu)或大小的變化、分子的結(jié)合或離解反應(yīng)或者分散和團(tuán)聚等各種現(xiàn)象的檢測。此外，在熒光強(qiáng)度分布分析(Fluorescence Intensity Distribution Analysis :FIDA,例如專利文獻(xiàn)3)或者光子計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析(Photon Counting Histogram :PCH,例如專利文獻(xiàn)4)中，生成了通過與FCS類似的方式測得的進(jìn)出共聚焦體積的熒光分子等的熒光強(qiáng)度的直方圖，并且通過將統(tǒng)計(jì)模型公式與直方圖的分布擬合來計(jì)算熒光分子等的特征亮度的平均值以及共聚焦體積內(nèi)駐留的分子的平均數(shù)，從而，將基于這些信息估算分子的結(jié)構(gòu)或尺寸變化、結(jié)合或離解狀態(tài)或者分散和團(tuán)聚狀態(tài)。此外，在專利文獻(xiàn)5和6中，提出了基于使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)測得的樣品溶液中熒光信號的時間演進(jìn)來檢測熒光物質(zhì)的方法。專利文獻(xiàn)7提出了ー種信號計(jì)算處理技木，其利用光子計(jì)數(shù)技術(shù)測量來自流過流式細(xì)胞儀的熒光微粒或者來自固定在基板上的熒光微粒的微弱光，以檢測熒光微粒是否存在于流體中或者基板上。特別地，根據(jù)諸如FCS和FIDA等采用了使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)來對微小區(qū)域進(jìn)行熒光測量的技術(shù)的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，測量所需的樣品量可以極少(一次測量所使用的量最多幾十U L)且濃度極低，并且測量時間也大幅縮短(在一次測量中，反復(fù)進(jìn)行若干次時間為秒量級的測量)。因此，特別是在對醫(yī)學(xué)或生物學(xué)研究和開發(fā)領(lǐng)域中常用的稀有或昂貴的樣品進(jìn)行分析時，或者在諸如疾病臨床診斷或生物活性物質(zhì)的篩選等對大量的樣本進(jìn)行試驗(yàn)時，期望這些技術(shù)與傳統(tǒng)的生化方法相比是使得能夠以低成本和/或快速地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或試驗(yàn)的強(qiáng)力的手段?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :日本特開2005-098876專利文獻(xiàn)2 :日本特開2008-292371專利文獻(xiàn)3 日本特許第4023523號專利文獻(xiàn)4 :國際公開2008-080417專利文獻(xiàn)5 :日本特開2007-20565專利文獻(xiàn)6 :日本特開2008-116440專利文獻(xiàn)7 :日本特開平4-337446號公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I :金城政孝，“蛋白質(zhì)，核酸,酵素”，Vol. 44，No. 9,1431 — 1438頁，1999 年。非專利文獻(xiàn)2 F. J.梅耶-阿姆茲(F. J. Meyer-Alms),熒光相關(guān)光譜學(xué)(Fluorescence Correlation Spectroscopy), R 里格爾(R. Rigler)編，施普林格(Springer)，柏林，2000 年,204 — 224 頁。非專利文獻(xiàn)3 :加藤則子外4名，遺傳子醫(yī)學(xué)，Vol. 6，No. 2，271 — 277頁。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題在諸如FCS、FIDA和PCH等上述光學(xué)分析技術(shù)中，簡要地說，通過統(tǒng)計(jì)處理算出測得的熒光強(qiáng)度的時間波動的大小，然后基于波動的大小確定在樣品溶液中的微小區(qū)域內(nèi)進(jìn)出的熒光分子等的各種特性。因此，為了在上述光學(xué)分析技術(shù)中獲得顯著的結(jié)果，優(yōu)選的是，以如下方式準(zhǔn)備被用作樣品溶液中的觀測對象的熒光分子等的濃度或數(shù)密度使得在平衡狀態(tài)下，在秒量級長度的一次測量時間內(nèi)，有使得統(tǒng)計(jì)處理能夠進(jìn)行的數(shù)量的熒光分子等將進(jìn)出微小區(qū)域，優(yōu)選地使得在微小區(qū)域中將總是存在大約ー個熒光分子等(典型地，由于共聚焦體積的體積為大約lfL，所以優(yōu)選的是熒光分子等的濃度為大約InM以上)。換言之，當(dāng)樣品溶液中被觀測粒子的濃度或數(shù)密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于使得統(tǒng)計(jì)處理能夠進(jìn)行的水平(例如，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于InM)時，會出現(xiàn)在測量時間內(nèi)很少有被觀測對象進(jìn)入到微小區(qū)域內(nèi)的狀態(tài)，因此，熒光強(qiáng)度的測量結(jié)果會包括很長一段時間的在微小區(qū)域內(nèi)完全不存在被觀測對象的狀態(tài)，并且顯著的熒光強(qiáng)度的觀測量也會減小，因此，不能夠期望在如上所述基于熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)波動的光學(xué)分析技術(shù)中有顯著的或精確的分析結(jié)果。
在專利文獻(xiàn)5和6中描述的使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測熒光物質(zhì)的方法中，在未對熒光強(qiáng)度波動如上所述地進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理的情況下，能夠根據(jù)遍及數(shù)秒的測量時間內(nèi)是否產(chǎn)生具有顯著強(qiáng)度的熒光信號來確定樣品中是否存在被觀測熒光分子等，并且公開了，已經(jīng)獲得具有顯著強(qiáng)度的熒光信號的頻率與樣品中熒光分子等的數(shù)量之間的相關(guān)性。特別地，在專利文獻(xiàn)6中啟示，攪動樣品溶液的內(nèi)部的隨機(jī)流動的發(fā)生改善檢測敏感度。然而，即使在那些方法中，也僅僅檢測到是否存在由于擴(kuò)散或隨機(jī)流動而隨機(jī)地進(jìn)出微小區(qū)域的熒光分子等，而不能掌握微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的粒子的行為，所以，例如沒有實(shí)現(xiàn)粒子的計(jì)數(shù)或者粒子的濃度或數(shù)密度的定量計(jì)算。此外，專利文獻(xiàn)7中描述的技術(shù)在于檢測流式細(xì)胞儀中的流體內(nèi)是否存在單個熒光微粒或者檢測是否存在固定于基板上的單個熒光微粒，而不是用于對在樣品溶液中在通常狀態(tài)下被溶解或分散的諸如分子和膠體等粒子、即在樣品溶液中隨機(jī)移動的粒子進(jìn)行檢測的技術(shù)，因此，沒有實(shí)現(xiàn)定量地算出樣品溶液內(nèi)溶解或分散的粒子的濃度或數(shù)密度。此外，由于專利文獻(xiàn)7的技術(shù)包括諸如流式細(xì)胞儀中的測量或?qū)晒饬Ｗ庸潭ㄓ诨宓奶幚淼冗^程，所以與諸如FCS、FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)的情況相比，大大地増加了試驗(yàn)所需的樣品量，并且對于進(jìn)行試驗(yàn)的人員可能要求復(fù)雜且先進(jìn)的操作技術(shù)。因此，本發(fā)明的ー個目的在于提供一種新的光學(xué)分析技術(shù)，該技術(shù)不包括諸如FCS,FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)中進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)處理，使得能夠在包含的被觀測粒子的濃度或數(shù)密度比諸如FCS、FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)所能夠處理的水平低的樣品溶液中檢測被觀測粒子的狀態(tài)或特性。
另外，本發(fā)明的另一目的在于提供一種實(shí)現(xiàn)上述新的光學(xué)分析技術(shù)的光學(xué)分析裝置、方法或用于光學(xué)分析的計(jì)算機(jī)程序，其中，能夠在與諸如FCS、FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)相似的短的測量時間內(nèi)利用少量樣品(例如，數(shù)十U L的水平)完成測量，還能夠定量地確定被觀測粒子的諸如濃度或數(shù)密度等特性。用于解決問題的方案總的來說，在本發(fā)明中，提出了ー種新型光學(xué)分析技木，該技術(shù)借助于諸如共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠?qū)碜匀芤褐械奈⑿^(qū)域的光進(jìn)行檢測的光學(xué)系統(tǒng)對分散在樣品溶液中且在樣品溶液中隨機(jī)地移動的發(fā)光的粒子(以下稱為“發(fā)光粒子”)發(fā)出的光進(jìn)行檢測，該技術(shù)在使微小區(qū)域的位置在樣品溶液中移動的同時(即，在利用微小區(qū)域掃描樣品溶液的內(nèi)部的同吋)對來自微小區(qū)域、即光檢測區(qū)域的光進(jìn)行檢測，由此單個地檢測橫穿微小區(qū)域的內(nèi)部的發(fā)光粒子，并且使得能夠?qū)Πl(fā)光粒子計(jì)數(shù)和能夠獲取關(guān)于樣品溶液內(nèi)的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度的信息。根據(jù)本發(fā)明，作為ー個方面，提供ー種光學(xué)分析裝置，其通過使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)對來自發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測，所述發(fā)光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機(jī)地移動，其特征在于，所述光學(xué)分析裝置包括光檢測區(qū)域移動部，其使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動；光檢測部，其對來自所述光檢測區(qū)域的光進(jìn)行檢測；和信號處理部，其生成在所述光檢測區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動的過程中利用所述光檢測部檢測到的來自所述光檢測區(qū)域的光的時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，并且在所述時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中單個地檢測來自每個所述發(fā)光粒子的光信號；其中，所述信號處理部計(jì)算表示在所述時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的每個預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)是否存在來自單個發(fā)光粒子的光的光強(qiáng)度的特征值，并且使用所述特征值單個地檢測來自每個所述發(fā)光粒子的光信號。在該結(jié)構(gòu)中，“分散在樣品溶液中且在樣品溶液中隨機(jī)地移動的發(fā)光粒子”是能發(fā)光且分散或溶解在樣品溶液中的諸如原子、分子或其團(tuán)聚體等粒子，并且可以是在溶液中自由地進(jìn)行布朗運(yùn)動而未固定于基板的任意微粒物質(zhì)等。該發(fā)光粒子典型地為熒光粒子，但是也可以是通過磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等而發(fā)光的粒子。共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的“光檢測區(qū)域”是那些顯微鏡中的檢測光的微小區(qū)域，該區(qū)域與當(dāng)照明光從物鏡發(fā)出時將照明光會聚到的區(qū)域?qū)?yīng)(該區(qū)域根據(jù)共聚焦顯微鏡中的、特別是物鏡和針孔之間的空間關(guān)系來確定。對于在沒有照明光的情況下發(fā)光的發(fā)光粒子，例如根據(jù)化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光的粒子，在顯微鏡中不需要照明光。)在這方面，在本說明書中，“光信號”是指“表示光的信號”。如從以上可以理解到的，在本發(fā)明的裝置的基本結(jié)構(gòu)中，首先，在使光檢測區(qū)域的位置在樣品溶液中移動的同時，即在利用光檢測區(qū)域掃描樣品溶液的內(nèi)部的同時，順次地進(jìn)行光的檢測。因此，當(dāng)移動的光檢測區(qū)域包括隨機(jī)地移動的發(fā)光粒子時，通過光檢測區(qū)域來檢測來自發(fā)光粒子的光，由此，通過捕獲該光將檢測到存在一個發(fā)光粒子。在這方面，更詳細(xì)地，在從光檢測部以時間序列輸出的信號、即光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，在來自單個發(fā)光粒子的光到達(dá)光檢測部的時間區(qū)間內(nèi)的光檢測部的輸出信號的值以脈沖形式變化，其特性不同于沒有來自發(fā)光粒子的光到達(dá)并且僅產(chǎn)生噪聲的時間區(qū)間內(nèi)的值。因此，將本發(fā)明的裝置的信號處理部設(shè)計(jì)成根據(jù)光檢測部順次地檢測到的信號產(chǎn)生時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；計(jì)算出表示在時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的每個預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)是否存在來自單個發(fā)光粒子的光的光強(qiáng)度的特征值，并且使用該特征值單個地檢測來自各個發(fā)光粒子的光信號。
關(guān)于特征值，可以采用如下的任意的值該值在存在來自單個發(fā)光粒子的光的預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的大小比不存在來自單個發(fā)光粒子的光的預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的大小變大。在那種情況下，當(dāng)光強(qiáng)度的特征值大于預(yù)定閾值時，判定為該預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)存在來自發(fā)光粒子的光信號。例如，該特征值可以是預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的光強(qiáng)度的累計(jì)值、光強(qiáng)度的中心值、光強(qiáng)度的平均值、光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差、光強(qiáng)度的方差、光強(qiáng)度的熵、光強(qiáng)度的最大值和根據(jù)光強(qiáng)度的相關(guān)時間設(shè)定為0的自相關(guān)函數(shù)值計(jì)算的粒子數(shù)中的任ー個。在這方面，典型地，光檢測部通過光子計(jì)數(shù)來檢測來自光檢測區(qū)域的光，因此，在那種情況下，時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)。因此，光強(qiáng)度的特征值可以是選自以下組的值該組由預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)光子數(shù)的總值、光子數(shù)的中心值、光子數(shù)的平均值、光子數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、光子數(shù)的方差、光子數(shù)的熵、光子數(shù)的最大值和根據(jù)光子數(shù)的相關(guān)時間設(shè)定為0的自相關(guān)函數(shù)值計(jì)算的粒子數(shù)構(gòu)成。另外，在如上所述對于每個預(yù)定寬度的時間區(qū)間使用特征值檢測發(fā)光粒子的信號的方法的情況下，如果預(yù)定寬度比從ー個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時到該發(fā)光粒子離開光檢測區(qū)域時的間隔所需的時間寬度短，則將在兩個以上時間區(qū)間上檢測到ー個發(fā)光粒子的光；然而當(dāng)預(yù)定寬度長以致于包含了多個發(fā)光粒子的光的到達(dá)時間時，一個時間區(qū)間內(nèi)將包括關(guān)于兩個以上的發(fā)光粒子的信息，因而在任何一種情況下，并未建立一個發(fā)光粒子對應(yīng)于ー個時間區(qū)間的關(guān)系，因此，用于單個地檢測來自每個發(fā)光粒子的光信號的信號處理將變得復(fù)雜。因此，優(yōu)選地，預(yù)定寬度被設(shè)定為實(shí)質(zhì)上比從ー個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時到該發(fā)光粒子離開光檢測區(qū)域時的間隔所需的時間寬度長，并且實(shí)質(zhì)上比從ー個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時到另一個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時的時間寬度短。換言之，時間區(qū)間的預(yù)定寬度的下限被設(shè)定為實(shí)質(zhì)上比一個發(fā)光粒子的光信號的時間寬度長，并且預(yù)定寬度的上限被設(shè)定為使得各個時間區(qū)間內(nèi)包含的發(fā)光粒子數(shù)實(shí)質(zhì)上將不多于ー個粒子。在這方面，在上述表達(dá)中，“實(shí)質(zhì)上比從ー個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時到該發(fā)光粒子離開光檢測區(qū)域時的間隔所需的時間寬度長”或“實(shí)質(zhì)上比一個發(fā)光粒子的光信號的時間寬度長”意味著預(yù)定寬度被設(shè)定為比大多數(shù)發(fā)光粒子的光信號的時間寬度長，也就是在誤差范圍內(nèi)允許時間寬度比預(yù)定寬度長的發(fā)光粒子的光信號存在。同樣地，“實(shí)質(zhì)上比從ー個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時到另一個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時的時間寬度短”或“使得各個時間區(qū)間內(nèi)包含的發(fā)光粒子數(shù)實(shí)質(zhì)上將不多于ー個粒子”意味著預(yù)定寬度被設(shè)定為使得在大多數(shù)時間區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)的發(fā)光粒子數(shù)不多于ー個粒子，也就是在誤差范圍內(nèi)允許包含兩個以上的發(fā)光粒子的時間區(qū)間存在。根據(jù)該結(jié)構(gòu)，當(dāng)確定了存在來自發(fā)光粒子的光的ー個時間區(qū)間時，在大多數(shù)情況下，可以判定時間區(qū)間內(nèi)包括的光信號是來自一個發(fā)光粒子的光信號，從而能夠確定存在一個發(fā)光粒子，因此，單個地檢測發(fā)光粒子的處理變得有利地簡單。當(dāng)樣品溶液中隨機(jī)移動的發(fā)光粒子成為能夠如上所述地被單個地檢測時，將獲取關(guān)于溶液中的發(fā)光粒子的狀態(tài)的各種信息。具體地，例如，在本發(fā)明的裝置中，信號處理部可以被設(shè)計(jì)成通過對發(fā)光粒子的單個地檢測的光信號的數(shù)量計(jì)數(shù)(發(fā)光粒子的計(jì)數(shù))，來對在光檢測區(qū)域的位置移動的過程中檢測到的發(fā)光粒子的數(shù)量計(jì)數(shù)。在那種情況下，如上所述，當(dāng)使用各個預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的光強(qiáng)度的特征值來単獨(dú)檢測發(fā)光粒子時，具有來自發(fā)光粒子的光信號的預(yù)定寬度的時間區(qū)間數(shù)對應(yīng)于發(fā)光粒子數(shù)，由此通過對具有來自發(fā)光粒子的光信號的預(yù)定寬度的時間區(qū)間的數(shù)量計(jì)數(shù)，來對在光檢測區(qū)域的位置移動的過程 中檢測到的發(fā)光粒子的數(shù)量計(jì)數(shù)。根據(jù)該結(jié)構(gòu)，通過將發(fā)光粒子數(shù)與光檢測區(qū)域的位置的移動量關(guān)聯(lián)，將獲取關(guān)于樣品溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度的信息。特別地，通過利用任意方法確定光檢測區(qū)域的位置的運(yùn)動軌跡的總體積，例如通過以預(yù)定速度使光檢測區(qū)域的位置移動，能夠具體地計(jì)算發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。當(dāng)然，代替直接確定數(shù)密度或濃度的絕對值，可以計(jì)算出數(shù)密度或濃度相對于多個樣品溶液或者相對于作為濃度或數(shù)密度的基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對比率。此外，在上述本發(fā)明的裝置中，基于發(fā)光粒子的特性或樣品溶液內(nèi)發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度來適當(dāng)?shù)馗淖児鈾z測區(qū)域的位置在樣品溶液中的移動速度。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的，來自發(fā)光粒子的被檢測到的光的狀態(tài)可以根據(jù)發(fā)光粒子的特性或樣品溶液內(nèi)發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度而改變。特別地，當(dāng)光檢測區(qū)域的移動速度變快時，從ー個發(fā)光粒子獲得的光量將減小，所以，優(yōu)選的是能夠適當(dāng)?shù)馗淖児鈾z測區(qū)域的移動速度，使得能夠以精確的或足夠的靈敏度測量來自ー個發(fā)光粒子的光。此外，在本發(fā)明的裝置中，優(yōu)選地，將光檢測區(qū)域的位置在樣品溶液中的移動速度設(shè)定為高于作為待檢測對象的發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動速度(粒子由于布朗運(yùn)動而移動的平均移動速度)。如上所述，當(dāng)光檢測區(qū)域通過存在發(fā)光粒子的位置時，本發(fā)明的裝置檢測到從發(fā)光粒子發(fā)出的光，由此單個地檢測發(fā)光粒子。然而，當(dāng)發(fā)光粒子由于布朗運(yùn)動而隨機(jī)地移動以致多次進(jìn)出光檢測區(qū)域時，將多次檢測到來自ー個發(fā)光粒子的光信號(表明存在發(fā)光粒子)，所以，使存在一個發(fā)光粒子與檢測到的光信號相關(guān)聯(lián)變得困難。因此，如上所述，將光檢測區(qū)域的移動速度設(shè)定為高于發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動速度，由此，變成能夠使ー個發(fā)光粒子與ー個光信號(表明存在發(fā)光粒子)相對應(yīng)。在這方面，由于擴(kuò)散移動速度取決于發(fā)光粒子而不同，所以，優(yōu)選地，如上所述可以將本發(fā)明的裝置設(shè)計(jì)成能夠根據(jù)發(fā)光粒子的特性(特別是擴(kuò)散常數(shù))來適當(dāng)?shù)馗淖児鈾z測區(qū)域的移動速度?？梢砸匀我夥绞绞沟霉鈾z測區(qū)域的位置移動。例如，可以通過使用激光掃描型光顯微鏡中采用的電流鏡改變光路來改變光檢測區(qū)域的位置，或者在光檢測區(qū)域不移動吋，可以通過移動樣品溶液的位置(移動顯微鏡的載物臺)來使光檢測區(qū)域的位置在樣品溶液中移動。光檢測區(qū)域的位置移動軌跡可以任意地設(shè)定，例如，該移動軌跡可以從圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線中選擇。在上述本發(fā)明的裝置中與使光檢測區(qū)域的位置在樣品溶液中移動一起進(jìn)行光檢測、并且對來自每個發(fā)光粒子的光信號單個地進(jìn)行檢測的光學(xué)分析技術(shù)的處理也可以通過通用計(jì)算機(jī)來實(shí)現(xiàn)。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種用于光學(xué)分析的計(jì)算機(jī)程序，其用于通過使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)對來自發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測，所述發(fā)光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機(jī)地移動，其特征在于，所述計(jì)算機(jī)程序使計(jì)算機(jī)執(zhí)行如下進(jìn)程使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動；在使所述光檢測區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動的同時對來自所述光檢測區(qū)域的光進(jìn)行檢測，并且產(chǎn)生時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；計(jì)算光強(qiáng)度的特征值，其中，所述特征值表示在所述時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的每個預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)是否存在來自單個發(fā)光粒子的光；和使用每個所述預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的光強(qiáng)度的特征值，單個地檢測來自每個發(fā)光粒子的光信號。另外，該計(jì)算機(jī)程序可以包括通過對單個地檢測出的來自發(fā)光粒子的光信號的數(shù)量計(jì)數(shù)或者通過對具有來自發(fā)光粒子的光信號的預(yù)定寬度的時間區(qū)間的數(shù)量計(jì)數(shù)，來對在光檢測區(qū)域的位置移動的過程中檢測到的發(fā)光粒子的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)的進(jìn)程；和/或基于檢測到的發(fā)光粒子數(shù)來確定樣品溶液內(nèi)的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度的進(jìn)程。典型地，在檢測來自光檢測區(qū)域的光以產(chǎn)生時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的進(jìn)程中，通過光子計(jì)數(shù)來檢測來自光檢測區(qū)域的光，并且在那種情況下，時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)。在使光檢測區(qū)域的位置移動的進(jìn)程中，可以使光檢測區(qū)域的位置以預(yù)定的速度或者比發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動速度快的速度移動，并且可以基于發(fā)光粒子的特性或樣品溶液內(nèi)發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度來設(shè)定光檢測區(qū)域的位置的移動速度。光檢測區(qū)域的位置的移動軌跡可以從圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線中選擇。此外，同樣在上述本發(fā)明的計(jì)算機(jī)程序中，預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)光強(qiáng)度的特征值可以是如下這樣的值該值在存在來自單個發(fā)光粒子的光時比不存在來自單個發(fā)光粒子時變大，并且當(dāng)光強(qiáng)度的特征值大于預(yù)定閾值時，可以判定為預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)存在來自發(fā)光粒子的光信號。具體地，該特征值可以采用預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的光強(qiáng)度的累計(jì)值、光強(qiáng)度的中心值、光強(qiáng)度的平均值、光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差、光強(qiáng)度的方差、光強(qiáng)度的熵、光強(qiáng)度的最大值和根據(jù)光強(qiáng)度的相關(guān)時間設(shè)定為0的自相關(guān)函數(shù)值計(jì)算的粒子數(shù)中的任ー個。特別地，當(dāng)時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)時，光強(qiáng)度的特征值可以是選自以下組的值該組由預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)光子數(shù)的總值、光子數(shù)的中心值、光子數(shù)的平均值、光子數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、光子數(shù)的方差、光子數(shù)的熵、光子數(shù)的最大值和根據(jù)光子數(shù)的相關(guān)時間設(shè)定為0的自相關(guān)函數(shù)值計(jì)算的粒子數(shù)構(gòu)成。此外，優(yōu)選地，將如上所述的時間區(qū)間的預(yù)定寬度設(shè)定為實(shí)質(zhì)上比從ー個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時到該發(fā)光粒子離開光檢測區(qū)域時的間隔所需的時間寬度長，并且實(shí)質(zhì)上比從ー個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時到另一個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時的時間寬度短。此外，根據(jù)上述本發(fā)明的裝置或計(jì)算機(jī)程序，實(shí)現(xiàn)了新的光學(xué)分析方法，該方法通過與使光檢測區(qū)域的位置在樣品溶液中移動一起對光進(jìn)行檢測，來單個地檢測來自每個發(fā)光粒子的光信號。因此，本發(fā)明的光學(xué)分析方法，其通過使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)對來自發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測，所述發(fā)光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機(jī)地移動，其特征在于，所述方法包括如下步驟使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動；在使所述光檢測區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動的同時對來自所述光檢測區(qū)域的光進(jìn)行檢測，并且產(chǎn)生時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；計(jì)算光強(qiáng)度的特征值，其中，所述特征值表示在所述時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的每個預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)是否存在來自單個發(fā)光粒子的光；和使用每個所述預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的光強(qiáng)度的特征值，單個地檢測來自每個發(fā)光粒子的光信號。該方法也可以包括通過對單個地檢測出的來自發(fā)光粒子的光信號的數(shù)量計(jì)數(shù)或通過對具有來自發(fā)光粒子的光信號的預(yù)定寬度的時間區(qū)間的數(shù)量計(jì)數(shù)，來對在光檢測區(qū)域的位置移動的過程中檢測到的發(fā)光粒子的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)的步驟；和/或基于檢測到的發(fā)光粒子數(shù)來確定樣品溶液內(nèi)的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度的步驟。典型地，在檢測來自光檢測區(qū)域的光以產(chǎn)生時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的步驟中，通過光子計(jì)數(shù)來檢測來自光檢測區(qū)域的光，并且在那種情況下，時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)。此外，在使光檢測區(qū)域的位置移動的步驟中，可以使光檢測區(qū)域的位置以預(yù)定的速度或者比發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動速度快的速度移動，并且可以基于發(fā)光粒子的特性或樣品溶液內(nèi)發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度來設(shè)定光檢測區(qū)域的位置的移動速度。光檢測區(qū)域的位置的移動軌跡可以從圓形、橢圓 形、矩形、直線和曲線中選擇。此外，同樣在上述方法中，預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)光強(qiáng)度的特征值可以是如下這樣的值該值在存在來自單個發(fā)光粒子的光時比不存在來自單個發(fā)光粒子時變大，并且當(dāng)光強(qiáng)度的特征值大于預(yù)定閾值時，可以判定為預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)存在來自發(fā)光粒子的光信號。具體地，該特征值可以采用預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的光強(qiáng)度的累計(jì)值、光強(qiáng)度的中心值、光強(qiáng)度的平均值、光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差、光強(qiáng)度的方差、光強(qiáng)度的熵、光強(qiáng)度的最大值和根據(jù)光強(qiáng)度的相關(guān)時間設(shè)定為0的自相關(guān)函數(shù)值計(jì)算的粒子數(shù)中的任ー個。特別地，當(dāng)時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)時，光強(qiáng)度的特征值可以是選自以下組的值該組由預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)光子數(shù)的總值、光子數(shù)的中心值、光子數(shù)的平均值、光子數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、光子數(shù)的方差、光子數(shù)的熵、光子數(shù)的最大值和根據(jù)光子數(shù)的相關(guān)時間設(shè)定為0的自相關(guān)函數(shù)值計(jì)算的粒子數(shù)構(gòu)成。此外，優(yōu)選地，將如上所述的時間區(qū)間的預(yù)定寬度設(shè)定為實(shí)質(zhì)上比從ー個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時到該發(fā)光粒子離開光檢測區(qū)域時的間隔所需的時間寬度長，并且實(shí)質(zhì)上比從ー個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時到另一個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時的時間寬度短。發(fā)明的效果通過上述本發(fā)明的裝置、方法或計(jì)算機(jī)程序?qū)崿F(xiàn)的光學(xué)分析技術(shù)為自身的光檢測機(jī)構(gòu)采用了如下結(jié)構(gòu)與諸如FCS、FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)的情況類似，對來自共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡中的光檢測區(qū)域的光進(jìn)行檢測，因此，樣品溶液的量可以同樣地少。然而，由于在本發(fā)明中未進(jìn)行計(jì)算熒光強(qiáng)度波動的統(tǒng)計(jì)處理，所以本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)適用于發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度大大地低于諸如FCS、FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)所需的水平的樣品溶液。此外，由于在本發(fā)明中對分散或溶解在溶液中的每個發(fā)光粒子單個地進(jìn)行檢測，所以通過使用關(guān)于粒子的信息能夠定量地進(jìn)行發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)、樣品溶液中發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度的計(jì)算或者獲取關(guān)于濃度或數(shù)密度的信息。例如，雖然專利文獻(xiàn)5和6能夠獲取在預(yù)定時間內(nèi)強(qiáng)度超過預(yù)定閾值的熒光信號的頻率的總數(shù)與樣品溶液中熒光分子等的粒子數(shù)之間的相關(guān)性，但是不能掌握通過測量區(qū)域的粒子的動態(tài)行為(粒子是徑直通過測量區(qū)域或是駐留在測量區(qū)域內(nèi))，因此，強(qiáng)度比預(yù)定閾值高的熒光信號與通過測量區(qū)域的粒子之間的對應(yīng)關(guān)系不清楚，從而發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)從理論上講是不可能的，從而難以精確地確定樣品溶液內(nèi)粒子的濃度。然而，根據(jù)本發(fā)明，由于使得通過光檢測區(qū)域的發(fā)光粒子與發(fā)光粒子的光信號到達(dá)光檢測部的時間以I對I的方式相 關(guān)聯(lián)，使得一次將檢測到一個發(fā)光粒子，對分散在溶液中且在溶液中隨機(jī)地移動的發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)成為可能，并且與傳統(tǒng)技術(shù)相比能夠精確地確定樣品溶液中的粒子的濃度或數(shù)密度。本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)典型地用于生物微粒對象的溶液的狀態(tài)分析，其中生物微粒對象為例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或者其團(tuán)聚體等生物分子，以及病毒和細(xì)胞等，但是也可以用于溶液中非生物粒子(例如原子、分子、膠束、金屬膠體等)的狀態(tài)分祈，并且應(yīng)當(dāng)理解的是，這些情況也都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)將通過對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的以下說明變得清楚。


[圖I]圖I的(A)是根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析裝置的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的示意圖。圖I的(B)是共聚焦體積的(共聚焦顯微鏡的觀測區(qū)域)的示意圖。圖I的(C)是用于改變鏡7的方向以使光檢測區(qū)域的位置在樣品溶液中移動的機(jī)構(gòu)的示意圖。圖I的(D)是用于移動顯微感光板的水平位置以使光檢測區(qū)域的位置在樣品溶液中移動的機(jī)構(gòu)的示意圖。[圖2]圖2的(A)和圖2的(B)分別是說明根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)來檢測光的原理的示意圖和測得的光強(qiáng)度隨時間變化的示意圖。圖2的(C)是說明根據(jù)光強(qiáng)度數(shù)據(jù)單個地檢測來自發(fā)光粒子的光的原理的示意圖。圖2的(D)示出時間區(qū)間的預(yù)定寬度與兩個以上發(fā)光粒子的光同時進(jìn)入的幾率之間的關(guān)系(多個發(fā)光粒子包含于ー個預(yù)定寬度《的時間區(qū)間內(nèi)的比率)。[圖3]圖3的(A)和圖3的(B)分別是發(fā)光粒子由于布朗運(yùn)動而橫穿光檢測區(qū)域的情況下的模型圖和示出在該情況下光子數(shù)(光強(qiáng)度)隨時間的變化的示例的圖。[圖4]圖4的(A)和圖4的(B)分別是使得光檢測區(qū)域的位置以比發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動速度快的速度在樣品溶液內(nèi)移動時發(fā)光粒子橫穿光檢測區(qū)域的情況下的模型圖和示出在該情況下光子數(shù)(光強(qiáng)度)隨時間的變化的示例的圖。[圖5]圖5的(A)是示出根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)測得的全部時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)的圖，以及圖5的(B)是時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)的幾個區(qū)間的放大圖，其中也示出對參照區(qū)間計(jì)算得到的多個特征值。[圖6]圖6示出對于含有的發(fā)光粒子的濃度為IOfM-IOOpM的各個溶液、使用根據(jù)本發(fā)明計(jì)算的特征值在時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中單個地檢測到的發(fā)光粒子數(shù)。[圖7]圖7是示出根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)的時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中時間區(qū)間的預(yù)定寬度與檢測到存在發(fā)光粒子的區(qū)間的數(shù)量之間的關(guān)系的圖。[圖8]圖8示出在計(jì)算熒光強(qiáng)度波動的傳統(tǒng)光學(xué)分析技術(shù)中獲得的光子數(shù)(光強(qiáng)度)的時間變化的示例，其中，(A)示出粒子濃度處于在測量中提供足夠精度的水平的情況，(B)示出樣品中的粒子濃度顯著地低于情況(A)時的情況。附圖標(biāo)記說明I…光學(xué)分析裝置(共聚焦顯微鏡)2…光源 3…單模光纖4…準(zhǔn)直透鏡5…分色鏡6、7、11…反射鏡8…物鏡9…顯微感光板10…井(樣品溶液容器)12…聚光透鏡13…針孔14…阻斷濾片15…多模光纖16…光電檢測器17…鏡偏轉(zhuǎn)器17a…載物臺位置改變裝置I8…計(jì)算機(jī)
具體實(shí)施例方式在下文中，詳細(xì)地描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。光學(xué)分析裝置的結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)的光學(xué)分析裝置的基本結(jié)構(gòu)可以是如圖I的(A)中示意性地示出的那樣通過將能夠被用來進(jìn)行FSC、FIDA等的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)與光電檢測器組合而形成的裝置。參照附圖，光學(xué)分析裝置I由光學(xué)系統(tǒng)2-17和計(jì)算機(jī)18構(gòu)成，該計(jì)算機(jī)18用于獲取和分析數(shù)據(jù)并且控制光學(xué)系統(tǒng)的各部件的操作。光學(xué)分析裝置I的光學(xué)系統(tǒng)可以與通常的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)相同，其中，從光源2發(fā)出并通過單模光纖3的內(nèi)部傳輸?shù)募す?Ex)在光纖的發(fā)射端形成以固有NA所決定的角度放射的發(fā)散光；并且在利用準(zhǔn)直透鏡4形成平行光束之后，光在分色鏡5和反射鏡6、7上反射，從而進(jìn)入到物鏡8中。典型地，在物鏡8的上方放置被分注了一至數(shù)十U L的樣品溶液的樣品容器或者其上配置有井10的顯微感光板9，并且從物鏡8發(fā)出的激光在樣品容器或井10中的樣品溶液內(nèi)聚焦，從而形成具有強(qiáng)的光強(qiáng)度的區(qū)域(激發(fā)區(qū)域)。熒光粒子或者附有諸如熒光染料等發(fā)光標(biāo)記的粒子等作為被觀測對象的發(fā)光粒子在樣品溶液中分散或溶解，并且當(dāng)發(fā)光粒子進(jìn)入到激發(fā)區(qū)域時，發(fā)光粒子在駐留于激發(fā)區(qū)域中的過程中被激發(fā)，從而發(fā)出光。在通過物鏡8和分色鏡5之后，發(fā)出的光(Em)在鏡11上反射并且被聚光透鏡12會聚，然后光通過針孔13、透過阻斷濾片14 (在這里僅選擇處于特定波長帶區(qū)域的光分量)并被導(dǎo)入多模光纖15中，從而到達(dá)光電檢測器16,并且在轉(zhuǎn)換為時間序列電信號之后,該信號被輸入到計(jì)算機(jī)18中，在計(jì)算機(jī)18中以稍后說明的方式執(zhí)行用于光學(xué)分析的處理。在這方面，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的，在上述結(jié)構(gòu)中，針孔13位于物鏡8的聚焦位置的共軛位置處，因此，僅從如圖I的(B)中示意性地示出的激光的聚焦區(qū)域、即激發(fā)區(qū)域發(fā)出的光通過針孔13，而來自激發(fā)區(qū)域之外的其他區(qū)域的光被阻擋。圖I的(B)中示出的激光的聚焦區(qū)域是該光學(xué)分析裝置中的有效體積通常為大約I-IOfL的光檢測區(qū)域(典型地，光強(qiáng)度與在區(qū)域的中央具有峰值的高斯分布一致地展開。有效體積是以光強(qiáng)度減小至峰值強(qiáng)度的I/e2的表面為邊界的近似橢球的體積)，該有效體積稱作“共聚焦體積”。此外，由于在本發(fā)明中對從ー個發(fā)光粒子發(fā)出的光、例如從ー個熒光染料分子發(fā)出的微弱光進(jìn)行檢測，所以，優(yōu)選地，光電檢測器16使用能夠用于光子計(jì)數(shù)的超高靈敏度光電檢測器。當(dāng)通過光子計(jì)數(shù)來進(jìn)行光的檢測時，以對預(yù)定時間內(nèi)的每個預(yù)定單位時間(BIN時間)測量到達(dá)光電檢測器的光子的數(shù)量的方式，連續(xù)地進(jìn)行光強(qiáng)度的測量。因此，在這種情況下，時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)。此外，在上述光學(xué)分析裝置的光學(xué)系統(tǒng)中，設(shè)置有用于利用光檢測區(qū)域、即聚焦區(qū)域掃描樣品溶液的內(nèi)部以用于使光檢測區(qū)域在樣品溶液內(nèi)移動的機(jī)構(gòu)。對于用于使光檢測區(qū)域的位置移動的該機(jī)構(gòu)，例如，如圖I的(C)中示意性地示出的那樣，可以采用改變反射鏡7的方向的鏡偏轉(zhuǎn)器17 (使光檢測區(qū)域的絕對位置移動的類型)。該鏡偏轉(zhuǎn)器17可以與 配備在通常的激光掃描型顯微鏡上的電流鏡裝置中的鏡偏轉(zhuǎn)器相同?；蛘?，可替代地，如圖I的(D)所示，可以采用載物臺位置改變裝置17a來移動分注了樣品容液的容器10 (顯微感光板9)的水平位置，以使光檢測區(qū)域的相對位置在樣品溶液中移動(使樣品溶液的絕對位置移動的類型)。無論在哪ー種類型中，為了得到光檢測區(qū)域的位置期望的移動圖形，在計(jì)算機(jī)18的控制下與光電檢測器16的光檢測協(xié)調(diào)一致地驅(qū)動鏡偏轉(zhuǎn)器17或者載物臺位置改變裝置17a。光檢測區(qū)域的位置的移動軌跡可以從圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線中以單個或組合的形式任意地選擇(在計(jì)算機(jī)18中的程序中，可以設(shè)計(jì)成能夠選擇多種移動圖形。)。在這方面，雖然未示出，但是可以通過上下移動物鏡8而使光檢測區(qū)域的位置在上下方向上移動。在用作被觀測對象的發(fā)光粒子通過多光子吸收而發(fā)光的情況下，上述光學(xué)系統(tǒng)被用作多光子顯微鏡。在那種情況下，由于光僅從激發(fā)光的聚焦區(qū)域(光檢測區(qū)域)發(fā)出，所以可以移除針孔13。此外，在用作被觀測對象的發(fā)光粒子不是由于激發(fā)光而是由于化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光現(xiàn)象而發(fā)光的情況下，可以省略用于產(chǎn)生激發(fā)光的光學(xué)系統(tǒng)2-5。當(dāng)發(fā)光粒子由于磷光或散射光而發(fā)光時，照原樣使用上述共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。此外，如圖所示，在光學(xué)分析裝置I中，可以設(shè)置兩個以上的激發(fā)光源2，使得能夠根據(jù)發(fā)光粒子的激發(fā)波長適當(dāng)?shù)剡x擇激發(fā)光的波長。類似地，也可以設(shè)置兩個以上的光電檢測器16，使得當(dāng)樣品包含波長彼此不同的兩種以上的發(fā)光粒子時，能夠根據(jù)波長對分別從這些發(fā)光粒子發(fā)出的光分開地進(jìn)行檢測。本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)的原理諸如FCS和FIDA等光譜分析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在干，與傳統(tǒng)的生化分析技術(shù)相比，需要的樣品量極少并且能夠迅速地進(jìn)行試驗(yàn)。然而，在諸如FCS和FIDA等這些光譜分析技術(shù)中，從原理上講是基于熒光強(qiáng)度波動來計(jì)算被觀測粒子的濃度和特性，所以，為了獲得精確的測量結(jié)果，樣品溶液中的被觀測粒子的濃度或數(shù)密度應(yīng)當(dāng)處于如圖8的(A)所示意性地繪出的那樣在測量熒光強(qiáng)度的過程中光檢測區(qū)域CV內(nèi)總是存在大約ー個被觀測粒子的水平，使得如圖中右手側(cè)所示出的那樣在測量時間內(nèi)總是能夠檢測到顯著的光強(qiáng)度(光子數(shù))。當(dāng)被觀測粒子的濃度或數(shù)密度低于上述水平、例如處于如圖8的(B)所繪出的被觀測粒子很少進(jìn)入到光檢測區(qū)域CV內(nèi)的水平時，如圖中右手側(cè)所示，在一部分測量時間中將不會出現(xiàn)顯著的光強(qiáng)度(光子數(shù))，因此，精確地計(jì)算光強(qiáng)度波動會變得困難。另外，當(dāng)被觀測粒子的濃度顯著地低于在測量過程中光檢測區(qū)域內(nèi)總是存在大約ー個被觀測粒子的水平時，光強(qiáng)度波動的計(jì)算會受到背景的影響，為了獲得足夠用于計(jì)算的顯著數(shù)量的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(光子數(shù))，應(yīng)當(dāng)延長測量時間。為此，在本發(fā)明中，提出了一種基于新的原理的光學(xué)分析技術(shù)，即使當(dāng)被觀測粒子的濃度低于諸如FCS和FIDA等上述光譜分析技術(shù)中所要求的水平吋，該光學(xué)分析技術(shù)也能夠檢測被觀測粒子的諸如數(shù)密度或濃度等特性。在本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)中，簡要地說，在進(jìn)行處理時，與通過驅(qū)動用于使光檢測區(qū)域的位置移動的機(jī)構(gòu)(鏡偏轉(zhuǎn)器17或載物臺位置改變裝置17a)從而如圖2中所示意性地繪出的那樣使得光檢測區(qū)域CV的位置在樣品溶液中移動、即利用光檢測區(qū)域掃描樣品溶液的內(nèi)部一起進(jìn)行光檢測。因此，例如，如在圖2的(A)中，在使光檢測區(qū)域CV移動的過程中(圖中，時間t0至t2)，當(dāng)光檢測區(qū)域CV通過存在一個發(fā)光粒子(圖中為熒光染料)的區(qū)域時(tl)，如圖2的(B)所示將檢測到顯著的光強(qiáng)度(Em)。因此，通過在如上所述執(zhí)行使光檢測區(qū)域CV的位置移動和光檢測的過程中逐個地檢測如圖2的(B)所示的那樣出現(xiàn)的每個顯著的光強(qiáng)度、即每個脈沖狀的信號，而單個地檢測發(fā)光粒子，并且通過對發(fā)光粒子數(shù)計(jì)數(shù)，能夠獲取關(guān)于測量區(qū)域內(nèi)存在的發(fā)光粒子的數(shù)量、濃度或數(shù)密度的信息。應(yīng)當(dāng)理解的 是，在本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)的原理中，沒有執(zhí)行諸如計(jì)算熒光強(qiáng)度波動等統(tǒng)計(jì)計(jì)算處理，而是逐個地檢測發(fā)光粒子，因此，即使在發(fā)光粒子(被觀測粒子)的濃度處于在FCS和FIDA中不能夠進(jìn)行足夠精確的分析的低的水平的樣品溶液中，也能夠獲取關(guān)于發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度的信息。在這方面，在如圖2的(C)所示的實(shí)際的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(光子數(shù)數(shù)據(jù))中，除了來自發(fā)光粒子的光之外還存在噪聲(光電檢測器的熱噪聲、背景光)，因此，需要在區(qū)分來自發(fā)光粒子的光信號和噪聲的同時檢測是否存在來自發(fā)光粒子的光信號。因此，作為提取來自發(fā)光粒子的光信號存在的方法之一，在本實(shí)施方式中，借助于各時間區(qū)間內(nèi)的光強(qiáng)度值(光子數(shù))而在時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的每個預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)順次地計(jì)算表示是否存在來自單個發(fā)光粒子的光的光強(qiáng)度的特征值。通過參照光強(qiáng)度的特征值的大小，可以檢測每個預(yù)定寬度的時間區(qū)間中是否存在來自單個發(fā)光粒子的光信號，從而可以逐個地檢測發(fā)光粒子。典型地，表示是否存在來自單個發(fā)光粒子的光的光強(qiáng)度的特征值可以是任意值，在存在來自單個發(fā)光粒子的光信號吋，該任意值與不存在來自單個發(fā)光粒子的光信號(僅存在噪聲)的情況相比増大，例如該特征值可以是預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的光強(qiáng)度的累計(jì)值、光強(qiáng)度的中心值、光強(qiáng)度的平均值、光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD值)、光強(qiáng)度的方差、光強(qiáng)度的熵(EP值)、光強(qiáng)度的最大值和根據(jù)光強(qiáng)度的相關(guān)時間設(shè)定為0的自相關(guān)函數(shù)值計(jì)算的粒子數(shù)等。特別地，在本實(shí)施方式中，由于光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是根據(jù)光子計(jì)數(shù)的光子數(shù)數(shù)據(jù)，因此特征值可以是選自以下組的值該組由預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的光子數(shù)的總值、光子數(shù)的中心值、光子數(shù)的平均值、光子數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、光子數(shù)的方差、光子數(shù)的熵、光子數(shù)的最大值和根據(jù)光子數(shù)的相關(guān)時間設(shè)定為0的自相關(guān)函數(shù)值計(jì)算的粒子數(shù)構(gòu)成。
此外，優(yōu)選地，用于計(jì)算上述特征值的時間區(qū)間的預(yù)定寬度被設(shè)定為實(shí)質(zhì)上比從一個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時到該發(fā)光粒子離開光檢測區(qū)域時的間隔所需的時間寬度長，并且實(shí)質(zhì)上比從ー個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時到另一個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時的時間寬度短。通過設(shè)定這樣的預(yù)定寬度，存在發(fā)光粒子的光信號的ー個時間區(qū)間對應(yīng)于一個發(fā)光粒子的存在，也就是在時間區(qū)間與存在發(fā)光粒子之間建立ー對ー的關(guān)系，由此，對發(fā)光粒子計(jì)數(shù)的處理變得有利地容易。如果時間區(qū)間的預(yù)定寬度比從ー個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時到該發(fā)光粒子離開光檢測區(qū)域時的間隔所需的時間寬度短，則ー個發(fā)光粒子的光信號將存在于兩個以上時間區(qū)間，因而需要使多個時間區(qū)間對應(yīng)于ー個發(fā)光粒子的處理。另ー方面，如果時間區(qū)間的預(yù)定寬度比從ー個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時到另ー個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時的時間寬度長，則多個發(fā)光粒子的光信號將存在于ー個時間區(qū)間內(nèi)，因而逐個地檢測ー個發(fā)光粒子變得困難。當(dāng)假設(shè)發(fā)光粒子直線地通過光檢測區(qū)域的中心時(見下述“(I)樣品溶液的光強(qiáng)度的測量”和圖4)，例如，使用光檢測區(qū)域的直徑2Wo和移動速度U，上述預(yù)定寬度的下限CO low可以被設(shè)定為to low=2ffo/u ---(I) 預(yù)定寬度的上限《high是這樣的預(yù)定寬度在該預(yù)定寬度中，每個時間區(qū)間中包含的發(fā)光粒子數(shù)實(shí)質(zhì)上不大于ー個。可以以下列方式中的一種來確定預(yù)定寬度的上限
Co high。( I)假設(shè)發(fā)光粒子均勻分散在樣品溶液中的情況在預(yù)定寬度Co的時間區(qū)間內(nèi)、在光檢測區(qū)域移動的過程中檢測的發(fā)光粒子數(shù)n，通過下式給出n=cNASu co ---(2a)其中，c是發(fā)光粒子的摩爾濃度，Na是阿伏伽德羅數(shù)，S是光檢測區(qū)域的橫截面積。近似為S Wo2，并且假設(shè)預(yù)定寬度《的時間區(qū)間內(nèi)存在一個發(fā)光粒子(n=l)，預(yù)定寬度 由下式給出，co=l/(cNA3iffo2u)(2b)因此，使用發(fā)光粒子的期望濃度C，可以將預(yù)定寬度cohigh設(shè)定為利用表達(dá)式(2b)算出的值《，或者考慮到發(fā)光粒子的存在位置的離散度而設(shè)定為比利用表達(dá)式(2b)算出的值《小的值。( 2 )假設(shè)發(fā)光粒子根據(jù)泊松分布進(jìn)入預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的情況在預(yù)定寬度Co的時間區(qū)間內(nèi)、在光檢測區(qū)域移動的過程中檢測到的發(fā)光粒子的平均數(shù)n由上述表達(dá)式(2a)給出。另ー方面，預(yù)定寬度《的時間區(qū)間內(nèi)出現(xiàn)的發(fā)光粒子數(shù)為k的幾率pk為數(shù)學(xué)表達(dá)式I
g_n n 藍(lán)pk =--…\ Z c )
k!因此，在預(yù)定寬度Co的時間區(qū)間內(nèi)出現(xiàn)的發(fā)光粒子數(shù)為兩個以上的幾率P>1、即在ー個預(yù)定寬度《的時間區(qū)間內(nèi)包括兩個以上發(fā)光粒子的比率變成數(shù)學(xué)表達(dá)式2
P>i =I-E^TT"…(2d)
Sk!圖2的(D)是示出表達(dá)式(2d)隨預(yù)定寬度w (利用C=IOpM, u=15mm/s, Wo=Iiim來計(jì)算)變化的示例的圖。參照該圖，在示出的示例中，能夠理解的是，當(dāng)預(yù)定寬度被設(shè)定為 =200 u秒?yún)迹?%的時間區(qū)間包含多個發(fā)光粒子。因此，可以將預(yù)定寬度whigh設(shè)定為使用期望的發(fā)光粒子濃度C、在表達(dá)式(2d)中、提供容許的誤差的預(yù)定寬度本發(fā)明的光分析裝置的操作和操作過程具體地，在利用如圖I的(A)所示的本發(fā)明的光學(xué)分析裝置I的光學(xué)分析中，執(zhí)行(I)測量包含發(fā)光粒子(被觀測粒子)的樣品溶液的光強(qiáng)度的過程和(2)分析測得的光強(qiáng)度的過程。
( I)樣品溶液的光強(qiáng)度的測量在本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)中用作被觀測對象的粒子可以是任意粒子，只要該粒子分散在樣品溶液中并且在樣品溶液中隨機(jī)地移動即可、諸如溶解的分子等，例如，粒子可以是生物分子，即蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸等或者這些生物分子的團(tuán)聚體，也可以是病毒、細(xì)胞、金屬膠體或其他非生物分子。當(dāng)用作被觀測對象的粒子不是發(fā)光粒子時，使用以任意方式將發(fā)光標(biāo)記(突光分子、磷光分子、化學(xué)發(fā)光分子或生物發(fā)光分子)貼附于被觀測粒子而制備的粒子。樣品溶液典型地為水溶液，然而不限于此，也可以使用有機(jī)溶劑和其他任意液體。除了在測量過程中驅(qū)動鏡偏轉(zhuǎn)器17或載物臺位置改變裝置17a以使光檢測區(qū)域的位置在樣品溶液內(nèi)移動(在樣品溶液中掃描)之外，可以以與FCS或FIDA中的光強(qiáng)度測量過程相同的方式在本發(fā)明的光學(xué)分析中進(jìn)行光強(qiáng)度的測量。在操作過程中，典型地，在將樣品溶液分注到顯微感光板9的井10內(nèi)并且將其放在顯微鏡的載物臺上之后，當(dāng)使用者向計(jì)算機(jī)18輸入測量開始的命令時，計(jì)算機(jī)18執(zhí)行存儲在存儲裝置(未示出)中的程序(使光檢測區(qū)域的位置在樣品溶液中移動的進(jìn)程，和在光檢測區(qū)域的位置移動的過程中檢測來自光檢測區(qū)域的光并且產(chǎn)生時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的進(jìn)程)，因此將啟動利用激發(fā)光對樣品溶液中的光檢測區(qū)域的照明和測量光強(qiáng)度。在該測量過程中，根據(jù)程序在計(jì)算機(jī)18的操作過程的控制下，鏡偏轉(zhuǎn)器17或載物臺位置改變裝置17a驅(qū)動鏡7 (電流鏡)或顯微鏡的載物臺上的顯微感光板9以使光檢測區(qū)域的位置在井10內(nèi)移動，與此同時，光電檢測器16順次地將檢測到的光轉(zhuǎn)換成電信號并將該電信號傳輸至計(jì)算機(jī)18，計(jì)算機(jī)18將傳輸?shù)墓庑盘柹蓵r間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)并且以任意方式將該時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)存儲起來。在這方面，光電檢測器I6典型地為能夠檢測單個光子的到達(dá)的超高靈密度光電檢測器，因此，當(dāng)通過光子計(jì)數(shù)來完成光檢測時，時間序列光強(qiáng)度可以是時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)。在測量光強(qiáng)度的過程中光檢測區(qū)域的位置的移動速度可以是例如通過實(shí)驗(yàn)或者為了滿足分析的目的而任意設(shè)定的預(yù)定速度。在基于檢測到的發(fā)光粒子數(shù)來獲取關(guān)于數(shù)密度和濃度的信息的情況下，需要知道光檢測區(qū)域通過的區(qū)域的尺寸或體積，因此，以使得能夠掌握移動距離的方式進(jìn)行光檢測區(qū)域的位置的移動。在這方面，因?yàn)槿绻?jīng)過時間與光檢測區(qū)域的位置的移動距離成比例，則測量結(jié)果的解釋將變得容易，所以，基本上優(yōu)選的是移動速度恒定，然而不限于此。順便提一句，關(guān)于光檢測區(qū)域的位置的移動速度，為了根據(jù)測得的時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)或者對發(fā)光粒子數(shù)的計(jì)數(shù)來定量地、精確地、單個地檢測發(fā)光粒子，優(yōu)選的是，將移動速度設(shè)定為比發(fā)光粒子的隨機(jī)運(yùn)動、即布朗運(yùn)動中的移動速度快的值。由于本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)中的被觀測粒子是分散或溶解到溶液中并且自由地隨機(jī)移動的粒子，所以其位置由于布朗運(yùn)動而隨時間移動。因此，當(dāng)光檢測區(qū)域的位置的移動速度比粒子的由于布朗運(yùn)動而移動的速度慢時，粒子將如圖3的(A)中所示意性地繪出的那樣在區(qū)域中隨機(jī)地移動，從而如圖3的(B)所示，光強(qiáng)度隨機(jī)地變化(如已經(jīng)指出的，光檢測區(qū)域中的激發(fā)光強(qiáng)度從區(qū)域的中央處的峰值朝向外側(cè)降低)，使得確定與各發(fā)光粒子對應(yīng)的顯著的光強(qiáng)度變化變得困難。因此，優(yōu)選地，如圖4的(A)所繪出的那樣，光檢測區(qū)域的位置的移動速度被設(shè)定為比粒子的由于布朗運(yùn)動而移動的平均移動速度(擴(kuò)散移動速度)快，使得粒子將近似直線地橫穿光檢測區(qū)域，并且如圖4的(B)所示，與每個發(fā)光粒子對應(yīng)的光強(qiáng)度的變化的輪廓在時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中變得幾乎一致(當(dāng)發(fā)光粒子近似直線地通過光檢測區(qū)域時，光強(qiáng)度變化的輪廓與激發(fā)光強(qiáng)度分布類似)，并且能夠容易地確定每個發(fā)光粒子與光強(qiáng)度之間的對應(yīng)關(guān)系。
具體地，擴(kuò)散系數(shù)為D的發(fā)光粒子由于布朗運(yùn)動而通過半徑為Wo的光檢測區(qū)域(共聚焦體積)所需的時間At由均方位移關(guān)系的表達(dá)式(2ffo)2=6D At —(4)給出，為A t= (2ffo) 2/6D —(5),因此，發(fā)光粒子由于布朗運(yùn)動而移動的速度(擴(kuò)散移動速度)Vdif近似為Vdif=2ffo/A t=3D/ffo —(6)因此，參照該公式，可以將光檢測區(qū)域的位置的移動速度設(shè)定為比Vdif充分快的值。例如，假設(shè)Wo為大約0. 62 u m,當(dāng)被觀測粒子的擴(kuò)散系數(shù)預(yù)計(jì)大約為D=2. OX 10_1(lm2/S吋，Vdif將為I. OX 10_3m/s，因此，可以將光檢測區(qū)域的位置的移動速度設(shè)定為Vdif的10倍以上，例如15mm/s。在這方面，當(dāng)被觀測粒子的擴(kuò)散系數(shù)未知時，可以通過設(shè)定光檢測區(qū)域的位置的各種移動速度而反復(fù)地執(zhí)行預(yù)備試驗(yàn)以找出光強(qiáng)度變化的輪廓變成期望的輪廓(典型地，與激發(fā)光強(qiáng)度分布類似)的條件，以此來確定光檢測區(qū)域的位置的適當(dāng)?shù)囊苿铀俣取?2)光強(qiáng)度的分析當(dāng)通過上述處理獲得了樣品溶液的時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時，通過根據(jù)存儲在存儲裝置中的程序的處理(計(jì)算表示在時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的每個預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)是否存在來自單個發(fā)光粒子的光的光強(qiáng)度的特征值的進(jìn)程，以及基于每個預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)光強(qiáng)度的該特征值單個地檢測每個發(fā)光粒子的光信號的進(jìn)程)，可以在計(jì)算機(jī)18中進(jìn)行如下所述的光強(qiáng)度的分析。(i) 一個發(fā)光粒子的檢測當(dāng)一個發(fā)光粒子通過光檢測區(qū)域時的軌跡如圖4的(A)中所示近似為直線時，在時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中與該發(fā)光粒子對應(yīng)的光強(qiáng)度變化具有如圖4的(B)中所示意性地繪出的、反映光檢測區(qū)域(由光學(xué)系統(tǒng)確定)中的光強(qiáng)度分布的輪廓(通常近似為鐘形)，該光強(qiáng)度變化與沒有發(fā)光粒子通過的期間內(nèi)的數(shù)據(jù)中的變化(噪聲隨機(jī)產(chǎn)生的情況)顯著地不同。因此，如已經(jīng)指出的，在本實(shí)施方式中，對于時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的每個預(yù)定寬度的時間區(qū)間計(jì)算光強(qiáng)度的特征值。當(dāng)時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)時，如上所述，光強(qiáng)度的特征值可以是選自以下組的值該組由預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的光子數(shù)的總值、光子數(shù)的中心值、光子數(shù)的平均值、光子數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、光子數(shù)的方差、光子數(shù)的熵、光子數(shù)的最大值和根據(jù)光子數(shù)的相關(guān)時間設(shè)定為O的自相關(guān)函數(shù)值計(jì)算的粒子數(shù)構(gòu)成。關(guān)于各個特征值，更詳細(xì)地，光子數(shù)的總值是預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的光子數(shù)的總值。由于存在發(fā)光粒子的光信號的時間區(qū)間內(nèi)的總值比其他時間區(qū)間內(nèi)的總值増大，增大量為來自發(fā)光粒子的光子數(shù)，因此，當(dāng)特定時間區(qū)間內(nèi)的總值大小大于預(yù)定閾值時，能夠判定為該特定時間區(qū)間內(nèi)存在發(fā)光粒子的光信號。光子數(shù)的中心值和最大值分別是在預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)的光子數(shù)的中心 值和最大值。由于在當(dāng)發(fā)光粒子的光到達(dá)光電檢測器的期間內(nèi)的光子數(shù)與僅發(fā)生通常的噪聲的情況相比變大，因此中心值和最大值在存在發(fā)光粒子的光信號的時間區(qū)間內(nèi)也増大。因此，當(dāng)特定時間區(qū)間內(nèi)中心值或最大值大于預(yù)定閾值時，能夠判定為該特定時間區(qū)間內(nèi)存在發(fā)光粒子的光信號。光子數(shù)的平均值是預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的光子數(shù)的時間平均值。如上面所指出的，由于存在發(fā)光粒子的光信號的時間區(qū)間內(nèi)的總值比其他時間區(qū)間內(nèi)的總值増大，増大量為來自發(fā)光粒子的光子數(shù)，因此光子數(shù)的時間平均值在預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)也増大。因此，當(dāng)特定時間區(qū)間的平均值的大小大于預(yù)定閾值時，能夠判定為該特定時間區(qū)間內(nèi)存在發(fā)光粒子的光信號。光子數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差值、方差值和熵值均是時間平均的標(biāo)準(zhǔn)偏差值、方差值和預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)光子數(shù)的信息量的熵，這些均是表示在預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)的光子數(shù)的時間變化的離散度的特征值。當(dāng)發(fā)光粒子的光信號存在于特定時間區(qū)間時，光子數(shù)隨時間的變化與其他時間區(qū)間相比更劇烈。因此，由于存在發(fā)光粒子的光信號的時間區(qū)間內(nèi)的光子數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差值、方差值和熵值與其他時間區(qū)間的相應(yīng)值相比増大，當(dāng)特定時間區(qū)間內(nèi)的各個值均大于預(yù)定閾值時，能夠判定為該特定時間區(qū)間內(nèi)存在發(fā)光粒子的光信號。在這方面，關(guān)于光子數(shù)的熵值，當(dāng)特定時間(BIN TME)的光子數(shù)為X的幾率是px吋，使用特定時間區(qū)間內(nèi)的光子數(shù)為X的時間點(diǎn)的數(shù)量ix，光子數(shù)的熵值由下式給出-Iog2(pOlCI pi11.....pxlx.....pnm) ---(7)通常,光子數(shù)為X的幾率px滿足p0>pl>p2>…〉px…〉pn。盡管僅存在噪聲的區(qū)間內(nèi)的熵值近似為-Iog2 (POki Plil p2i2)，但是在存在發(fā)光粒子的光信號的區(qū)間內(nèi)熵值變?yōu)?Iog2 (pOi0 pln p2i2 p3i3 p4i4)等,從而值増大。根據(jù)光子數(shù)的相關(guān)時間設(shè)定為0的自相關(guān)函數(shù)值計(jì)算的預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的粒子數(shù)，在數(shù)量上等于該時間區(qū)間內(nèi)的粒子數(shù)。根據(jù)F C S的理論，光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)C(x)由下式給出數(shù)學(xué)表達(dá)式3
./ >-i/Y1'2c(r) = l +丄 1 +丄 1 + ^^(8)
Nl tDJ [ AR2rD J(其中Td是平移擴(kuò)散時間，AR是結(jié)構(gòu)參數(shù)，N是粒子數(shù))。在上述表達(dá)式中，使用相關(guān)時間T=O時的C(0)，粒子數(shù)N由l/(c(0)-l)給出。由于考慮到該粒子數(shù)為各時間區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)的粒子的數(shù)量，所以，與上述特征值類似，能夠判定粒子數(shù)大于預(yù)定閾值的時間區(qū)間內(nèi)存在發(fā)光粒子的光信號。(ii)發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)在上述檢測發(fā)光粒子的處理中，當(dāng)時間區(qū)間的預(yù)定寬度被設(shè)定為實(shí)質(zhì)上比從ー個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時到該發(fā)光粒子離開光檢測區(qū)域時的間隔所需的時間寬度長，并且實(shí)質(zhì)上比從ー個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時到 另一個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時的時間寬度短時，一個發(fā)光粒子對應(yīng)于判定為存在發(fā)光粒子的光信號的一個時間區(qū)間，因此通過對這些時間區(qū)間的數(shù)量計(jì)數(shù)來確定發(fā)光粒子數(shù)。(iii)發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度的確定當(dāng)完成了發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)時，可以使用光檢測區(qū)域通過的總區(qū)域的體積來確定發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。然而，光檢測區(qū)域的有效體積取決于激發(fā)光的或檢測到的光的波長、透鏡的數(shù)值孔徑以及光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整狀態(tài)而變化，因此，難以根據(jù)設(shè)計(jì)參數(shù)值來計(jì)算光檢測區(qū)域的有效體積。因此，在本實(shí)施方式中，在與測量待試驗(yàn)樣品溶液的條件相同的條件下、利用發(fā)光粒子濃度已知的溶液(對照溶液)按照上述說明來進(jìn)行光強(qiáng)度測量、發(fā)光粒子的檢測以及發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)，然后，根據(jù)檢測出的發(fā)光粒子的數(shù)量和對照溶液中發(fā)光粒子的濃度，可以確定光檢測區(qū)域通過的總區(qū)域的體積、即檢測出的發(fā)光粒子的數(shù)量與發(fā)光粒子的濃度之間的關(guān)系。優(yōu)選地，對照溶液的發(fā)光粒子可以是波長特征與被觀測粒子相同的發(fā)光標(biāo)記(熒光染料等)。具體地，例如，假設(shè)在發(fā)光粒子濃度為C的對照溶液中檢測出的發(fā)光粒子的數(shù)量為N，那么光檢測區(qū)域通過的總區(qū)域的體積Vt由下式給出Vt=N/C(9)可替代地，制備發(fā)光粒子濃度不同的多種溶液作為對照溶液，并且對各溶液進(jìn)行測量，然后，將計(jì)算出的Vt的平均值確定為光檢測區(qū)域通過的總區(qū)域的體積vt。因此，當(dāng)給定Vt吋，發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)結(jié)果為n的樣品溶液的發(fā)光粒子的數(shù)密度C由下式給出c=n/Vt ---(10)在這方面，光檢測區(qū)域的體積和光檢測區(qū)域通過的總區(qū)域的體積可以通過任意方法給出，例如代替上述方法而使用FCS和FIDA。此外，在本實(shí)施方式的光學(xué)分析裝置中，對于假設(shè)的光檢測區(qū)域的移動圖形，可以將與各種標(biāo)準(zhǔn)發(fā)光粒子的濃度C與發(fā)光粒子數(shù)N之間的關(guān)系(表達(dá)式(9))有關(guān)的信息預(yù)先存儲在計(jì)算機(jī)18的存儲裝置中，使得裝置的使用者在進(jìn)行光學(xué)分析時能夠適當(dāng)?shù)厥褂门c該關(guān)系有關(guān)的存儲信息。因此，根據(jù)不包括FCS、FIDA等中進(jìn)行的諸如熒光強(qiáng)度波動的計(jì)算等統(tǒng)計(jì)處理的上述本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)，通過使微小區(qū)域、即光檢測區(qū)域的位置在樣品溶液中移動，也就是掃描樣品溶液的內(nèi)部，并且對橫穿光檢測區(qū)域的發(fā)光粒子單個地進(jìn)行檢測或者對發(fā)光粒子進(jìn)行計(jì)數(shù)，能夠?qū)Ρ挥^測粒子的濃度或數(shù)密度比FCS、FIDA等中使用的水平低的樣品溶液中的被觀測粒子的狀態(tài)和特性進(jìn)行檢測。在這方面，由于本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)基本上使用與FCS、FIDA等相同的光學(xué)系統(tǒng)，所以可以與FCS、FIDA等一起進(jìn)行。例如，在檢測包含兩種以上的物質(zhì)的溶液中的這些物質(zhì)之間的相互作用等的情況下，當(dāng)物質(zhì)之間的濃度差異大時，例如當(dāng)一種物質(zhì)的濃度是nM數(shù)量級而另一物質(zhì)的濃度是pM數(shù)量級時，能夠以如下方式進(jìn)行測量和分析對于高濃度的物質(zhì)采用FCS或FIDA來進(jìn)行測量和分析，而對于低濃度的物質(zhì)采用本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)來進(jìn)行測量和分析。在這樣的情況下，如圖I的(A)所示，準(zhǔn)備兩個以上的光電檢測器是有利的。為了驗(yàn)證上述本發(fā)明的有效性，進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。在這方面，應(yīng)當(dāng)理解的是，以下實(shí)施例僅說明本發(fā)明的有效性，并非試圖限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I使用熒光染料ATT0633 (西格瑪奧德里奇(Sigma Aldrich)公司Cat. No. 18620)作為發(fā)光粒子來檢驗(yàn)?zāi)軌蚶帽景l(fā)明測量的樣品溶液中的發(fā)光粒子的濃度范圍。對于樣品溶液，制備ATT0633的濃度分別為OfM (不含染料)、10fM、100fM、lpM、10pM、IOOpM和InM的包含ATT0633的磷酸鹽緩沖液(包含0. 05%的吐溫20)。在根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)的測量中，使用配備有共聚焦熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)的單分子熒光測量裝置MF-20 (奧林巴斯公司)作為光學(xué)分析裝置，并且 根據(jù)上述“(I)樣品溶液的光強(qiáng)度的測量”中說明的方式來獲取上述各樣品溶液的時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)。對于物鏡，使用浸水式物鏡(40X，NA=L 15,WD=O. 26)。為此，光電檢測器16使用能夠檢測單個光子的到達(dá)的超高靈敏度光電檢測器，因此光檢測是以對在每個預(yù)定的単位時間(BIN TIME)內(nèi)到達(dá)光電檢測器的光子數(shù)進(jìn)行測量的方式在預(yù)定時間內(nèi)順次地對光子進(jìn)行計(jì)數(shù)。因此，時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)。此外，激發(fā)光使用633nm的激光，并且利用帶通濾波器將檢測到的光波長設(shè)定為從660nm到710nm。進(jìn)行3次毎次2秒的測量，其中光檢測區(qū)域的位置在樣品溶液中的移動速度設(shè)定為15mm/s并且BINTME設(shè)定為IOii秒。圖5的(A)示出通過2秒的測量獲得的全部時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)的示例，圖5的(B)示出2秒測量的時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)的一部分的放大圖。在光強(qiáng)度的上述測量之后，對于獲取的各樣品溶液的時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中的發(fā)光粒子的光信號的檢測，如圖5的(B)所示將時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)的整個區(qū)域分為寬度為200 y秒的時間區(qū)間，在各時間區(qū)間內(nèi)，計(jì)算光子數(shù)的總值、光子數(shù)的中心值、光子數(shù)的平均值、光子數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差值(SD值)、光子數(shù)的方差值、光子數(shù)的熵值、光子數(shù)的最大值和根據(jù)光子數(shù)的相關(guān)時間設(shè)定為0的自相關(guān)函數(shù)值計(jì)算的粒子數(shù)，作為表示是否存在來自單個發(fā)光粒子的光的光強(qiáng)度的特征值。結(jié)果，例如，如圖5的(B)所示，在能夠在視覺上判定為存在發(fā)光粒子的光信號的時間區(qū)間(窗ロ #30、窗ロ #32)內(nèi)，示出的特征值大于判定為不存在發(fā)光粒子的光信號的時間區(qū)間(窗ロ#31)內(nèi)的特征值。因此，在對時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)的整個區(qū)域內(nèi)的每個時間區(qū)間計(jì)算光強(qiáng)度的特征值之后，假設(shè)ー個發(fā)光粒子的光信號存在于各特征值均超過相應(yīng)閾值的時間區(qū)間內(nèi)，對于各特征值而言，對超過預(yù)定閾值的特征值所在的時間區(qū)間的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。圖6示出對于各上述溶液、各個特征值超過相應(yīng)的預(yù)定閾值的時間區(qū)間的數(shù)量。各特征值的閾值設(shè)定如下光子數(shù)的總值100個光子數(shù)的中心值 4. 5個光子數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差值3. 5個光子數(shù)的方差值12. 5個光子數(shù)的熵值105
光子數(shù)的最大值 13個粒子數(shù)(根據(jù)自相關(guān)函數(shù)值計(jì)算)0. 4個在這方面，作為對比，也描述了時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中光子數(shù)超過2的連續(xù)時間域的數(shù)量(ニ值化域數(shù))。參照圖6，示出的各特征值隨樣品溶液中發(fā)光粒子濃度的增大而増大。然而，對于根據(jù)光子數(shù)的相關(guān)時間設(shè)定為0的自相關(guān)函數(shù)值計(jì)算的粒子數(shù)，在發(fā)光粒子濃度小于IpM時看不出顯著的變化。另ー方面，對于ニ值化域數(shù)，對于用于測量的樣品溶液未獲得顯著的濃度依賴性。因此，上述結(jié)果啟示，根據(jù)本發(fā)明，單個地檢測來自發(fā)光粒子的光并且參照光強(qiáng)度的特征值來確定發(fā)光粒子的濃度，其中，所述特征值表示是否存在來自單個發(fā)光粒子的光并且在通過測量光獲得的時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中對于每個預(yù)定寬度的時間區(qū)間計(jì)算得出。
此外，在上述時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中，檢驗(yàn)在計(jì)算特征值時的時間區(qū)間的寬度對發(fā)光粒子的檢測數(shù)量的影響。圖7示出改變計(jì)算特征值(光子數(shù)的總值)時的時間區(qū)間寬度時、在發(fā)光粒子濃度為IOpM的樣品溶液的時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中的發(fā)光粒子的檢測數(shù)量(特征值超過預(yù)定閾值的時間區(qū)間的數(shù)量)。參照該圖，在時間區(qū)間寬度為IOOy秒至200y秒的情況下，發(fā)光粒子的檢測數(shù)量穩(wěn)定。另ー方面，當(dāng)時間區(qū)間寬度小于IOOy秒時，發(fā)光粒子的檢測數(shù)量明顯増大。由于在該實(shí)驗(yàn)性示例的測量條件下，單個發(fā)光粒子直線地通過光檢測區(qū)域所需時間計(jì)算為約74y秒，這被認(rèn)為是通過使時間區(qū)間寬度比單個發(fā)光粒子線性通過光檢測區(qū)域所需時間長，遍及兩個以上的時間區(qū)間檢測到一個發(fā)光粒子的次數(shù)減小。此外，在上述結(jié)果中，當(dāng)時間區(qū)間寬度超過200y秒時，粒子的檢測數(shù)量明顯減少。這被認(rèn)為是由于使時間區(qū)間寬度變長，増大了存在兩個以上的發(fā)光粒子的光信號的時間區(qū)間的數(shù)量。實(shí)際上，在上述溶液條件和裝置條件下，使用表達(dá)式(2d)在容許的誤差約為5%的情況下計(jì)算的時間區(qū)間的預(yù)定寬度的上限cohigh約為200y秒(光檢測區(qū)域的半徑Wo被設(shè)定為m)。這些結(jié)果啟示，通過將時間區(qū)間的寬度設(shè)定為實(shí)質(zhì)上比從ー個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時到該發(fā)光粒子離開光檢測區(qū)域時的間隔所需的時間寬度長、并且實(shí)質(zhì)上比從ー個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時到另一個發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域時的時間寬度短，使得一個發(fā)光粒子對應(yīng)于一個時間區(qū)間。因此表明，根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)，在比使用熒光強(qiáng)度的傳統(tǒng)方法能夠測量的數(shù)密度或濃度的極限低的濃度范圍，能夠確定發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。此外，諸如FCS、FIDA和PCH等、包含例如熒光強(qiáng)度波動的計(jì)算等統(tǒng)計(jì)處理的光學(xué)分析技術(shù)中的可測量的粒子濃度的下限約為InM，而本實(shí)施例中可測量的粒子濃度的下限為 10fM，因此也表明，根據(jù)本發(fā)明，可以對濃度范圍顯著低于諸如FCS、FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)的情況的粒子進(jìn)行測量。
權(quán)利要求
1.一種光學(xué)分析裝置，其通過使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)對來自發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測，所述發(fā)光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機(jī)地移動，其特征在于，所述光學(xué)分析裝置包括 光檢測區(qū)域移動部，其使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動； 光檢測部，其對來自所述光檢測區(qū)域的光進(jìn)行檢測；和 信號處理部，其生成在所述光檢測區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動的過程中利用所述光檢測部檢測到的來自所述光檢測區(qū)域的光的時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，并且在所述時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中單個地檢測來自每個所述發(fā)光粒子的光信號； 其中，所述信號處理部計(jì)算表示在所述時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的每個預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)是否存在來自單個發(fā)光粒子的光的光強(qiáng)度的特征值，并且使用所述特征值單個地檢測來自每個所述發(fā)光粒子的光信號。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的裝置，其特征在于，所述信號處理部通過對具有來自所述發(fā)光粒子的光信號的所述預(yù)定寬度的時間區(qū)間的數(shù)量計(jì)數(shù)，來對在所述光檢測區(qū)域的位置移動的過程中檢測到的所述發(fā)光粒子的數(shù)量計(jì)數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的裝置，其特征在于，所述光檢測部通過光子計(jì)數(shù)來檢測來自所述光檢測區(qū)域的光，并且所述時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述光檢測區(qū)域移動部使所述光檢測區(qū)域的位置以比所述發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動速度快的速度移動。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，存在來自所述單個發(fā)光粒子的光的所述預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的所述光強(qiáng)度的特征值大于不存在來自所述單個發(fā)光粒子的光的所述預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的所述光強(qiáng)度的特征值，并且當(dāng)所述光強(qiáng)度的特征值大于預(yù)定閾值時，判定為所述預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)存在來自所述發(fā)光粒子的光信號。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的裝置，其特征在于，所述光強(qiáng)度的特征值是選自以下組的值所述組由所述預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的光子數(shù)的總值、光子數(shù)的中心值、光子數(shù)的平均值、光子數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、光子數(shù)的方差、光子數(shù)的熵、光子數(shù)的最大值和根據(jù)光子數(shù)的相關(guān)時間設(shè)定為O的自相關(guān)函數(shù)值計(jì)算的粒子數(shù)構(gòu)成。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述預(yù)定寬度被設(shè)定為實(shí)質(zhì)上比從一個發(fā)光粒子進(jìn)入所述光檢測區(qū)域時到所述一個發(fā)光粒子離開所述光檢測區(qū)域時的間隔所需的時間寬度長，并且實(shí)質(zhì)上比從一個發(fā)光粒子進(jìn)入所述光檢測區(qū)域時到另一個發(fā)光粒子進(jìn)入所述光檢測區(qū)域時的時間寬度短。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述信號處理部基于所述檢測到的發(fā)光粒子的數(shù)量來確定所述樣品溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
9.一種光學(xué)分析方法，其通過使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)對來自發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測，所述發(fā)光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機(jī)地移動，其特征在于，所述方法包括如下步驟 使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動； 在使所述光檢測區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動的同時對來自所述光檢測區(qū)域的光進(jìn)行檢測，并且產(chǎn)生時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；計(jì)算光強(qiáng)度的特征值，其中，所述特征值表示在所述時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的每個預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)是否存在來自單個發(fā)光粒子的光；和 使用每個所述預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的光強(qiáng)度的特征值，單個地檢測來自每個發(fā)光粒子的光信號。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，還包括以下步驟通過對具有來自所述發(fā)光粒子的光信號的所述預(yù)定寬度的時間區(qū)間的數(shù)量計(jì)數(shù)，來對在所述光檢測區(qū)域的位置移動的過程中檢測到的所述發(fā)光粒子的數(shù)量計(jì)數(shù)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其特征在于，在檢測來自所述光檢測區(qū)域的光井產(chǎn)生時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的步驟中，通過光子計(jì)數(shù)檢測來自所述光檢測區(qū)域的光，并且所述時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在使所述光檢測區(qū)域的位置移動的步驟中，使所述光檢測區(qū)域的位置以比所述發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動速度快的速度移動。
13.根據(jù)權(quán)利要求9至12中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，存在來自所述單個發(fā)光粒子的光的所述預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的所述光強(qiáng)度的特征值大于不存在來自所述單個發(fā)光粒子的光的所述預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的所述光強(qiáng)度的特征值，并且當(dāng)所述光強(qiáng)度的特征值大于預(yù)定閾值時，判定為所述預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)存在來自所述發(fā)光粒子的光信號。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述光強(qiáng)度的特征值是選自以下組的值所述組由所述預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的光子數(shù)的總值、光子數(shù)的中心值、光子數(shù)的平均值、光子數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、光子數(shù)的方差、光子數(shù)的熵、光子數(shù)的最大值和根據(jù)光子數(shù)的相關(guān)時間設(shè)定為0的自相關(guān)函數(shù)值計(jì)算的粒子數(shù)構(gòu)成。
15.根據(jù)權(quán)利要求9至14中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述預(yù)定寬度被設(shè)定為實(shí)質(zhì)上比從ー個發(fā)光粒子進(jìn)入所述光檢測區(qū)域時到所述ー個發(fā)光粒子離開所述光檢測區(qū)域時的間隔所需的時間寬度長，并且實(shí)質(zhì)上比從ー個發(fā)光粒子進(jìn)入所述光檢測區(qū)域時到另一個發(fā)光粒子進(jìn)入所述光檢測區(qū)域時的時間寬度短。
16.根據(jù)權(quán)利要求9至15中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，還包括如下步驟基于所述檢測到的發(fā)光粒子的數(shù)量來確定所述樣品溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
17.一種用于光學(xué)分析的計(jì)算機(jī)程序，其用于通過使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)對來自發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測，所述發(fā)光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機(jī)地移動，其特征在于，所述計(jì)算機(jī)程序使計(jì)算機(jī)執(zhí)行如下進(jìn)程 使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動； 在使所述光檢測區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動的同時對來自所述光檢測區(qū)域的光進(jìn)行檢測，并且產(chǎn)生時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)； 計(jì)算光強(qiáng)度的特征值，其中，所述特征值表示在所述時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的每個預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)是否存在來自單個發(fā)光粒子的光；和 使用每個所述預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的光強(qiáng)度的特征值，單個地檢測來自每個發(fā)光粒子的光信號。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，還包括如下進(jìn)程通過對具有來自所述發(fā)光粒子的光信號的所述預(yù)定寬度的時間區(qū)間的數(shù)量計(jì)數(shù)，來對在所述光檢測區(qū)域的位置移動的過程中檢測到的所述發(fā)光粒子的數(shù)量計(jì)數(shù)。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，在檢測來自所述光檢測區(qū)域的光并產(chǎn)生所述時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的進(jìn)程中，通過光子計(jì)數(shù)檢測來自所述光檢測區(qū)域的光，并且所述時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是時間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)。
20.根據(jù)權(quán)利要求17至19中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，在使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置移動的進(jìn)程中，使所述光檢測區(qū)域的位置以比所述發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動速度快的速度移動。
21.根據(jù)權(quán)利要求17至20中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，存在來自所述單個發(fā)光粒子的光的所述預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的所述光強(qiáng)度的特征值大于不存在來自所述單個發(fā)光粒子的光的所述預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的所述光強(qiáng)度的特征值，并且當(dāng)所述光強(qiáng)度的特征值大于預(yù)定閾值時，判定為所述預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)存在來自所述發(fā)光粒子的光信號。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，所述光強(qiáng)度的特征值是選自以下組的值所述組由所述預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)的光子數(shù)的總值、光子數(shù)的中心值、光子數(shù)的平均值、光子數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、光子數(shù)的方差、光子數(shù)的熵、光子數(shù)的最大值和根據(jù)光子數(shù)的相關(guān)時間設(shè)定為0的自相關(guān)函數(shù)值計(jì)算的粒子數(shù)構(gòu)成。
23.根據(jù)權(quán)利要求17至22中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，所述預(yù)定寬度被設(shè)定為實(shí)質(zhì)上比從ー個發(fā)光粒子進(jìn)入所述光檢測區(qū)域時到所述ー個發(fā)光粒子離開所述光檢測區(qū)域時的間隔所需的時間寬度長，并且實(shí)質(zhì)上比從ー個發(fā)光粒子進(jìn)入所述光檢測區(qū)域時到另一個發(fā)光粒子進(jìn)入所述光檢測區(qū)域時的時間寬度短。
24.根據(jù)權(quán)利要求17至23中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，還包括如下進(jìn)程基于所述檢測到的發(fā)光粒子的數(shù)量來確定所述樣品溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
全文摘要
提供一種光學(xué)分析技術(shù)，其能夠?qū)σ缘偷臐舛然驍?shù)密度包含于樣品溶液中的被觀測粒子的狀態(tài)或特性進(jìn)行檢測。本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)使用諸如共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠?qū)碜匀芤褐械奈⑿^(qū)域的光進(jìn)行檢測的光學(xué)系統(tǒng)，以在使微小區(qū)域的位置在樣品溶液中移動的同時(在利用微小區(qū)域掃描樣品溶液的內(nèi)部的同時)對來自被觀測發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測；產(chǎn)生時間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，計(jì)算光強(qiáng)度的特征值，其中所述特征值表示光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中每個預(yù)定寬度的時間區(qū)間內(nèi)是否存在來自單個發(fā)光粒子的光；并且對橫穿微小區(qū)域的內(nèi)部的發(fā)光粒子單個地進(jìn)行檢測，由此使得能夠?qū)Πl(fā)光粒子計(jì)數(shù)或能夠獲取關(guān)于發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度的信息。
文檔編號G01N15/14GK102869982SQ20118001165
公開日2013年1月9日 申請日期2011年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月1日
發(fā)明者山口光城, 近藤圣二, 田邊哲也, 堀邦夫 申請人:奧林巴斯株式會社