專(zhuān)利名稱(chēng)：光學(xué)分析裝置、光學(xué)分析方法和用于光學(xué)分析的計(jì)算機(jī)程序的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)來(lái)自分散或溶解于溶液中的原子、分子或團(tuán)聚體(在下文中，這些均稱(chēng)作“粒 子”)的光進(jìn)行檢測(cè)以用于分析溶液中的粒子的狀態(tài)的光學(xué)分析裝置、光學(xué)分析方法和用于光學(xué)分析的計(jì)算機(jī)程序，更具體地，本發(fā)明涉及如下的光學(xué)分析裝置、光學(xué)分析方法和用于光學(xué)分析的計(jì)算機(jī)程序其能夠通過(guò)使用諸如共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能對(duì)來(lái)自溶液中的微小區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)的光學(xué)系統(tǒng)來(lái)獲取對(duì)分析例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或其團(tuán)聚體等生物分子以及例如病毒、細(xì)胞或非生物粒子等粒狀物等等各種粒子的狀態(tài)(相互作用、結(jié)合或離解狀態(tài)，等等)有用的信息。
背景技術(shù)：
根據(jù)近年來(lái)光學(xué)測(cè)量技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和能夠?qū)庾佑?jì)數(shù)(單光子檢測(cè))的超高靈敏度光檢測(cè)技術(shù)，使得單光子或單熒光分子水平的微弱光的檢測(cè)和/或測(cè)量成為可能。因此，提出了借助于這種微弱光檢測(cè)技術(shù)對(duì)生物分子等的分子間相互作用、結(jié)合或離解反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的各種裝置或方法。例如，在熒光相關(guān)光譜分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy :FCS,參見(jiàn)例如專(zhuān)利文獻(xiàn)I和2以及非專(zhuān)利文獻(xiàn)1-3)中，借助于激光共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)，對(duì)樣品溶液中的微小區(qū)域(顯微鏡的激光會(huì)聚的聚焦區(qū)域，稱(chēng)作“共聚焦體積”)內(nèi)進(jìn)出的熒光分子或熒光標(biāo)記分子(熒光分子等)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，并且基于由測(cè)得的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值所確定的熒光分子等在微小區(qū)域中的平均駐留時(shí)間(平移擴(kuò)散時(shí)間)和駐留分子數(shù)的平均值，實(shí)現(xiàn)了諸如熒光分子等的運(yùn)動(dòng)速度、尺寸或濃度等信息的獲取和/或諸如分子的結(jié)構(gòu)或大小的變化、分子的結(jié)合或離解反應(yīng)或者分散和團(tuán)聚等各種現(xiàn)象的檢測(cè)。此外，在熒光強(qiáng)度分布分析(Fluorescence Intensity Distribution Analysis :FIDA,例如專(zhuān)利文獻(xiàn)3)或者光子計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析(Photon Counting Histogram :PCH,例如專(zhuān)利文獻(xiàn)4)中，生成了通過(guò)與FCS類(lèi)似的方式測(cè)得的進(jìn)出共聚焦體積的熒光分子等的熒光強(qiáng)度的直方圖，并且通過(guò)將統(tǒng)計(jì)模型公式與直方圖的分布擬合來(lái)計(jì)算熒光分子等的特征亮度的平均值以及共聚焦體積內(nèi)駐留的分子的平均數(shù)，從而，將基于這些信息估算分子的結(jié)構(gòu)或尺寸變化、結(jié)合或離解狀態(tài)或者分散和團(tuán)聚狀態(tài)。此外，在專(zhuān)利文獻(xiàn)5和6中，提出了基于使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)測(cè)得的樣品溶液中熒光信號(hào)的時(shí)間演進(jìn)來(lái)檢測(cè)熒光物質(zhì)的方法。專(zhuān)利文獻(xiàn)7提出了一種信號(hào)計(jì)算處理技術(shù)，其利用光子計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)量來(lái)自流過(guò)流式細(xì)胞儀的熒光微?；蛘邅?lái)自固定在基板上的熒光微粒的微弱光，以檢測(cè)熒光微粒是否存在于流體中或者基板上。特別地，根據(jù)諸如FCS和FIDA等采用了使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)來(lái)對(duì)微小區(qū)域進(jìn)行熒光測(cè)量的技術(shù)的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，測(cè)量所需的樣品量可以極少(一次測(cè)量所使用的量最多幾十μ L)且濃度極低，并且測(cè)量時(shí)間也大幅縮短(在一次測(cè)量中，反復(fù)進(jìn)行若干次時(shí)間為秒量級(jí)的測(cè)量)。因此，特別是在對(duì)醫(yī)學(xué)或生物學(xué)研究和開(kāi)發(fā)領(lǐng)域中常用的稀有或昂貴的樣品進(jìn)行分析時(shí)，或者在諸如疾病臨床診斷或生物活性物質(zhì)的篩選等對(duì)大量的樣本進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，期望這些技術(shù)與傳統(tǒng)的生化方法相比是使得能夠以低成本和/或快速地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或試驗(yàn)的強(qiáng)力的手段?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)I :日 本特開(kāi)2005-098876專(zhuān)利文獻(xiàn)2 :日本特開(kāi)2008-292371專(zhuān)利文獻(xiàn)3 日本特許第4023523號(hào)專(zhuān)利文獻(xiàn)4 :國(guó)際公開(kāi)2008-080417專(zhuān)利文獻(xiàn)5 :日本特開(kāi)2007-20565專(zhuān)利文獻(xiàn)6 :日本特開(kāi)2008-116440專(zhuān)利文獻(xiàn)7 :日本特開(kāi)平4-337446號(hào)公報(bào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)I :金城政孝，“蛋白質(zhì)，核酸,酵素”，Vol. 44，No. 9,1431 — 1438頁(yè)，1999 年。非專(zhuān)利文獻(xiàn)2 F. J.梅耶-阿姆茲(F. J. Meyer-Alms),熒光相關(guān)光譜學(xué)(Fluorescence Correlation Spectroscopy), R.里格爾(R. Rigler)編，施普林格(Springer)，柏林，2000 年,204 — 224 頁(yè)。非專(zhuān)利文獻(xiàn)3 :加藤則子外4名，遺傳子醫(yī)學(xué)，Vol. 6，No. 2，271 — 277頁(yè)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題在諸如FCS、FIDA和PCH等上述光學(xué)分析技術(shù)中，簡(jiǎn)要地說(shuō)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)處理算出測(cè)得的熒光強(qiáng)度的時(shí)間波動(dòng)的大小，然后基于波動(dòng)的大小確定在樣品溶液中的微小區(qū)域內(nèi)進(jìn)出的熒光分子等的各種特性。因此，為了在上述光學(xué)分析技術(shù)中獲得顯著的結(jié)果，優(yōu)選的是，以如下方式準(zhǔn)備被用作樣品溶液中的觀(guān)測(cè)對(duì)象的熒光分子等的濃度或數(shù)密度使得在平衡狀態(tài)下，在秒量級(jí)長(zhǎng)度的一次測(cè)量時(shí)間內(nèi)，有使得統(tǒng)計(jì)處理能夠進(jìn)行的數(shù)量的熒光分子等將進(jìn)出微小區(qū)域，優(yōu)選地，使得在微小區(qū)域中將總是存在大約一個(gè)熒光分子等(典型地，由于共聚焦體積的體積為大約lfL，所以?xún)?yōu)選的是熒光分子等的濃度為大約InM以上)。換言之，當(dāng)樣品溶液中被觀(guān)測(cè)粒子的濃度或數(shù)密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于使得統(tǒng)計(jì)處理能夠進(jìn)行的水平(例如，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于InM)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)在測(cè)量時(shí)間內(nèi)很少有被觀(guān)測(cè)對(duì)象進(jìn)入到微小區(qū)域內(nèi)的狀態(tài)，因此，熒光強(qiáng)度的測(cè)量結(jié)果會(huì)包括很長(zhǎng)一段時(shí)間的在微小區(qū)域內(nèi)完全不存在被觀(guān)測(cè)對(duì)象的狀態(tài)，并且顯著的熒光強(qiáng)度的觀(guān)測(cè)量也會(huì)減小，因此，不能夠期望在如上所述基于熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)波動(dòng)的光學(xué)分析技術(shù)中有顯著的或精確的分析結(jié)果。在專(zhuān)利文獻(xiàn)5和6中描述的使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)熒光物質(zhì)的方法中，在未對(duì)熒光強(qiáng)度波動(dòng)如上所述地進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理的情況下，能夠根據(jù)遍及數(shù)秒的測(cè)量時(shí)間內(nèi)是否產(chǎn)生具有顯著強(qiáng)度的熒光信號(hào)來(lái)確定樣品中是否存在被觀(guān)測(cè)熒光分子等，并且公開(kāi)了，已經(jīng)獲得具有顯著強(qiáng)度的熒光信號(hào)的頻率與樣品中熒光分子等的數(shù)量之間的相關(guān)性。特別地，在專(zhuān)利文獻(xiàn)6中啟示，攪動(dòng)樣品溶液的內(nèi)部的隨機(jī)流動(dòng)的發(fā)生改善檢測(cè)敏感度。然而，即使在那些方法中，也僅僅檢測(cè)到是否存在由于擴(kuò)散或隨機(jī)流動(dòng)而隨機(jī)地進(jìn)出微小區(qū)域的熒光分子等，而不能掌握微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的粒子的行為，所以，例如沒(méi)有實(shí)現(xiàn)粒子的計(jì)數(shù)或者粒子的濃度或數(shù)密度的定量計(jì)算。此外，專(zhuān)利文獻(xiàn)7中描述的技術(shù)在于檢測(cè)流式細(xì)胞儀中的流體內(nèi)是否存在單個(gè)熒光微?；蛘邫z測(cè)是否存在固定于基板上的單個(gè)熒光微粒，而不是用于對(duì)在樣品溶液中在通常狀態(tài)下被溶解或分散的諸如分子和膠體等粒子、即在樣品溶液中隨機(jī)移動(dòng)的粒子進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)，因此，沒(méi)有實(shí)現(xiàn)定量地算出樣品溶液內(nèi)溶解或分散的粒子的濃度或數(shù)密度。此外，由于專(zhuān)利文獻(xiàn)7的技術(shù)包括諸如流式細(xì)胞儀中的測(cè)量或?qū)晒饬Ｗ庸潭ㄓ诨宓奶幚淼冗^(guò)程，所以與諸如FCS、FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)的情況相比，大大地增加了試驗(yàn)所需的樣品量，并且對(duì)于進(jìn)行試驗(yàn)的人員可能要求復(fù)雜且先進(jìn)的操作技術(shù)。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種新的光學(xué)分析技術(shù)，該技術(shù)不包括諸如FCS,FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)中進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)處理，使得能夠在包含的被觀(guān)測(cè)粒子的濃度或數(shù)密度比諸如FCS、FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)所能夠處理的水平低的樣品溶液中檢測(cè)被觀(guān)測(cè)粒子的狀態(tài)或特性。
另外，本發(fā)明的另一目的在于提供一種實(shí)現(xiàn)上述新的光學(xué)分析技術(shù)的光學(xué)分析裝置、方法或用于光學(xué)分析的計(jì)算機(jī)程序，其中，能夠在與諸如FCS、FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)相似的短的測(cè)量時(shí)間內(nèi)利用少量樣品(例如，數(shù)十μ L的水平)完成測(cè)量，還能夠定量地確定被觀(guān)測(cè)粒子的諸如濃度或數(shù)密度等特性。用于解決問(wèn)題的方案總的來(lái)說(shuō)，在本發(fā)明中，提出了一種新型光學(xué)分析技術(shù)，該技術(shù)借助于諸如共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠?qū)?lái)自溶液中的微小區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)的光學(xué)系統(tǒng)對(duì)分散在樣品溶液中且在樣品溶液中隨機(jī)地移動(dòng)的發(fā)光的粒子(以下稱(chēng)為“發(fā)光粒子”)發(fā)出的光進(jìn)行檢測(cè)，該技術(shù)在使微小區(qū)域的位置在樣品溶液中移動(dòng)的同時(shí)(即，在利用微小區(qū)域掃描樣品溶液的內(nèi)部的同時(shí))對(duì)來(lái)自微小區(qū)域、即光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)，由此單個(gè)地檢測(cè)橫穿微小區(qū)域的內(nèi)部的發(fā)光粒子，并且使得能夠?qū)Πl(fā)光粒子計(jì)數(shù)和能夠獲取關(guān)于樣品溶液內(nèi)的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度的信息。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種光學(xué)分析裝置，其通過(guò)使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)對(duì)來(lái)自發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測(cè)，所述發(fā)光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機(jī)地移動(dòng)，其特征在于，所述光學(xué)分析裝置包括光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部，其使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)；光檢測(cè)部，其對(duì)來(lái)自所述光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)；和信號(hào)處理部，其產(chǎn)生在所述光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)的過(guò)程中利用所述光檢測(cè)部檢測(cè)的來(lái)自所述光檢測(cè)區(qū)域的光的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，對(duì)所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理，并且隨后在經(jīng)過(guò)平滑處理的所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中單個(gè)地檢測(cè)來(lái)自每個(gè)所述發(fā)光粒子的光信號(hào)。在該結(jié)構(gòu)中，“分散在樣品溶液中且在樣品溶液中隨機(jī)地移動(dòng)的發(fā)光粒子”是能發(fā)光且分散或溶解在樣品溶液中的諸如原子、分子或其團(tuán)聚體等粒子，并且可以是在溶液中自由地進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)而未固定于基板的任意微粒物質(zhì)等。該發(fā)光粒子典型地為熒光粒子，但是也可以是通過(guò)磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等發(fā)光的粒子。共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的“光檢測(cè)區(qū)域”是那些顯微鏡中的檢測(cè)光的微小區(qū)域，該區(qū)域與當(dāng)照明光從物鏡發(fā)出時(shí)將照明光會(huì)聚到的區(qū)域?qū)?yīng)(該區(qū)域根據(jù)共聚焦顯微鏡中的、特別是物鏡和針孔之間的空間關(guān)系來(lái)確定。對(duì)于在沒(méi)有照明光的情況下發(fā)光的發(fā)光粒子，例如根據(jù)化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光的粒子，在顯微鏡中不需要照明光。)。在這方面，在本說(shuō)明書(shū)中，“光信號(hào)”是指“表示光的信號(hào)”。如從以上可以理解到的，在本發(fā)明的裝置的基本結(jié)構(gòu)中，首先，在使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液中移動(dòng)的同時(shí)，即在利用光檢測(cè)區(qū)域掃描樣品溶液的內(nèi)部的同時(shí)，順次地進(jìn)行光的檢測(cè)。因此，當(dāng)移動(dòng)的光檢測(cè)區(qū)域包括隨機(jī)地移動(dòng)的發(fā)光粒子時(shí)，通過(guò)光檢測(cè)部檢測(cè)來(lái)自發(fā)光粒子的光，由此，通過(guò)捕獲該光，將檢測(cè)到存在一個(gè)發(fā)光粒子。在那種情況下，當(dāng)一個(gè)發(fā)光粒子是單個(gè)或多個(gè)熒光分子時(shí)，光從發(fā)光粒子隨機(jī)地發(fā)出，并且會(huì)在微小時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生光信號(hào)值的落差。并且當(dāng)產(chǎn)生這樣的落差時(shí)，指明與一個(gè)發(fā)光粒子的存在對(duì)應(yīng)的信號(hào)變得困難。因此，將該裝置的信號(hào)處理部設(shè)計(jì)成根據(jù)光檢測(cè)部檢測(cè)到的信號(hào)順次地產(chǎn)生時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；并有對(duì)該時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)應(yīng)用平滑處理，以使得光信號(hào)值的落差可以被忽略的方式處理數(shù)據(jù)，并且隨后在經(jīng)過(guò)平滑處理的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中單個(gè)地檢測(cè)來(lái)自每個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)。在該方面，典型地，光檢測(cè)部通過(guò)光子計(jì)數(shù)檢測(cè)來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光，因此，在那種情況下，時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)。當(dāng)在溶液中隨機(jī)移動(dòng)的發(fā)光粒子如上所述變得可被單個(gè)地檢測(cè)時(shí)，將獲取關(guān)于溶 液中的發(fā)光粒子的狀態(tài)的各種信息。具體地，例如，在本發(fā)明的裝置中，信號(hào)處理部可以被設(shè)計(jì)成通過(guò)對(duì)單個(gè)地檢測(cè)到的發(fā)光粒子的光信號(hào)的數(shù)量計(jì)數(shù)(發(fā)光粒子的計(jì)數(shù))，對(duì)在光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的過(guò)程中檢測(cè)到的發(fā)光粒子的數(shù)量計(jì)數(shù)。根據(jù)該結(jié)構(gòu)，通過(guò)將發(fā)光粒子數(shù)與光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)量相關(guān)聯(lián)，將獲取關(guān)于樣品溶液內(nèi)的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度的信息。特別地，通過(guò)用任意方法確定光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡的總體積，例如通過(guò)使光檢測(cè)區(qū)域以預(yù)定的速度移動(dòng)，能夠具體地計(jì)算出發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。當(dāng)然，代替直接確定絕對(duì)的數(shù)密度值或濃度值，可以計(jì)算出數(shù)密度或濃度相對(duì)于多個(gè)樣品溶液或者相對(duì)于作為濃度或數(shù)密度的基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)比率。在本發(fā)明的裝置的信號(hào)處理部的處理中，可以基于經(jīng)過(guò)平滑處理的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的光信號(hào)的形狀判定是否有一個(gè)發(fā)光粒子已經(jīng)進(jìn)入光檢測(cè)區(qū)域。在實(shí)施方式中，典型地，當(dāng)檢測(cè)到具有比預(yù)定閾值大的強(qiáng)度的光信號(hào)時(shí)，可以檢測(cè)出一個(gè)發(fā)光粒子已經(jīng)進(jìn)入到光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)。此外，在上述本發(fā)明的裝置中，基于發(fā)光粒子的特性或樣品溶液內(nèi)發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度來(lái)適當(dāng)?shù)馗淖児鈾z測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液中的移動(dòng)速度。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的，來(lái)自發(fā)光粒子的檢測(cè)到的光的狀態(tài)可以根據(jù)發(fā)光粒子的特性或樣品溶液內(nèi)發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度而改變。特別地，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度變快時(shí)，從一個(gè)發(fā)光粒子獲得的光量將減小，所以，優(yōu)選的是能夠適當(dāng)?shù)馗淖児鈾z測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度，使得能夠以精確的或足夠的靈敏度測(cè)量來(lái)自一個(gè)發(fā)光粒子的光。此外，在本發(fā)明的裝置中，優(yōu)選地，將光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液中的移動(dòng)速度設(shè)定為高于作為待檢測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度(粒子由于布朗運(yùn)動(dòng)而移動(dòng)的平均移動(dòng)速度)。如上所述，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域通過(guò)存在發(fā)光粒子的位置時(shí)，本發(fā)明的裝置檢測(cè)到從發(fā)光粒子發(fā)出的光，由此單個(gè)地檢測(cè)發(fā)光粒子。然而，當(dāng)發(fā)光粒子由于布朗運(yùn)動(dòng)而隨機(jī)地移動(dòng)以致多次進(jìn)出光檢測(cè)區(qū)域時(shí)，將多次檢測(cè)到來(lái)自一個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)(表明存在發(fā)光粒子)，所以，使存在一個(gè)發(fā)光粒子與檢測(cè)到的光信號(hào)相關(guān)聯(lián)變得困難。因此，如上所述，將光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度設(shè)定為高于發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度，由此，變成能夠使一個(gè)發(fā)光粒子與一個(gè)光信號(hào)(表明存在發(fā)光粒子)相對(duì)應(yīng)。在這方面，由于擴(kuò)散移動(dòng)速度取決于發(fā)光粒子而不同，所以，優(yōu)選地，如上所述可以將本發(fā)明的裝置設(shè)計(jì)成能夠根據(jù)發(fā)光粒子的特性(特別是擴(kuò)散常數(shù))來(lái)適當(dāng)?shù)馗淖児鈾z測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度?？梢砸匀我夥绞絹?lái)完成用于使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的光學(xué)系統(tǒng)的光路的改變。例如，可以通過(guò)使用激光掃描型光顯微鏡中采用的電流鏡改變光路來(lái)改變光檢測(cè)區(qū)域的位置，或者在不移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)，可以通過(guò)移動(dòng)樣品溶液的位置(移動(dòng)顯微鏡的載物臺(tái))來(lái)移動(dòng)樣品溶液中的光檢測(cè)區(qū)域的位置。光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)軌跡可以任意地設(shè)定，例如，該移動(dòng)軌跡可以從圓形、橢圓形、矩形、直線(xiàn)和曲線(xiàn)中選擇。在實(shí)施方式中，可以將使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)對(duì)來(lái)自樣品溶液中的發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測(cè)的本發(fā)明的光學(xué)分析裝置設(shè)計(jì)成在使光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域以比樣品溶液內(nèi)發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度在樣品溶液中移動(dòng)的同時(shí)，對(duì)進(jìn)入到光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)部的各個(gè)發(fā)光粒子發(fā)出的光信號(hào)單個(gè)地進(jìn)行檢測(cè)，并且通過(guò)對(duì)光信號(hào)計(jì)數(shù)來(lái)對(duì)進(jìn)入到光檢測(cè)區(qū)域的發(fā)光粒子數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。在上述本發(fā)明的裝置中與使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液中移動(dòng)一起進(jìn)行光檢測(cè)、并且對(duì)來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)單個(gè)地進(jìn)行檢測(cè)的光學(xué)分析技術(shù)的處理也可以通過(guò)通用計(jì)算機(jī)來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于光學(xué)分析的計(jì)算機(jī)程序，其用于通過(guò)使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)對(duì)來(lái)自發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測(cè)，所述發(fā)光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機(jī)地移動(dòng)，其特征在于，所述計(jì)算機(jī)程序使計(jì)算機(jī)執(zhí)行如下進(jìn)程使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)；在使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)的同時(shí)對(duì)來(lái)自所述光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)，并且產(chǎn)生時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；對(duì)所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理；和在經(jīng)過(guò)平滑處理的所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中單個(gè)地檢測(cè)來(lái)自每個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)。另外，該計(jì)算機(jī)程序可以包括通過(guò)對(duì)單個(gè)地檢測(cè)出的來(lái)自發(fā)光粒子的光信號(hào)的數(shù)量計(jì)數(shù)來(lái)對(duì)在光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的過(guò)程中檢測(cè)到的發(fā)光粒子的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)的進(jìn)程；和/或基于檢測(cè)到的發(fā)光粒子數(shù)來(lái)確定樣品溶液內(nèi)的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度的進(jìn)程。典型地，在檢測(cè)來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光以產(chǎn)生時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的進(jìn)程中，通過(guò)光子計(jì)數(shù)來(lái)檢測(cè)來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光，并且在那種情況下，時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)為時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)。在使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的過(guò)程中，可以使光檢測(cè)區(qū)域的位置以預(yù)定的速度或者比發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)，并且可以基于發(fā)光粒子的特性或樣品溶液內(nèi)發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度來(lái)設(shè)定光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。此外，在信號(hào)處理過(guò)程中， 可以基于經(jīng)過(guò)平滑處理的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的光信號(hào)的形狀來(lái)判定一個(gè)發(fā)光粒子是否進(jìn)入到光檢測(cè)區(qū)域中，例如，基于具有比預(yù)定閾值大的強(qiáng)度的光信號(hào)的檢測(cè)來(lái)判定。光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡可以從圓形、橢圓形、矩形、直線(xiàn)和曲線(xiàn)中選擇。此外，根據(jù)上述本發(fā)明的裝置或計(jì)算機(jī)程序，實(shí)現(xiàn)了新的光學(xué)分析方法，該方法通過(guò)與使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液中移動(dòng)一起對(duì)光進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)單個(gè)地檢測(cè)來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)。因此，本發(fā)明的光學(xué)分析方法，其通過(guò)使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)對(duì)來(lái)自發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測(cè)，所述發(fā)光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機(jī)地移動(dòng)，其特征在于，所述方法包括如下步驟使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)；在使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)的同時(shí)對(duì)來(lái)自所述光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)，并且產(chǎn)生時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；對(duì)所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理；和在經(jīng)過(guò)平滑處理的所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中單個(gè)地檢測(cè)來(lái)自每個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)。該方法也可以包括通過(guò)對(duì)單個(gè)地檢測(cè)出的來(lái)自發(fā)光粒子的光信號(hào)的數(shù)量計(jì)數(shù)來(lái)對(duì)在光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的過(guò)程中檢測(cè)到的發(fā)光粒子的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)的步驟；和/或基于檢測(cè)到的發(fā)光粒子數(shù)來(lái)確定樣品溶液內(nèi)的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度的步驟。此外，在使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的步驟中，可以使光檢測(cè)區(qū)域的位置以預(yù)定的速度或比發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)，并且可以基于發(fā)光粒子的特性或樣品溶液內(nèi)發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度來(lái)設(shè)定光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。此外，在信號(hào)處理步驟中，可以基于經(jīng)過(guò)平滑處理的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的光信號(hào)的形狀來(lái)判定一個(gè)發(fā)光粒子是否進(jìn)入到光檢測(cè)區(qū)域中，例如基于對(duì)具有比預(yù)定閾值大的強(qiáng)度的光信號(hào)的檢測(cè)來(lái)判定。發(fā)明的效果通過(guò)上述本發(fā)明的裝置、方法或計(jì)算機(jī)程序?qū)崿F(xiàn)的光學(xué)分析技術(shù)為自身的光檢測(cè) 機(jī)構(gòu)采用了如下結(jié)構(gòu)與諸如FCS、FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)的情況類(lèi)似，對(duì)來(lái)自共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡中的光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)，因此，樣品溶液的量可以同樣地少。然而，由于在本發(fā)明中未進(jìn)行計(jì)算熒光強(qiáng)度波動(dòng)的統(tǒng)計(jì)處理，所以本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)適用于發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度大大地低于諸如FCS、FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)所需的水平的樣品溶液。此外，由于在本發(fā)明中對(duì)分散或溶解在溶液中的各個(gè)發(fā)光粒子單個(gè)地進(jìn)行檢測(cè)，所以通過(guò)使用關(guān)于粒子的信息能夠定量地進(jìn)行發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)、樣品溶液中發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度的計(jì)算或者獲取關(guān)于濃度或數(shù)密度的信息。例如，雖然專(zhuān)利文獻(xiàn)5和6能夠獲取在預(yù)定時(shí)間內(nèi)強(qiáng)度超過(guò)預(yù)定閾值的熒光信號(hào)的頻率的總數(shù)與樣品溶液中熒光分子等的粒子數(shù)之間的相關(guān)性，但是不能掌握通過(guò)測(cè)量區(qū)域的粒子的動(dòng)態(tài)行為(粒子是徑直通過(guò)測(cè)量區(qū)域或是駐留在測(cè)量區(qū)域內(nèi))，因此，強(qiáng)度比預(yù)定閾值高的熒光信號(hào)與通過(guò)測(cè)量區(qū)域的粒子之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系不清楚，從而發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)從理論上講是不可能的，從而難以精確地確定樣品溶液內(nèi)粒子的濃度。然而，根據(jù)本發(fā)明，由于使得通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的發(fā)光粒子與檢測(cè)到的光信號(hào)以I對(duì)I的方式相關(guān)聯(lián)，使得一次將檢測(cè)一個(gè)發(fā)光粒子，所以對(duì)分散在溶液中且在溶液中隨機(jī)地移動(dòng)的發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)成為可能，并且與傳統(tǒng)技術(shù)相比能夠精確地確定樣品溶液中粒子的濃度或數(shù)密度。本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)典型地用于生物微粒對(duì)象的溶液的狀態(tài)分析，其中生物微粒對(duì)象為例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或者其團(tuán)聚體等生物分子，以及病毒和細(xì)胞等，但是也可以用于溶液中非生物粒子(例如原子、分子、膠束、金屬膠體等)的狀態(tài)分析，并且應(yīng)當(dāng)理解的是，這些情況也都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在該方面，在本發(fā)明中，根據(jù)在對(duì)光檢測(cè)部中檢測(cè)的來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理之后、在經(jīng)過(guò)平滑處理的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中單個(gè)地檢測(cè)每個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)的方式，即使在微小時(shí)間內(nèi)的落差因?yàn)楣鈴囊粋€(gè)發(fā)光粒子隨機(jī)地發(fā)出并且粒子數(shù)小而出現(xiàn)在來(lái)自一個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)的值中的情況下(例如當(dāng)發(fā)光粒子時(shí)單個(gè)熒光分子時(shí))，可以使光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上出現(xiàn)的光信號(hào)與發(fā)光粒子精確地對(duì)應(yīng)，因此，發(fā)光粒子數(shù)的更精確的計(jì)數(shù)、進(jìn)而在良好的狀況下對(duì)發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度的測(cè)量變得可能。[在專(zhuān)利文獻(xiàn)5和6的情況下，時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上出現(xiàn)的光信號(hào)與發(fā)光粒子不關(guān)聯(lián)。另外，在利用傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀中的熒光測(cè)量來(lái)檢測(cè)發(fā)光粒子的技術(shù)的情況下，由于觀(guān)測(cè)到的發(fā)光粒子是攜帶多個(gè)熒光分子的粒子，所以在來(lái)自一個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)的值中不會(huì)產(chǎn)生微小時(shí)間內(nèi)的極大的落差，因此不對(duì)光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理。]本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)將通過(guò)以下對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的說(shuō)明變得清楚。


[圖I]圖I的(A)是根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析裝置的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的示意圖。圖I的(B)是共聚焦體積(共聚焦顯微鏡的觀(guān)測(cè)區(qū)域)的示意圖。圖I的(C)是用于改變鏡7的方向以使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液中移動(dòng)的機(jī)構(gòu)的示意圖。圖I的(D)是用于移動(dòng)顯微感光板的水平位置以使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液中移動(dòng)的機(jī)構(gòu)的示意圖。[圖2]圖2的(A)和圖2的(B)分別是說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)來(lái)檢測(cè)光的原理的示意圖和測(cè)得的光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的示意圖。圖2的(C)是對(duì)光子數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行平 滑處理和擬合處理的示意圖。[圖3]圖3的(A)和圖3的(B)分別是發(fā)光粒子由于布朗運(yùn)動(dòng)而橫穿光檢測(cè)區(qū)域的情況下的模型圖和示出在該情況下光子數(shù)(光強(qiáng)度)隨時(shí)間的變化的示例的圖。[圖4]圖4的(A)和圖4的(B)分別是使得光檢測(cè)區(qū)域的位置以比發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度在樣品溶液內(nèi)移動(dòng)時(shí)發(fā)光粒子橫穿光檢測(cè)區(qū)域的情況下的模型圖和示出在該情況下光子數(shù)(光強(qiáng)度)隨時(shí)間的變化的示例的圖。[圖5]圖5是說(shuō)明包括檢測(cè)出的信號(hào)的二值化處理的、根據(jù)通過(guò)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)測(cè)得的光子數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化執(zhí)行發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)的信號(hào)處理步驟的一個(gè)示例的圖。[圖6]圖6是說(shuō)明包括檢測(cè)出的信號(hào)的微分處理的、根據(jù)通過(guò)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)測(cè)得的光子數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化執(zhí)行發(fā)光粒子數(shù)的計(jì)數(shù)的信號(hào)處理步驟的一個(gè)示例的圖。[圖7]圖7是對(duì)通過(guò)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)來(lái)檢測(cè)發(fā)光粒子以及對(duì)發(fā)光粒子計(jì)數(shù)的計(jì)算實(shí)驗(yàn)用模型進(jìn)行說(shuō)明的圖。[圖8]圖8的(A)示出通過(guò)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)測(cè)得的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)的示例；圖8的(B)示出經(jīng)過(guò)平滑處理的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)(通過(guò)對(duì)時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)實(shí)施平滑處理而獲取的數(shù)據(jù));圖8的(C)示出對(duì)經(jīng)過(guò)平滑處理的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合的高斯函數(shù)曲線(xiàn)。圖8的(D)示出用于確定經(jīng)過(guò)平滑處理的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中脈沖存在區(qū)域的處理。[圖9]圖9示出通過(guò)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)測(cè)得的光子數(shù)數(shù)據(jù)(棒狀線(xiàn))、通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理而獲得的曲線(xiàn)(虛線(xiàn))和對(duì)存在峰值的區(qū)域擬合的高斯函數(shù)(實(shí)線(xiàn))的示例。圖中，附有“噪聲”的信號(hào)作為由噪聲或雜質(zhì)產(chǎn)生的信號(hào)而被忽視。[圖10]圖10的(A)示出根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光粒子數(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖10的(B)示出利用平板讀取器進(jìn)行的發(fā)光粒子的熒光強(qiáng)度測(cè)量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖中，縱向條均表示三次測(cè)量的平均值，而誤差條示出三次測(cè)量的SD值。圖10的(C)是標(biāo)出與發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的脈沖信號(hào)的數(shù)量(脈沖數(shù))以及與各樣品溶液中的發(fā)光粒子濃度相關(guān)的光子總數(shù)(光子數(shù))的圖表，其中，在根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行發(fā)光粒子數(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)而獲得的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中檢測(cè)所述脈沖信號(hào)的數(shù)量，并且在同一時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中檢測(cè)所述光子總數(shù)。[圖11]圖11的(A)是關(guān)于含有100fM、lpM和IOpM的發(fā)光粒子的樣品溶液，以圖表的形式示出在未應(yīng)用平滑處理的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中被檢測(cè)為與發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的脈沖信號(hào)的信號(hào)數(shù)量的圖，以及圖11的(B)是關(guān)于相同的樣品溶液，以圖表的形式示出在應(yīng)用了平滑處理的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中被檢測(cè)為與發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的脈沖信號(hào)的信號(hào)數(shù)量的圖。[圖12]圖12示出在計(jì)算熒光強(qiáng)度波動(dòng)的傳統(tǒng)光學(xué)分析技術(shù)中獲得的光子數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化的示例，其中，圖12的(A)示出粒子濃度處于在測(cè)量中提供足夠精度的水平的情況，圖12的(B)示出樣品中的粒子濃度顯著地低于情況(A)時(shí)的情況。附圖標(biāo)記說(shuō)明 I...光學(xué)分析裝置(共聚焦顯微鏡)2...光源3···單模光纖4...準(zhǔn)直透鏡5···分色鏡6,7,11...反射鏡8...物鏡9...顯微感光板10...井(樣品溶液容器)12...聚光透鏡13···針孔14···阻斷濾片15...多模光纖16···光電檢測(cè)器17...鏡偏轉(zhuǎn)器17a...載物臺(tái)位置改變裝置18···計(jì)算機(jī)
具體實(shí)施例方式
在下文中，詳細(xì)地描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。光學(xué)分析裝置的結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)的光學(xué)分析裝置的基本結(jié)構(gòu)可以是如圖I的(A)中示意性地示出的那樣通過(guò)將能夠被用來(lái)進(jìn)行FSC、FIDA等的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)與光電檢測(cè)器組合而形成的裝置。參照附圖，光學(xué)分析裝置I由光學(xué)系統(tǒng)2-17和計(jì)算機(jī)18構(gòu)成，該計(jì)算機(jī)18用于獲取和分析數(shù)據(jù)并且控制光學(xué)系統(tǒng)的各部件的操作。光學(xué)分析裝置I的光學(xué)系統(tǒng)可以與通常的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)相同，其中，從光源2發(fā)出并通過(guò)單模光纖3的內(nèi)部傳輸?shù)募す?Ex)在光纖的發(fā)射端形成以固有NA所決定的角度放射的發(fā)散光；并且在利用準(zhǔn)直透鏡4形成平行光束之后，光在分色鏡5和反射鏡6、7上反射，從而進(jìn)入到物鏡8中。典型地，在物鏡8的上方放置被分注了一至數(shù)十yL的樣品溶液的樣品容器或者其上配置有井10的顯微感光板9，并且從物鏡8發(fā)出的激光在樣品容器或井10中的樣品溶液內(nèi)聚焦，從而形成具有強(qiáng)的光強(qiáng)度的區(qū)域(激發(fā)區(qū)域)。熒光粒子或者附有諸如熒光染料等發(fā)光標(biāo)記的粒子等作為被觀(guān)測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子在樣品溶液中分散或溶解，并且當(dāng)發(fā)光粒子進(jìn)入到激發(fā)區(qū)域時(shí)，發(fā)光粒子在駐留于激發(fā)區(qū)域中的過(guò)程中被激發(fā)，從而發(fā)出光。在通過(guò)物鏡8和分色鏡5之后，發(fā)出的光(Em)在鏡11上反射并且被聚光透鏡12會(huì)聚，然后該光通過(guò)針孔13、透過(guò)阻斷濾片14 (在這里僅選擇處于特定波長(zhǎng)帶區(qū)域的光分量)并被導(dǎo)入多模光纖15中，從而到達(dá)光電檢測(cè)器16，并且在轉(zhuǎn)換為時(shí)間序列電信號(hào)之后，該信號(hào)被輸入到計(jì)算機(jī)18中，在計(jì)算機(jī)18中以稍后說(shuō)明的方式執(zhí)行用于光學(xué)分析的處理。在這方面，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的，在上述結(jié)構(gòu)中，針孔13位于物鏡8的聚焦位置的共軛位置處，因此，僅從如圖I的(B)中示意性地示出的激光的聚焦區(qū)域、即激發(fā)區(qū)域發(fā)出的光通過(guò)針孔13，而來(lái)自激發(fā)區(qū)域之外的其他區(qū)域的光被阻擋。圖I的(B)中示出的激光的聚焦區(qū)域是該光學(xué)分析裝置中的有效體積通常為大約I-IOfL的光檢測(cè)區(qū)域(典型地，光強(qiáng)度與在區(qū)域的中央具有峰值的高斯分布一致地展開(kāi)。有效體積是以光強(qiáng)度減小至峰值強(qiáng)度的Ι/e2的表面為邊界 的近似橢球的體積)，該有效體積稱(chēng)作“共聚焦體積”。此外，由于在本發(fā)明中對(duì)來(lái)自一個(gè)發(fā)光粒子的光、例如來(lái)自一個(gè)熒光染料分子的微弱光進(jìn)行檢測(cè)，所以，優(yōu)選地，光電檢測(cè)器16使用能夠用于光子計(jì)數(shù)的超高靈敏度光電檢測(cè)器。當(dāng)通過(guò)光子計(jì)數(shù)來(lái)進(jìn)行光的檢測(cè)時(shí)，以對(duì)預(yù)定時(shí)間內(nèi)的每個(gè)預(yù)定單位時(shí)間(BIN時(shí)間)測(cè)量到達(dá)光電檢測(cè)器的光子的數(shù)量的方式，連續(xù)地進(jìn)行光強(qiáng)度的測(cè)量。因此，在這種情況下，時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)。此外，可以在顯微鏡的載物臺(tái)(未示出)上設(shè)置用于使顯微感光板9的水平位置移動(dòng)的載物臺(tái)位置改變機(jī)構(gòu)17a，以改變被觀(guān)測(cè)的井10。載物臺(tái)位置改變裝置17a的操作可以由計(jì)算機(jī)18控制。根據(jù)該結(jié)構(gòu)，即使存在兩個(gè)以上的樣本也能夠?qū)崿F(xiàn)快速的測(cè)量。此外，在上述光學(xué)分析裝置的光學(xué)系統(tǒng)中，設(shè)置有用于利用光檢測(cè)區(qū)域、即聚焦區(qū)域掃描樣品溶液的內(nèi)部，也就是用于使光檢測(cè)區(qū)域在樣品溶液內(nèi)移動(dòng)的機(jī)構(gòu)。對(duì)于用于使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的該機(jī)構(gòu)，例如，如圖I的(C)中示意性地示出的那樣，可以采用改變反射鏡7的方向的鏡偏轉(zhuǎn)器17 (使光檢測(cè)區(qū)域的絕對(duì)位置移動(dòng)的類(lèi)型)。該鏡偏轉(zhuǎn)器17可以與配備在通常的激光掃描型顯微鏡上的電流鏡裝置中的鏡偏轉(zhuǎn)器相同?；蛘撸商娲?，如圖I的(D)所示，可以采用載物臺(tái)位置改變裝置17a來(lái)移動(dòng)分注了樣品容液的容器10(顯微感光板9)的水平位置，以使光檢測(cè)區(qū)域的相對(duì)位置在樣品溶液中移動(dòng)(使樣品溶液的絕對(duì)位置移動(dòng)的類(lèi)型)。無(wú)論在哪一種類(lèi)型中，為了得到光檢測(cè)區(qū)域的位置期望的移動(dòng)圖形，在計(jì)算機(jī)18的控制下與光電檢測(cè)器16的光檢測(cè)協(xié)調(diào)一致地驅(qū)動(dòng)鏡偏轉(zhuǎn)器17或者載物臺(tái)位置改變裝置17a。光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡可以從圓形、橢圓形、矩形、直線(xiàn)和曲線(xiàn)中以單個(gè)或組合的形式任意地選擇(在計(jì)算機(jī)18中的程序中，可以設(shè)計(jì)成能夠選擇多種移動(dòng)圖形。)。在這方面，雖然未示出，但是可以通過(guò)上下移動(dòng)物鏡8而使光檢測(cè)區(qū)域的位置在上下方向上移動(dòng)。在用作被觀(guān)測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子通過(guò)多光子吸收而發(fā)光的情況下，上述光學(xué)系統(tǒng)被用作多光子顯微鏡。在那種情況下，由于光僅從激發(fā)光的聚焦區(qū)域(光檢測(cè)區(qū)域)發(fā)出，所以可以移除針孔13。此外，在用作被觀(guān)測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子不是由于激發(fā)光而是由于化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光現(xiàn)象而發(fā)光的情況下，可以省略用于產(chǎn)生激發(fā)光的光學(xué)系統(tǒng)2-5。當(dāng)發(fā)光粒子由于磷光或散射光而發(fā)光時(shí)，照原樣使用上述共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。此外，如圖所示，在光學(xué)分析裝置I中，可以設(shè)置兩個(gè)以上的激發(fā)光源2，使得能夠根據(jù)發(fā)光粒子的激發(fā)波長(zhǎng)適當(dāng)?shù)剡x擇激發(fā)光的波長(zhǎng)。類(lèi)似地，也可以設(shè)置兩個(gè)以上的光電檢測(cè)器16，使得當(dāng)樣品包含波長(zhǎng)彼此不同的兩種以上的發(fā)光粒子時(shí)，能夠根據(jù)波長(zhǎng)對(duì)分別從這些發(fā)光粒子發(fā)出的光分開(kāi)地進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)的原理諸如FCS和FIDA等光譜分析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于，與傳統(tǒng)的生化分析技術(shù)相比，需要的樣品量極少并且能夠迅速地進(jìn)行試驗(yàn)。然而，在諸如FCS和FIDA等這些光譜分析技術(shù)中，從原理上講是基于熒光強(qiáng)度波動(dòng)來(lái)計(jì)算被觀(guān)測(cè)粒子的濃度和特性，所以，為了獲得精確的測(cè)量結(jié)果，樣品溶液中的被觀(guān)測(cè)粒子的濃度或數(shù)密度應(yīng)當(dāng)處于如圖12的(A)所示意性地繪出的那樣在測(cè)量熒光強(qiáng)度的過(guò)程中光檢測(cè)區(qū)域CV內(nèi)總是存在大約一個(gè)被觀(guān)測(cè)粒子的水平，使得如圖中右手側(cè)所示出的那樣在測(cè)量時(shí)間內(nèi)總是能夠檢測(cè)到顯著的光強(qiáng)度(光子數(shù))。當(dāng)被觀(guān)測(cè)粒子的濃度或數(shù)密度低于上述水平、例如處于如圖12的(B)所繪出的那樣被觀(guān)測(cè)粒子很少進(jìn)入到光檢測(cè)區(qū)域CV內(nèi)的水平時(shí)，如圖中右手側(cè)所示，在一部分測(cè)量時(shí)間·中將不會(huì)出現(xiàn)顯著的光強(qiáng)度(光子數(shù))，因此，精確地計(jì)算光強(qiáng)度波動(dòng)會(huì)變得困難。另外，當(dāng)被觀(guān)測(cè)粒子的濃度顯著地低于在測(cè)量過(guò)程中光檢測(cè)區(qū)域的內(nèi)部總是存在大約一個(gè)被觀(guān)測(cè)粒子的水平時(shí)，光強(qiáng)度波動(dòng)的計(jì)算會(huì)受到背景的影響，為了獲得足夠用于計(jì)算的顯著數(shù)量的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(光子數(shù))，應(yīng)當(dāng)延長(zhǎng)測(cè)量時(shí)間。為此，在本發(fā)明中，提出了一種基于新的原理的光學(xué)分析技術(shù)，即使當(dāng)被觀(guān)測(cè)粒子的濃度低于諸如FCS和FIDA等上述光譜分析技術(shù)中所要求的水平時(shí)，該光學(xué)分析技術(shù)也能夠檢測(cè)被觀(guān)測(cè)粒子的諸如數(shù)密度或濃度等特性。在本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)中，簡(jiǎn)要地說(shuō)，在進(jìn)行處理時(shí)，與通過(guò)驅(qū)動(dòng)用于使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的機(jī)構(gòu)(鏡偏轉(zhuǎn)器17或載物臺(tái)位置改變裝置17a)從而如圖2中所示意性地繪出的那樣使得光檢測(cè)區(qū)域CV的位置在樣品溶液中移動(dòng)、即利用光檢測(cè)區(qū)域CV掃描樣品溶液的內(nèi)部一起進(jìn)行光檢測(cè)。因此，例如，如在圖2的(A)中，在使光檢測(cè)區(qū)域CV移動(dòng)的過(guò)程中(圖中，時(shí)間t0至t2)，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域CV通過(guò)存在一個(gè)發(fā)光粒子(圖中為熒光染料)的區(qū)域時(shí)(tl)，如圖2的(B)所示顯著的光強(qiáng)度(Em)將被檢測(cè)為脈沖狀的信號(hào)。因此，通過(guò)在如上所述執(zhí)行使光檢測(cè)區(qū)域CV的位置移動(dòng)和光檢測(cè)的過(guò)程中逐個(gè)地檢測(cè)如圖2的(B)所示的那樣出現(xiàn)的各顯著的光強(qiáng)度、即各脈沖狀的信號(hào)，而單個(gè)地檢測(cè)發(fā)光粒子，并且通過(guò)對(duì)發(fā)光粒子數(shù)計(jì)數(shù)，能夠獲取關(guān)于測(cè)量區(qū)域內(nèi)存在的發(fā)光粒子的數(shù)量、濃度或數(shù)密度的信息。應(yīng)當(dāng)理解的是，在本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)的原理中，沒(méi)有執(zhí)行諸如計(jì)算熒光強(qiáng)度波動(dòng)等統(tǒng)計(jì)計(jì)算處理，而是逐個(gè)地檢測(cè)發(fā)光粒子，因此，即使在發(fā)光粒子(被觀(guān)測(cè)粒子)的濃度處于在FCS和FIDA中不能夠進(jìn)行足夠精確的分析的低的水平的樣品溶液中，也能夠獲取關(guān)于發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度的信息。在這方面，如“發(fā)明內(nèi)容”部分已經(jīng)指出的，在發(fā)光粒子是單分子水平或多分子水平的熒光染料等的情況下，從發(fā)光粒子發(fā)出的光子的數(shù)量少并且光子是隨機(jī)發(fā)出的。因此，在實(shí)際的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(光子數(shù)數(shù)據(jù))中，光子數(shù)(光強(qiáng)度)的值(PC)如圖2的(C)所示會(huì)在微小時(shí)間內(nèi)具有落差，因此，如果試圖從原始光子數(shù)數(shù)據(jù)檢測(cè)發(fā)光粒子的光信號(hào)，來(lái)自一個(gè)發(fā)光粒子的光可能偶然被錯(cuò)誤地檢測(cè)為來(lái)自?xún)蓚€(gè)或多個(gè)發(fā)光粒子的光。例如，在示出的示例中，盡管光子數(shù)PC的組被認(rèn)作來(lái)自一個(gè)發(fā)光粒子的光，但由于微小時(shí)間內(nèi)落差的存在，例如可能將三個(gè)信號(hào)組和(iii)錯(cuò)誤識(shí)別為對(duì)應(yīng)于不同的發(fā)光粒子的信號(hào)。因此，在本發(fā)明中，使用移動(dòng)平均法等對(duì)原始光子數(shù)數(shù)據(jù)應(yīng)用平滑處理。當(dāng)應(yīng)用平滑處理時(shí)，如圖中實(shí)線(xiàn)所繪出的，光子數(shù)的值變?yōu)榻频溺娦蚊}沖信號(hào)，由此與來(lái)自一個(gè)發(fā)光粒子的光對(duì)應(yīng)的信號(hào)檢測(cè)變得容易，從而減少將來(lái)自一個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)錯(cuò)誤識(shí)別為來(lái)自?xún)蓚€(gè)或多個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)的可能性。此外，通過(guò)將諸如圖中虛線(xiàn)所繪出的高斯函數(shù)等鐘形函數(shù)與經(jīng)過(guò)平滑處理的光子數(shù)數(shù)據(jù)中出現(xiàn)的各個(gè)脈沖狀信號(hào)擬合，并且基于擬合結(jié)果來(lái)判定各個(gè)脈沖狀信號(hào)是否是與來(lái)自發(fā)光粒子的光對(duì)應(yīng)的信號(hào)，可以實(shí)現(xiàn)與經(jīng)過(guò)平滑處理的光子數(shù)數(shù)據(jù)中來(lái)自發(fā)光粒子的光對(duì)應(yīng)的信號(hào)的檢測(cè)。本發(fā)明的光分析裝置的操作和操作過(guò)程 具體地，在利用如圖I的(A)所示的本發(fā)明的光學(xué)分析裝置I的光學(xué)分析中，執(zhí)行(I)測(cè)量包含發(fā)光粒子(被觀(guān)測(cè)粒子)的樣品溶液的光強(qiáng)度的過(guò)程和(2)分析測(cè)得的光強(qiáng)度的過(guò)程。( I)樣品溶液的光強(qiáng)度的測(cè)量在本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)中用作被觀(guān)測(cè)對(duì)象的粒子可以是任意粒子，只要該粒子分散在樣品溶液中并且在樣品溶液中隨機(jī)地移動(dòng)即可、諸如溶解的分子等，例如，粒子可以是生物分子，即蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸等或者這些生物分子的團(tuán)聚體，也可以是病毒、細(xì)胞、金屬膠體或其他非生物分子。當(dāng)用作被觀(guān)測(cè)對(duì)象的粒子不是發(fā)光粒子時(shí)，使用以任意方式將發(fā)光標(biāo)記(突光分子、磷光分子、化學(xué)發(fā)光分子或生物發(fā)光分子)貼附于被觀(guān)測(cè)粒子而制備的粒子。樣品溶液典型地為水溶液，然而不限于此，也可以使用有機(jī)溶劑和其他任意液體。除了在測(cè)量過(guò)程中驅(qū)動(dòng)鏡偏轉(zhuǎn)器17或載物臺(tái)位置改變裝置17a以使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液內(nèi)移動(dòng)(以?huà)呙铇悠啡芤旱膬?nèi)部)之外，可以以與FCS或FIDA中的光強(qiáng)度測(cè)量過(guò)程相同的方式在本發(fā)明的光學(xué)分析中進(jìn)行光強(qiáng)度的測(cè)量。在操作過(guò)程中，典型地，在將樣品溶液分注到顯微感光板9的井10內(nèi)并且將其放在顯微鏡的載物臺(tái)上之后，當(dāng)使用者向計(jì)算機(jī)18輸入測(cè)量開(kāi)始的命令時(shí)，計(jì)算機(jī)18執(zhí)行存儲(chǔ)在存儲(chǔ)裝置(未示出)中的程序(使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液中移動(dòng)的進(jìn)程，和在使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的過(guò)程中從光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)光并且產(chǎn)生時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的進(jìn)程)，因此將啟動(dòng)利用激發(fā)光對(duì)樣品溶液中的光檢測(cè)區(qū)域照明和測(cè)量光強(qiáng)度。在該測(cè)量過(guò)程中，根據(jù)程序在計(jì)算機(jī)18的操作過(guò)程的控制下，鏡偏轉(zhuǎn)器17或載物臺(tái)位置改變裝置17a驅(qū)動(dòng)鏡7 (電流鏡)或顯微鏡的載物臺(tái)上的顯微感光板9以使光檢測(cè)區(qū)域的位置在井10內(nèi)移動(dòng)，與此同時(shí)，光電檢測(cè)器16順次地將檢測(cè)到的光轉(zhuǎn)換成電信號(hào)并將該電信號(hào)傳輸至計(jì)算機(jī)18，計(jì)算機(jī)18將傳輸?shù)墓庑盘?hào)生成時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)并且以任意方式將該時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)存儲(chǔ)起來(lái)。在這方面，光電檢測(cè)器I6典型地為能夠檢測(cè)單個(gè)光子的到達(dá)的超高靈密度光電檢測(cè)器，因此，時(shí)間序列光強(qiáng)度可以是時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)。在測(cè)量光強(qiáng)度的過(guò)程中光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度可以是例如通過(guò)實(shí)驗(yàn)或者為了滿(mǎn)足分析的目的而任意設(shè)定的預(yù)定速度。在基于檢測(cè)到的發(fā)光粒子數(shù)來(lái)獲取關(guān)于數(shù)密度和濃度的信息的情況下，需要知道光檢測(cè)區(qū)域通過(guò)的區(qū)域的尺寸或體積，因此，以使得能夠掌握移動(dòng)距離的方式進(jìn)行光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)。在這方面，因?yàn)槿绻?jīng)過(guò)時(shí)間與光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)距離成比例，則測(cè)量結(jié)果的解釋將變得容易，所以，基本上優(yōu)選的是移動(dòng)速度恒定，然而不限于此。順便提一句，關(guān)于光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度，為了根據(jù)測(cè)得的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)或者對(duì)發(fā)光粒子數(shù)的計(jì)數(shù)來(lái)定量地、精確地、單個(gè)地檢測(cè)發(fā)光粒子，優(yōu)選的是，將移動(dòng)速度設(shè)定為比發(fā)光粒子的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)、即布朗運(yùn)動(dòng)中的移動(dòng)速度快的值。由于本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)中的被觀(guān)測(cè)粒子是分散或溶解到溶液中并且自由地隨機(jī)移動(dòng)的粒子，所以其位置由于布朗運(yùn)動(dòng)而隨時(shí)間移動(dòng)。因此，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度比粒子的由于布朗運(yùn)動(dòng)而移動(dòng)的速度慢時(shí)，粒子將如圖3的(A)中所示意性地繪出的那樣在區(qū)域中隨機(jī)地移動(dòng)，從而如圖3的(B)所示，光強(qiáng)度隨機(jī)地變化(如已經(jīng)指出的，光檢測(cè)區(qū)域中的激發(fā)光強(qiáng)度從區(qū)域的中央處的峰值朝向外側(cè)降低)，使得確定與各發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的顯著的光強(qiáng)度變化變得困難。因此，優(yōu)選地，如圖4的(A)所繪出的那樣，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度被設(shè)定為比粒子的由于布朗運(yùn)動(dòng)而移動(dòng)的平均移動(dòng)速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)快，使得粒子將近似直線(xiàn)地橫穿光檢測(cè)區(qū)域，并且如圖4的(B)所示，與各個(gè)發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的光強(qiáng)度的變化的輪廓
在時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中變得幾乎一致(當(dāng)發(fā)光粒子近似直線(xiàn)地通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)，光強(qiáng)度變化的輪廓與激發(fā)光強(qiáng)度分布類(lèi)似)，并且能夠容易地確定各發(fā)光粒子與光強(qiáng)度之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。具體地，擴(kuò)散系數(shù)為D的發(fā)光粒子由于布朗運(yùn)動(dòng)而通過(guò)半徑為Wo的光檢測(cè)區(qū)域(共聚焦體積)所需的時(shí)間At由均方位移關(guān)系的表達(dá)式(2ffo)2=6D · At(I)給出，為Δ t= (2ffo) 2/6D —(2)，因此，發(fā)光粒子由于布朗運(yùn)動(dòng)而移動(dòng)的速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)Vdif近似為Vdif=2ffo/At=3D/ffo —(3)因此，參照該公式，可以將光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為比Vdif足夠快的值。例如，假設(shè)Wo為大約O. 62 μ m,當(dāng)被觀(guān)測(cè)粒子的擴(kuò)散系數(shù)預(yù)計(jì)大約為D=2. OX 10_1(lm2/S時(shí)，Vdif將為I. OX 10_3m/s，因此，可以將光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為Vdif的10倍以上，例如15mm/s。在這方面，當(dāng)被觀(guān)測(cè)粒子的擴(kuò)散系數(shù)未知時(shí)，可以通過(guò)設(shè)定光檢測(cè)區(qū)域的位置的各種移動(dòng)速度而反復(fù)地執(zhí)行預(yù)備試驗(yàn)以找出光強(qiáng)度變化的輪廓變成期望的輪廓(典型地，與激發(fā)光強(qiáng)度分布類(lèi)似)的條件，以此來(lái)確定光檢測(cè)區(qū)域的位置的適當(dāng)?shù)囊苿?dòng)速度。(2)光強(qiáng)度的分析當(dāng)通過(guò)上述處理獲得了樣品溶液的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時(shí)，通過(guò)根據(jù)存儲(chǔ)在存儲(chǔ)裝置中的程序的進(jìn)程(對(duì)時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑化處理的進(jìn)程，以及在經(jīng)過(guò)平滑處理的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中單個(gè)地檢測(cè)各發(fā)光粒子的光信號(hào)的進(jìn)程)，可以在計(jì)算機(jī)18中進(jìn)行如下所述的光強(qiáng)度的分析。(i) 一個(gè)發(fā)光粒子的檢測(cè)當(dāng)一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的軌跡如圖4的(A)中所示近似為直線(xiàn)時(shí)，在時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中與該發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的光強(qiáng)度變化具有如圖5的(A)中所示意性地繪出的、反映光檢測(cè)區(qū)域(由光學(xué)系統(tǒng)確定)中的光強(qiáng)度分布的輪廓(通常近似為鐘形)。因此，在用于檢測(cè)發(fā)光粒子的一個(gè)方法中，為光強(qiáng)度設(shè)定閾值Ιο，當(dāng)光強(qiáng)度超過(guò)閾值持續(xù)的時(shí)間寬度△ τ在預(yù)定范圍內(nèi)時(shí)，可以判定光強(qiáng)度的曲線(xiàn)對(duì)應(yīng)于通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的一個(gè)發(fā)光粒子，因而檢測(cè)到一個(gè)發(fā)光粒子?；趶南鄬?duì)于光檢測(cè)區(qū)域以預(yù)定的速度移動(dòng)的發(fā)光粒子發(fā)出的光的強(qiáng)度的期望的輪廓來(lái)確定光強(qiáng)度的閾值Io和時(shí)間寬度△ τ的預(yù)定范圍，具體數(shù)值可以任意地或通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定，也可以根據(jù)被觀(guān)測(cè)粒子的特性選擇性地確定。此外，在檢測(cè)發(fā)光粒子的另一個(gè)方法中，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的光強(qiáng)度分布可以假設(shè)為高斯分布時(shí)I=A · exp (_2t2/a2) ---(4),并且，當(dāng)通過(guò)將表達(dá)式(4)與顯著的光強(qiáng)度的輪廓(能夠清楚地判定為不是背景的輪廓)擬合而算出的強(qiáng)度A和寬度a均在預(yù)定的范圍內(nèi)時(shí)，判定光強(qiáng)度輪廓與通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的一個(gè)發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)，由此完成一個(gè)發(fā)光粒子的檢測(cè)(強(qiáng)度A和寬度a在預(yù)定范圍之外的輪廓在分析中可以作為噪聲或雜質(zhì)而忽略)。
(ii)發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)可以通過(guò)以任意方式對(duì)由上述發(fā)光粒子的檢測(cè)方法檢測(cè)到的發(fā)光粒子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)完成發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)。然而，對(duì)于大量的發(fā)光粒子，例如可以以下面示出的方式完成該過(guò)程。參照?qǐng)D5的(B)，在根據(jù)時(shí)間序列光強(qiáng)度(光子數(shù))數(shù)據(jù)對(duì)發(fā)光粒子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法的一個(gè)示例中，首先，對(duì)檢測(cè)出的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(上欄)進(jìn)行平滑處理(中欄)。由于光從發(fā)光粒子隨機(jī)地發(fā)出，因而在微小時(shí)間內(nèi)的數(shù)據(jù)值中產(chǎn)生落差，通過(guò)平滑處理可以忽視數(shù)據(jù)值中的該落差。例如可以通過(guò)移動(dòng)平均法來(lái)完成平滑處理。隨后，通過(guò)在平滑處理后的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中對(duì)強(qiáng)度在預(yù)定閾值以上的數(shù)據(jù)點(diǎn)(時(shí)間)分配I并且對(duì)強(qiáng)度小于閾值的數(shù)據(jù)點(diǎn)分配0，來(lái)對(duì)時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行二值化處理(下欄)。因此，在所有數(shù)據(jù)中，通過(guò)對(duì)那些數(shù)值從I變?yōu)镺或從O變?yōu)镮的部分計(jì)數(shù)來(lái)對(duì)測(cè)量過(guò)程中橫穿光檢測(cè)區(qū)域的發(fā)光粒子的數(shù)量計(jì)數(shù)。在根據(jù)時(shí)間序列光強(qiáng)度(光子數(shù))數(shù)據(jù)對(duì)發(fā)光粒子數(shù)計(jì)數(shù)的方法的又一個(gè)示例中，對(duì)如圖5的(B)的情況那樣應(yīng)用了平滑處理的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)(圖6的(A))應(yīng)用微分處理(圖6的(B))。在應(yīng)用了微分處理的該數(shù)據(jù)中，因?yàn)樵趶?qiáng)度峰值點(diǎn)處，其值沿時(shí)間增加的方向減小并且值為O或者其二次微分值為0，所以將通過(guò)對(duì)這些點(diǎn)計(jì)數(shù)來(lái)對(duì)測(cè)量過(guò)程中橫穿光檢測(cè)區(qū)域的發(fā)光粒子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。(iii)發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度的確定當(dāng)已經(jīng)完成了發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)時(shí)，可以使用光檢測(cè)區(qū)域通過(guò)的總區(qū)域的體積來(lái)確定發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。然而，光檢測(cè)區(qū)域的有效體積取決于激發(fā)光的或檢測(cè)出的光的波長(zhǎng)、透鏡的數(shù)值孔徑以及光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整狀態(tài)而變化，因此，難以根據(jù)設(shè)計(jì)參數(shù)值來(lái)計(jì)算光檢測(cè)區(qū)域的有效體積。因此，在本實(shí)施方式中，在與測(cè)量待試驗(yàn)樣品溶液的條件相同的條件下、利用發(fā)光粒子濃度已知的溶液(對(duì)照溶液)按照上述說(shuō)明來(lái)進(jìn)行光強(qiáng)度測(cè)量、發(fā)光粒子的檢測(cè)以及發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)，然后，根據(jù)檢測(cè)出的發(fā)光粒子的數(shù)量和對(duì)照溶液中發(fā)光粒子的濃度，可以確定光檢測(cè)區(qū)域通過(guò)的總區(qū)域的體積、即檢測(cè)出的發(fā)光粒子的數(shù)量與發(fā)光粒子的濃度之間的關(guān)系。優(yōu)選地，對(duì)照溶液的發(fā)光粒子可以是波長(zhǎng)特征與被觀(guān)測(cè)粒子相同的發(fā)光標(biāo)記(熒光染料等)。具體地，例如，假設(shè)在發(fā)光粒子濃度為C的對(duì)照溶液中檢測(cè)出的發(fā)光粒子的數(shù)量為N，那么光檢測(cè)區(qū)域通過(guò)的總區(qū)域的體積Vt由下式給出Vt = N/C —(5)可替代地，制備發(fā)光粒子濃度不同的多種溶液作為對(duì)照溶液，并且對(duì)各溶液進(jìn)行測(cè)量，然后，將計(jì)算出的Vt的平均值確定為光檢測(cè)區(qū)域通過(guò)的總區(qū)域的體積vt。因此，當(dāng)給定Vt時(shí)，發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)結(jié)果為η的樣品溶液的發(fā)光粒子的數(shù)密度C由下式給出
c=n/Vt ---(6)在這方面，光檢測(cè)區(qū)域的體積和光檢測(cè)區(qū)域通過(guò)的總區(qū)域的體積可以通過(guò)任意方法給出，例如代替上述方法而采用FCS和FIDA。此外，在本實(shí)施方式的光學(xué)分析裝置中，對(duì)于假設(shè)的光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)圖形，可以將與各種標(biāo)準(zhǔn)發(fā)光粒子的濃度C與發(fā)光粒子數(shù)N之間的關(guān)系(表達(dá)式(5))有關(guān)的信息預(yù)先存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)18的存儲(chǔ)裝置中，使得裝置的使用者在進(jìn)行光學(xué)分析時(shí)能夠適當(dāng)?shù)厥褂门c該關(guān)系有關(guān)的存儲(chǔ)信息。計(jì)算實(shí)驗(yàn)為了確認(rèn)根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)的原理獲得了與樣品溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度對(duì)應(yīng)的發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)結(jié)果，進(jìn)行如下計(jì)算實(shí)驗(yàn)。圖7示出對(duì)計(jì)算實(shí)驗(yàn)中假設(shè)的模型進(jìn)行說(shuō)明的圖。參照該圖，在計(jì)算實(shí)驗(yàn)中，首先設(shè)想如下模型在該模型中，邊長(zhǎng)為L(zhǎng)的正方體以正方體的中心成為坐標(biāo)系的原點(diǎn)的方式放置在X-Y-Z坐標(biāo)系中，并且正如發(fā)光粒子在樣品溶液中自由地隨機(jī)移動(dòng)那樣，使得擴(kuò)散系數(shù)為D的8個(gè)粒子的位置在正方體內(nèi)每隔時(shí)間寬度At=IOy秒沿隨機(jī)的方向發(fā)生移位。正方體的邊長(zhǎng)L根據(jù)粒子濃度來(lái)設(shè)定例如，當(dāng)粒子濃度設(shè)定為IOpM時(shí)，正方體的邊長(zhǎng)被設(shè)定為L(zhǎng)=Il. Oym0在這方面，為了使得正方體中總是存在8個(gè)粒子從而維持初始設(shè)定的濃度，進(jìn)行如下設(shè)計(jì)當(dāng)粒子移動(dòng)超過(guò)正方體的界面(X，Y，Z=±L/2的平面)時(shí)，使粒子從相對(duì)的界面再次進(jìn)入到正方體中(例如，當(dāng)某粒子超過(guò)X=L/2的平面時(shí)，使該粒子從X=_L/2的平面進(jìn)入到正方體中)。此外，典型地，期望的是，從樣品溶液中實(shí)際的發(fā)光粒子獲得的光強(qiáng)度根據(jù)高斯分布從光檢測(cè)區(qū)域的中央處的峰值沿徑向變化，因此，在正方體中，以原點(diǎn)為中心的光強(qiáng)度分布被設(shè)定為I=A · exp [_2 (X2+Y2+Z2) /Wo2] — (7)，從而假設(shè)在正方體中位于坐標(biāo)點(diǎn)(Χ，Υ，Ζ)的粒子發(fā)出由表達(dá)式(7)給定的光。在表達(dá)式(7)中，A是中心處的強(qiáng)度，其中設(shè)定A=I，而Wo是光束束腰，其被設(shè)定為Wo=620nm。半徑為Wo的球體與有效光檢測(cè)區(qū)域?qū)?yīng)，該有效光檢測(cè)區(qū)域的體積被設(shè)定為近似lfL。此夕卜，在本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)中，使得光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液中移動(dòng)。即，也可以說(shuō)成樣品溶液的空間相對(duì)于光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)。因此，在模型中，為了對(duì)光檢測(cè)區(qū)域以移動(dòng)速度V在空間(樣品溶液)內(nèi)沿-X方向移動(dòng)進(jìn)行建模，設(shè)計(jì)成將V · Λ t沿X方向加到正方體內(nèi)的各粒子的每隔At=IOy秒的位移。圖5的(B)的上欄是在粒子濃度為IOpM的正方體中的粒子根據(jù)上述模型以光檢測(cè)區(qū)域的15mm/s的移動(dòng)速度移位了 2ms的情況下獲得的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，并且從該圖可以直觀(guān)地理解，確認(rèn)兩個(gè)粒子通過(guò)了光檢測(cè)區(qū)域并且各強(qiáng)度變化的輪廓幾乎形成高斯分布。此外，在假設(shè)具有各種濃度的正方體中的粒子根據(jù)上述模型的設(shè)定對(duì)于任意的時(shí)間產(chǎn)生位移并發(fā)光的情況下,通過(guò)依次計(jì)算該時(shí)間內(nèi)從空間發(fā)出的光強(qiáng)度的總量,產(chǎn)生了時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，并且根據(jù)上述發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)方法在獲取的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中對(duì)發(fā)光粒子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。在上述模型中，在粒子濃度設(shè)定為IOpM或O. ΙρΜ、光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度設(shè)定為15mm/s并且測(cè)量時(shí)間(粒子的位移執(zhí)行的時(shí)間)為10秒的條件下，在重復(fù)進(jìn)行的5次發(fā)光粒子的計(jì)算實(shí)驗(yàn)中，粒子的計(jì)數(shù)值的平均值和CV值(標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值)如下濃度IOpMO. IpM計(jì)數(shù)值3668個(gè)粒子 35. 6個(gè)粒子CV 值 1.7%13. 3%如從該結(jié)果可以理解到的，獲得了幾乎與設(shè)定的粒子濃度成比例的粒子的計(jì)數(shù)值。即，該結(jié)果表明，通過(guò)在給定的測(cè)量時(shí)間、給定的光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度、利用給定強(qiáng)度的激發(fā)光對(duì)發(fā)光粒子進(jìn)行激發(fā)的條件下對(duì)諸如染料等具有特定的特性的發(fā)光粒子進(jìn)行計(jì) 數(shù)，能夠獲得與發(fā)光粒子的濃度在數(shù)量上對(duì)應(yīng)的計(jì)數(shù)值，并且能夠確定發(fā)光粒子的濃度。此夕卜，除了光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度設(shè)定為60mm/s之外，當(dāng)以與上述方法相同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，粒子的計(jì)數(shù)值的平均值或CV值(標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值)如下濃度IOpMO. IpM計(jì)數(shù)值11499個(gè)粒子 126個(gè)粒子CV 值 1.1%9. 4%根據(jù)該結(jié)果，表明了，如果增大光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度，則CV值減小，從而能夠減小對(duì)發(fā)光粒子計(jì)數(shù)時(shí)的離散度。此外，在粒子濃度為IfM并且光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度為100mm/s時(shí)進(jìn)行的類(lèi)似實(shí)驗(yàn)中，粒子的計(jì)數(shù)值的平均值和CV值(標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值)分別變成11. 6個(gè)粒子和7. 7%。根據(jù)該結(jié)果，啟示了，在本發(fā)明中，即使被觀(guān)測(cè)粒子的濃度顯著地低于在FCS和FIDA中通常使用的濃度，也能夠進(jìn)行發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)。因此，根據(jù)不包括FCS、FIDA等中進(jìn)行的諸如熒光強(qiáng)度波動(dòng)的計(jì)算等統(tǒng)計(jì)處理的上述本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)，通過(guò)使微小區(qū)域、即光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液中移動(dòng)，也就是掃描樣品溶液的內(nèi)部，并且對(duì)橫穿光檢測(cè)區(qū)域的發(fā)光粒子單個(gè)地進(jìn)行檢測(cè)或者對(duì)發(fā)光粒子進(jìn)行計(jì)數(shù)，能夠?qū)Ρ挥^(guān)測(cè)粒子的濃度或數(shù)密度比FCS、FIDA等中使用的水平低的樣品溶液中的被觀(guān)測(cè)粒子的狀態(tài)和特性進(jìn)行檢測(cè)。在這方面，由于本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)基本上使用與FCS、FIDA等相同的光學(xué)系統(tǒng)，所以可以與FCS、FIDA等一起進(jìn)行。例如，在檢測(cè)包含兩種以上的物質(zhì)的溶液中的這些物質(zhì)之間的相互作用等的情況下，當(dāng)物質(zhì)之間的濃度差異大時(shí)，例如當(dāng)一種物質(zhì)的濃度是nM數(shù)量級(jí)而另一物質(zhì)的濃度是pM數(shù)量級(jí)時(shí)，能夠以如下方式進(jìn)行測(cè)量和分析對(duì)于高濃度的物質(zhì)采用FCS或FIDA來(lái)進(jìn)行測(cè)量和分析，而對(duì)于低濃度的物質(zhì)采用本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)來(lái)進(jìn)行測(cè)量和分析。在這樣的情況下，如圖I的(A)所示，準(zhǔn)備兩個(gè)以上的光電檢測(cè)器是有利的。為了驗(yàn)證上述本發(fā)明的有效性，進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。在這方面，應(yīng)當(dāng)理解的是，以下實(shí)施例僅說(shuō)明本發(fā)明的有效性，并非試圖限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I使用熒光染料ATTO 633 (西格瑪奧德里奇(Sigma Aldrich)公司Cat. No. 18620)作為發(fā)光粒子來(lái)檢驗(yàn)?zāi)軌蚶帽景l(fā)明測(cè)量的樣品溶液中的發(fā)光粒子的濃度范圍。在這方面，作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，也測(cè)量發(fā)光粒子濃度的范圍，該發(fā)光粒子濃度的范圍能夠根據(jù)熒光強(qiáng)度來(lái)測(cè)量，而熒光強(qiáng)度利用平板讀取器測(cè)得。對(duì)于樣品溶液，制備ATT0633的濃度分別為OfM (不含染料)、10fM、100fM、ΙρΜ、10pM、100pM和InM的包含ATT0633的磷酸鹽緩沖液(包含O. 05%的吐溫20)。在這方面，還為對(duì)照實(shí)驗(yàn)制備了包含濃度為IOnM和IOOnM的ATT0633的溶液。在根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)的測(cè)量中，使用配備有共聚焦熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)的單分子熒光測(cè)量裝置MF-20 (奧林巴斯公司)作為光學(xué)分析裝置，并且根據(jù)上述“(I)樣品溶液的光強(qiáng)度的測(cè)量”中說(shuō)明的方式來(lái)獲取上述各樣品溶液的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)。對(duì)于物鏡，使用浸水式物鏡(40X，NA=L 15，WD=O. 26)。為此，光電檢測(cè)器16使用能夠檢測(cè)單個(gè)光子的到達(dá)的超高靈敏度光電檢測(cè)器，因此光檢測(cè)是以對(duì)在每個(gè)預(yù)定的單位時(shí)間(BIN TIME)內(nèi)到達(dá)光電檢測(cè)器的光子數(shù)進(jìn) 行測(cè)量的方式在預(yù)定時(shí)間內(nèi)順次地對(duì)光子進(jìn)行計(jì)數(shù)。因此，時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)。此外，激發(fā)光使用633nm的激光，并且利用帶通濾波器將檢測(cè)到的光波長(zhǎng)設(shè)定為從660nm到710nm。進(jìn)行3次每次2秒的測(cè)量，其中光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣品溶液中的移動(dòng)速度設(shè)定為15mm/秒并且BIN TIME設(shè)定為10μ秒。圖8的(A)中示出通過(guò)2秒的測(cè)量而獲得的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)的示例。在上述光強(qiáng)度測(cè)量之后，對(duì)于各樣品溶液根據(jù)以下處理過(guò)程對(duì)在獲取的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中檢測(cè)出的光信號(hào)進(jìn)行計(jì)數(shù)(a)時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)的平滑處理一通過(guò)移動(dòng)平均法對(duì)時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理。一次平均的數(shù)據(jù)點(diǎn)為9個(gè)點(diǎn)，并且重復(fù)進(jìn)行5次移動(dòng)平均處理。圖8的(B)示出對(duì)圖8的(A)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理的結(jié)果。(b)時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中的脈沖狀信號(hào)存在區(qū)域的檢測(cè)——確定出在通過(guò)(a)處理獲得平滑處理之后在時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中各脈沖狀信號(hào)的起始點(diǎn)和終止點(diǎn)，并且限定脈沖狀信號(hào)存在的區(qū)域。具體地，首先，對(duì)平滑處理之后的全部時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)，計(jì)算出相對(duì)于時(shí)間的一次微分值，以制備時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)的微分值數(shù)據(jù)。然后，參照時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)的微分值數(shù)據(jù)的數(shù)值，如圖8的(D)中所示意性地示出的那樣，將脈沖狀信號(hào)的微分值的變化變大時(shí)的點(diǎn)選作脈沖狀信號(hào)的起始點(diǎn)，而將脈沖狀信號(hào)的微分值的變化變小時(shí)的點(diǎn)選作脈沖狀信號(hào)的終止點(diǎn)，從而將起始點(diǎn)和終止點(diǎn)之間的區(qū)域限定為脈沖狀信號(hào)存在區(qū)域。對(duì)全部時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行脈沖狀信號(hào)存在區(qū)域的限定。(C)鐘形函數(shù)的擬合一作為鐘形函數(shù)，將高斯函數(shù)的表達(dá)式(4)與過(guò)程(b)中限定的各脈沖狀信號(hào)存在區(qū)域擬合。通過(guò)最小二乘法進(jìn)行擬合，其中確定峰值強(qiáng)度A、峰值寬度(最大值的一半時(shí)的全寬度)a以及(高斯函數(shù)中的)相關(guān)系數(shù)。圖8的(C)示出與圖8的(B)的數(shù)據(jù)擬合了的函數(shù)。(d)發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)——參照擬合的函數(shù)的峰值強(qiáng)度、峰值寬度和相關(guān)系數(shù)，僅將滿(mǎn)足以下條件20 μ秒<峰值寬度<40(^秒峰值強(qiáng)度> I (光子/10 μ秒)(A)相關(guān)系數(shù)>0.95的脈沖狀信號(hào)判定為與發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的光信號(hào)，而不滿(mǎn)足上述條件的脈沖狀信號(hào)作為噪聲而被忽視，對(duì)被判定為與發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的光信號(hào)的信號(hào)的數(shù)量作為“脈沖數(shù)”進(jìn)行計(jì)數(shù)。圖9示出被判定為發(fā)光粒子的光信號(hào)的信號(hào)的示例和被判定為噪聲的信號(hào)的示例。
在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，利用平板讀取器SH_80001ab (Corona公司)對(duì)上述各樣品溶液測(cè)量熒光強(qiáng)度。激發(fā)光波長(zhǎng)設(shè)定為633nm ;檢測(cè)光的波長(zhǎng)為657nm ;激發(fā)側(cè)和檢測(cè)側(cè)的帶寬均設(shè)定為12nm。在測(cè)量熒光強(qiáng)度時(shí)，進(jìn)行3次測(cè)量，每次測(cè)量應(yīng)用50次激發(fā)光激發(fā)，并且將3次測(cè)量的平均值作為最終的熒光強(qiáng)度值。圖10的(A)和(B)分別示出在各個(gè)濃度的樣品溶液中檢測(cè)出的上述本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)的測(cè)量結(jié)果(脈沖數(shù))和對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的測(cè)量結(jié)果(熒光強(qiáng)度)(各值分別為三次測(cè)量的平均值。)。首先參照?qǐng)D10的(A)，根據(jù)本發(fā)明測(cè)得的脈沖數(shù)(被算作發(fā)光粒子的光信號(hào)的信號(hào)數(shù))在發(fā)光粒子濃度為IOOfM以上的范圍內(nèi)幾乎與發(fā)光粒子濃度成比例地增大。根據(jù)該結(jié)果，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)使得能夠逐個(gè)地檢測(cè)發(fā)光粒子，并且發(fā)現(xiàn)，通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)對(duì)單個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)行計(jì)數(shù)，能夠定量地確定發(fā)光粒子的濃度。
此外，雖然在圖10的(B)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中不能辨別出在發(fā)光粒子濃度為OM情況下的熒光強(qiáng)度和發(fā)光粒子濃度為IOOpM情況下的熒光強(qiáng)度之間存在顯著差異，但是，在圖10的
(A)的本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)中，可以看出發(fā)光粒子濃度為OM情況下的脈沖數(shù)和發(fā)光粒子濃度為IOOfM情況下的脈沖數(shù)之間存在著顯著的差異。這些結(jié)果的原因被認(rèn)為如下在利用平板讀取器測(cè)量的熒光強(qiáng)度中，由于噪聲或雜質(zhì)而產(chǎn)生的光信號(hào)重疊，因此，在噪聲或雜質(zhì)對(duì)熒光強(qiáng)度的貢獻(xiàn)相對(duì)大的低濃度范圍內(nèi)，S/N比變差。另一方面，在本發(fā)明的情況下，判定時(shí)間序列光信號(hào)數(shù)據(jù)中的各脈沖狀信號(hào)是否與發(fā)光粒子相對(duì)應(yīng)，并且忽視被判定為噪聲或雜質(zhì)的信號(hào)(見(jiàn)圖9)，因此，即使在噪聲或雜質(zhì)對(duì)熒光強(qiáng)度的貢獻(xiàn)相對(duì)大的低濃度區(qū)域中，S/N比也維持得比較良好。實(shí)際上，如圖10的(C)所示，關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)對(duì)各樣品溶液測(cè)量2秒而測(cè)得的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中的總光子數(shù)，在發(fā)光粒子濃度小于IOOpM的范圍內(nèi)，未觀(guān)測(cè)到與發(fā)光粒子濃度為OM的情況相比有顯著差異。即，已經(jīng)表明，根據(jù)本發(fā)明，代替對(duì)時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中的光子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過(guò)從時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)檢測(cè)發(fā)光粒子的光信號(hào)并且對(duì)其數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，顯著地改善了濃度檢測(cè)的靈敏度(在本實(shí)施例的情況下，能夠測(cè)量?jī)晌粩?shù)的低濃度。)。此外，對(duì)于上述時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)的信號(hào)處理，驗(yàn)證平滑處理對(duì)時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)的效果。圖11的(A)和(B)均是示出關(guān)于含有100fM、lpM和IOpM的發(fā)光粒子的各樣品溶液的光信號(hào)的數(shù)量的圖表，分別為通過(guò)對(duì)未應(yīng)用平滑處理的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)和對(duì)應(yīng)用了平滑處理并滿(mǎn)足條件(A)的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行上述處理(b)_ (d)而檢測(cè)的光信號(hào)。如圖中清晰示出的，在應(yīng)用了平滑處理并滿(mǎn)足條件(A)的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中檢測(cè)出的光信號(hào)數(shù)量、即發(fā)光粒子的檢測(cè)數(shù)量與已經(jīng)描述的低至IOOfM的發(fā)光粒子濃度一起減小，而在未應(yīng)用平滑處理并滿(mǎn)足條件(A)的時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)中檢測(cè)出的光信號(hào)數(shù)量與IOpM以下的發(fā)光粒子濃度不對(duì)應(yīng)。這啟示了，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)，通過(guò)對(duì)原始時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理，與發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的光信號(hào)變得可檢測(cè)，并且能夠更精確地確定發(fā)光粒子濃度。因此，已經(jīng)表明，根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)，對(duì)于比利用熒光強(qiáng)度的傳統(tǒng)方法所能夠測(cè)量的數(shù)密度或濃度的極限低的濃度范圍，能夠確定發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。此外，雖然諸如FCS、FIDA和PCH等包括例如熒光強(qiáng)度波動(dòng)的計(jì)算等統(tǒng)計(jì)處理的光學(xué)分析技術(shù)中能夠測(cè)量的粒子濃度的下限為大約InM，但是本實(shí)施例中能夠測(cè)量的粒子濃度的下限為 IOOfM,因此也表明，根據(jù)本發(fā)明，也能夠?qū)舛缺戎T如FCS、FIDA和PCH等光學(xué)分析技術(shù)的情況的濃度顯著低的范圍內(nèi)的粒子進(jìn) 行測(cè)量。
權(quán)利要求
1.一種光學(xué)分析裝置，其通過(guò)使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)對(duì)來(lái)自發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測(cè)，所述發(fā)光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機(jī)地移動(dòng)，其特征在于，所述光學(xué)分析裝置包括 光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部，其使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)； 光檢測(cè)部，其對(duì)來(lái)自所述光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)；和 信號(hào)處理部，其產(chǎn)生在所述光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)的過(guò)程中利用所述光檢測(cè)部檢測(cè)的來(lái)自所述光檢測(cè)區(qū)域的光的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，對(duì)所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理，并且隨后在經(jīng)過(guò)平滑處理的所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中單個(gè)地檢測(cè)來(lái)自每個(gè)所述發(fā)光粒子的光信號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的裝置，其特征在于，所述信號(hào)處理部對(duì)單個(gè)地檢測(cè)到的來(lái)自所述發(fā)光粒子的光信號(hào)的數(shù)量計(jì)數(shù)，以對(duì)在所述光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的過(guò)程中檢測(cè)到的所述發(fā)光粒子的數(shù)量計(jì)數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的裝置，其特征在于，所述光檢測(cè)部通過(guò)光子計(jì)數(shù)來(lái)檢測(cè)來(lái)自所述光檢測(cè)區(qū)域的光，并且所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置以預(yù)定的速度移動(dòng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置以比所述發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述信號(hào)處理部基于經(jīng)過(guò)平滑處理的所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的光信號(hào)的形狀來(lái)檢測(cè)是否有一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入所述光檢測(cè)區(qū)域。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，當(dāng)在經(jīng)過(guò)平滑處理的所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中檢測(cè)到強(qiáng)度比預(yù)定閾值大的光信號(hào)時(shí)，所述信號(hào)處理部檢測(cè)到一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入所述光檢測(cè)區(qū)域。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述信號(hào)處理部基于檢測(cè)到的所述發(fā)光粒子的數(shù)量確定所述樣品溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
9.一種光學(xué)分析方法，其通過(guò)使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)對(duì)來(lái)自發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測(cè)，所述發(fā)光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機(jī)地移動(dòng)，其特征在于，所述方法包括如下步驟 使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)； 在使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)的同時(shí)對(duì)來(lái)自所述光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)，并且產(chǎn)生時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)； 對(duì)所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理；和 在經(jīng)過(guò)平滑處理的所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中單個(gè)地檢測(cè)來(lái)自每個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，還包括如下步驟對(duì)單個(gè)地檢測(cè)到的來(lái)自所述發(fā)光粒子的光信號(hào)的數(shù)量計(jì)數(shù)，以對(duì)在所述光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的過(guò)程中檢測(cè)到的所述發(fā)光粒子的數(shù)量計(jì)數(shù)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其特征在于，在檢測(cè)來(lái)自所述光檢測(cè)區(qū)域的光并且產(chǎn)生所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的步驟中，通過(guò)光子計(jì)數(shù)來(lái)檢測(cè)來(lái)自所述光檢測(cè)區(qū)域的光，并且所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的步驟中，使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置以預(yù)定的速度移動(dòng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求9至12中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的步驟中，使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置以比所述發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)。
14.根據(jù)權(quán)利要求9至13中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在單個(gè)地檢測(cè)來(lái)自每個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)的步驟中，基于經(jīng)過(guò)平滑處理的所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的光信號(hào)的形狀來(lái)檢測(cè)是否有一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入所述光檢測(cè)區(qū)域。
15.根據(jù)權(quán)利要求9至14中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，當(dāng)在經(jīng)過(guò)平滑處理的所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中檢測(cè)到強(qiáng)度比預(yù)定閾值大的光信號(hào)時(shí)，檢測(cè)到一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入所述光檢測(cè)區(qū)域。
16.根據(jù)權(quán)利要求9至15中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，還包括如下步驟基于檢測(cè)到的所述發(fā)光粒子的數(shù)量確定所述樣品溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
17.一種用于光學(xué)分析的計(jì)算機(jī)程序，其用于通過(guò)使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)對(duì)來(lái)自發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測(cè)，所述發(fā)光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機(jī)地移動(dòng)，其特征在于，所述計(jì)算機(jī)程序使計(jì)算機(jī)執(zhí)行如下進(jìn)程 使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)； 在使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述樣品溶液中移動(dòng)的同時(shí)對(duì)來(lái)自所述光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)，并且產(chǎn)生時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)； 對(duì)所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理；和 在經(jīng)過(guò)平滑處理的所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中單個(gè)地檢測(cè)來(lái)自每個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，還包括如下進(jìn)程對(duì)單個(gè)地檢測(cè)到的來(lái)自所述發(fā)光粒子的光信號(hào)的數(shù)量計(jì)數(shù)，以對(duì)在所述光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的過(guò)程中檢測(cè)到的所述發(fā)光粒子的數(shù)量計(jì)數(shù)。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，在檢測(cè)來(lái)自所述光檢測(cè)區(qū)域的光并且產(chǎn)生所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的進(jìn)程中，通過(guò)光子計(jì)數(shù)檢測(cè)來(lái)自所述光檢測(cè)區(qū)域的光，并且所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是時(shí)間序列光子數(shù)數(shù)據(jù)。
20.根據(jù)權(quán)利要求17至19中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，在使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的進(jìn)程中，使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置以預(yù)定的速度移動(dòng)。
21.根據(jù)權(quán)利要求17至20中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，在使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的進(jìn)程中，使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置以比所述發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)。
22.根據(jù)權(quán)利要求17至21中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，在單個(gè)地檢測(cè)來(lái)自每個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)的進(jìn)程中，基于經(jīng)過(guò)平滑處理的所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的光信號(hào)的形狀來(lái)檢測(cè)是否有一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入所述光檢測(cè)區(qū)域。
23.根據(jù)權(quán)利要求17至22中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，在單個(gè)地檢測(cè)來(lái)自每個(gè)所述發(fā)光粒子的光信號(hào)的進(jìn)程中，當(dāng)檢測(cè)到強(qiáng)度比預(yù)定閾值大的光信號(hào)時(shí)，檢測(cè)到一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入所述光檢測(cè)區(qū)域。
24.根據(jù)權(quán)利要求17至23中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，還包括如下進(jìn)程基于檢測(cè)到的所述發(fā)光粒子的數(shù)量確定所述樣品溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
全文摘要
提供一種光學(xué)分析技術(shù)，其能夠?qū)σ缘偷臐舛然驍?shù)密度包含于樣品溶液中的被觀(guān)測(cè)粒子的狀態(tài)或特性進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)使用諸如共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠?qū)?lái)自溶液中的微小區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)的光學(xué)系統(tǒng)，以在使微小區(qū)域的位置在樣品溶液中移動(dòng)的同時(shí)(在利用微小區(qū)域掃描樣品溶液的內(nèi)部的同時(shí))對(duì)來(lái)自被觀(guān)測(cè)發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測(cè)；產(chǎn)生時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，并且隨后對(duì)所述時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理；在經(jīng)過(guò)平滑處理的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中對(duì)橫穿微小區(qū)域的內(nèi)部的發(fā)光粒子單個(gè)地進(jìn)行檢測(cè)，由此使得能夠?qū)Πl(fā)光粒子計(jì)數(shù)或能夠獲取關(guān)于發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度的信息。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102782479SQ201180011640
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2011年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月1日
發(fā)明者堀邦夫, 山口光城, 田邊哲也, 近藤圣二 申請(qǐng)人:奧林巴斯株式會(huì)社