專利名稱：一種間接測定Fenton反應產生的羥基自由基的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及Vc等抗氧化劑對羥基自由基清除率的檢測分析。在技術上涉及光分析化學等領域。
背景技術：
機體代謝過程中活性氧物種(ROS)不斷通過非酶促反應和酶促反應產生，在正常生理情況下，ROS的生成與清除處于動態(tài)平衡，可維持有利無害的極低水平。由于內源性或外源性刺激使機體代謝異常而產生大量R0S，或機體抗氧化劑不足，則使機體處于氧化應急狀態(tài)，導致細胞和組織損傷，引起各種疾病。羥基自由基(·0Η)是目前所知活性氧中對生物體毒性最強、危害最大的一種自由基。羥基自由基參與的各種反應已成為生物學、生物化學和生物醫(yī)學等領域中的重要研究課題。
動物體在生命活動過程中，伴隨著活性氧自由基的生成與存在，生物體在進化過程中也逐漸形成了“抗活性氧的防御系統(tǒng)”。動物體內自由基清除劑是抗自由基防御系統(tǒng)清除自由基作用的物質基礎，它在體內組織和細胞中的含量決定著抗自由基系統(tǒng)的清除自由基能力。人體內的水溶性小分子抗氧化劑包括抗壞血酸、谷胱甘肽、尿酸、色氨酸和半胱氨酸等。除抗壞血酸主要通過食物攝入外，其它幾種都是體內的代謝產物。準確檢測體內各種抗氧化劑對羥基自由基的清除能力，對相關疾病的診斷和藥物的開發(fā)具有重要的意義。
目前，離體檢測這些抗氧化劑對羥基自由基清除率的方法主要有電子共振自旋捕集法、化學發(fā)光法、高效液相色譜法、氣相色譜法、熒光法等。電子自旋共振法和色譜法操作復雜，需要先采用特殊的捕捉試劑對產生的羥基自由基進行捕捉，且這兩種方法儀器昂貴； 化學發(fā)光法雖然操作簡便，測定快速，但其儀器普及不廣。分光光度法因具有儀器簡單廉價、操作方便、分析速度快、靈敏度較高的特點，在自由基清除率的測定中發(fā)揮了極大的作用。
本發(fā)明通過!^nton反應產生羥基自由基，催化鄰苯二胺的顯色反應。Vc等抗氧化劑對羥基自由基有顯著的清除作用，并且抗氧化劑的濃度與吸光度的降低成正比，建立了一種間接測定羥基自由基的可見光分光光度法。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種分析成本低、操作方便、靈敏度高、重現(xiàn)性好的分光光度法間接檢測抗氧化劑對羥基自由基的清除率。
為此，我們以過氧化氫和亞鐵離子構建i^enton體系，產生羥基自由基。在酸性介質中，在具有強氧化性的羥基自由基的作用下，無色的鄰苯二胺迅速被氧化為橙紅色產物， 該產物于450nm處有最大吸收。抗氧化劑對該反應有顯著的抑制效應。通過對比加入抗氧化劑前后產物的吸光度變化，可間接求出抗氧化劑對羥基自由基的清除率。
本發(fā)明的技術方案如下
1.鄰苯二胺的氧化
于容量瓶中依次加入一定濃度的HC1、鄰苯二胺、FeSO4和雙氧水溶液各若干毫升， 加水定容。將混合液置于一定溫度的恒溫水浴中反應一定時間，鄰苯二胺被氧化為穩(wěn)定的橙紅色產物。
2.產物吸收光譜的測量
反應結束后，以去離子水為參比，用Icm比色皿，用紫外可見分光光度計測量產物的吸收光譜(見附

圖1)，獲得最大吸收波長為450nm。
3.產物吸光度的測量
以去離子水為參比，用Icm比色皿，以450nm為分析波長，用紫外可見分光光度計測量產物的吸光度kQO
4.抗氧化劑對鄰苯二胺氧化反應的抑制
于容量瓶中依次加入一定濃度的HC1、鄰苯二胺、FeSO4、抗氧化劑、雙氧水溶液各若干毫升后，加水定容。將混合液置于一定溫度的恒溫水浴中反應一定時間后，測量產物的吸光度A1。由于抗氧化劑對氧化反應的抑制效應，在其余實驗條件相同的情況下，無抗氧化劑存在的產物的吸光度Atl大于抗氧化劑存在的產物的吸光度A1。
本發(fā)明的原理是
酸性條件下，過氧化氫單獨存在時，氧化鄰苯二胺的速度非常緩慢，而在反應介質中加入亞鐵離子，亞鐵離子與過氧化氫構成i^nton體系，產生強氧化性的羥基自由基，使鄰苯二胺迅速發(fā)生氧化反應，并生成穩(wěn)定的橙紅色產物。當在體系中加入抗氧化劑時，具有還原性的抗氧化劑能清除體系中的羥基自由基，抑制了鄰苯二胺的氧化，導致產物的吸光度降低。通過
權利要求
1.一種間接測定i^enton反應產生的羥基自由基的方法。其特征在于測定過程包括以下步驟(1)鄰苯二胺的氧化于容量瓶中依次加入一定濃度的HC1、鄰苯二胺、FeSO4和雙氧水溶液各若干毫升后，加水定容。將混合液置于一定溫度的恒溫水浴中反應一定時間，鄰苯二胺被氧化為穩(wěn)定的橙紅色產物。(2)產物吸收光譜的測量反應結束后，以去離子水為參比，用Icm比色皿，用紫外可見分光光度計測量產物的吸收光譜(見附圖1)，獲得最大吸收波長為450nm。(3)產物吸光度的測量以去離子水為參比，用Icm比色皿，以450nm為分析波長，用紫外可見分光光度計測量產物的吸光度Atl。(4抗氧化劑對鄰苯二胺氧化反應的抑制于容量瓶中依次加入一定濃度的HC1、鄰苯二胺、FeSO4、抗氧化劑、雙氧水溶液各若干毫升后，加水定容。將混合液置于一定溫度的恒溫水浴中反應一定時間后，測量產物的吸光度~。由于抗氧化劑對氧化反應的抑制效應，在其余實驗條件相同的情況下，無抗氧化劑存在的產物的吸光度Atl大于抗氧化劑存在的產物的吸光度A1。(3)羥基自由基清除率的計算按照公式風％) =χ 100計算抗氧化劑對羥基自由基的清除率。Ao
2.據(jù)權利要求1所述的間接測定!^nton反應產生的羥基自由基的方法，其特征在于對于0. lOmmol/L的三種抗氧化劑Vc的抗氧化性最佳，清除率為59. 6% ；硫脲的清除率為 52.4% ；苯甲酸的清除率為51.0%。
全文摘要
以Fe(II)為催化劑、雙氧水為氧化劑，在酸性介質中將無色的鄰苯二胺溶液迅速氧化成橙紅色溶液，該產物于450nm波長處有最大吸收。抗氧化劑能清除Fenton反應產生的羥基自由基，對該反應有顯著抑制作用。當抗氧化劑加入到反應體系中時，產物的吸光度明顯下降，產物的吸光度隨著加入到體系中的抗氧化劑濃度的增加而線性降低，通過對比加入抗氧化劑前后產物的吸光度可計算抗氧化劑對自由基的清除率。方法操作簡單，實驗成本低，靈敏度高。
文檔編號G01N21/33GK102495015SQ201110409958
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月12日 優(yōu)先權日2011年12月12日
發(fā)明者劉瑛, 朱逸雯, 江子卿, 陳新 申請人:江南大學