專利名稱：一種動(dòng)物狂犬病中和抗體elisa檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種用間接酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測(cè)動(dòng)物狂犬病中和抗體的試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RV)感染引起的人畜共患的急性高度致死性傳染病，廣泛流行于世界各地，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)最新的不完全統(tǒng)計(jì)資料報(bào)道，全世界每年約有5. 5萬人死于狂犬病，我國(guó)每年的死亡人數(shù)位列世界第二位，且最近幾年死亡人數(shù)居高不下。而正是狂犬病病毒在動(dòng)物之間的傳播流行直接導(dǎo)致了人狂犬病的流行，預(yù)防人得狂犬病，首先應(yīng)當(dāng)控制和消滅動(dòng)物得狂犬病，即消滅傳染源。因此要從根本上預(yù)防狂犬病的發(fā)生，控制和消滅狂犬病必須對(duì)犬和野生動(dòng)物實(shí)行全面的綜合預(yù)防措施。研究表明狂犬病的控制，最積極有效的措施就是加強(qiáng)犬的免疫。疫苗接種后，并不是所有動(dòng)物都會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗狂犬病毒抗體。只有經(jīng)過檢測(cè)，產(chǎn)生了達(dá)到保護(hù)水平的狂犬病毒抗體的動(dòng)物才能確保不發(fā)生狂犬病。評(píng)價(jià)狂犬病疫苗的免疫效果，主要以免疫后出現(xiàn)抗狂犬病毒抗體為指標(biāo)，尤其抗體出現(xiàn)的時(shí)間、水平和持續(xù)時(shí)間更為重要。因此應(yīng)該在接種疫苗后一個(gè)月，進(jìn)行狂犬病毒抗體檢測(cè)，如果不能產(chǎn)生保護(hù)性狂犬病毒抗體，就應(yīng)該重新或加強(qiáng)免疫，確保免疫效果。WHO狂犬病專家委員會(huì)推薦小鼠中和實(shí)驗(yàn)(MNT)和快速熒光灶抑制實(shí)驗(yàn)(RFFIT)作為檢測(cè)狂犬病毒(RV)中和抗體的兩項(xiàng)基本方法，并為其它方法的基準(zhǔn)和參考。但是，無論是MNT法還是RFFIT法，分別需要21d 和2d以上的實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間，需要組織細(xì)胞培養(yǎng)和昂貴的熒光顯微鏡來配合使用，進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果的判斷。熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAVN)操作繁瑣，對(duì)操作者操作技能要求高，且存在生物安全和人為判斷誤差的問題。ELISA是一種基于抗原抗體特異性反應(yīng)的檢測(cè)方法，其優(yōu)點(diǎn)是敏感、特異、安全、操作簡(jiǎn)單快速，在很多疾病的臨床診斷與流行病學(xué)調(diào)查等方面得到了廣泛的應(yīng)用，適用于大批量標(biāo)本的檢測(cè)，是較為理想的病原或抗體檢測(cè)方法。ELISA檢測(cè)方法對(duì)包被抗原的純度要求較高，現(xiàn)有技術(shù)中純化狂犬病毒的方法主要有離子交換層析純化法、凝膠(分子篩)層析純化法等，其不足之處是抗原純度較低，且操作復(fù)雜，不利于保持生物大分子活性和節(jié)約成本，因此尋找一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、高效純化狂犬病病毒的方法成為制備檢測(cè)狂犬病中和抗體 ELISA試劑盒的迫切需要。法國(guó)Synbiotics公司生產(chǎn)的狂犬病抗體檢測(cè)試劑盒是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE) 唯一推薦的ELISA檢測(cè)試劑盒，但該試劑盒價(jià)格昂貴，為8800元人民幣，導(dǎo)致檢測(cè)成本高不利于推廣使用。開發(fā)一種可以快速準(zhǔn)確，成本較低的ELISA檢測(cè)方法測(cè)定狂犬病中和抗體具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，且對(duì)于構(gòu)建動(dòng)物防疫監(jiān)測(cè)體系和保障公共衛(wèi)生安全意義重大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供檢測(cè)動(dòng)物狂犬病中和抗體間接ELISA檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。
本發(fā)明試劑盒酶標(biāo)板的包被抗原為狂犬病病毒全病毒顆粒，該抗原是采用微載體懸浮培養(yǎng)的狂犬病毒收獲液經(jīng)過超濾、澄清、滅活、線性蔗糖梯度區(qū)帶離心純化后得到的。本發(fā)明使用的狂犬病病毒為狂犬病毒固定毒(CTN-1株)，在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)、擴(kuò)增，經(jīng)超濾、澄清、線性蔗糖梯度區(qū)帶離心濃縮提取，包括以下步驟1)微載體上Vero細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，按0. 03 0. 3感染復(fù)數(shù)的比例接種狂犬病毒， 在溫度32 36°C、轉(zhuǎn)速20 80r/min、pH 7. 20 7. 80、溶氧20% 70%、添加0. 05% 5%牛血清白蛋白的199培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)4-6日后開始收獲上清液至細(xì)胞完全脫落為止；2)將病毒收獲液用0. 1 0.45 μ m濾芯過濾澄清后，用100KD 300KD膜包，超濾濃縮；3)向狂犬病毒濃縮液中加入β-丙內(nèi)酯，在2 8°C條件下滅活，37°C水解；4)狂犬病毒滅活液用線性蔗糖梯度進(jìn)行區(qū)帶離心，4°C，20000 50000r/min ；離心1 5小時(shí)，離心后泵入60%蔗糖溶液，收集狂犬病毒富集峰，得到的狂犬病毒離心液用截留分子量為100KD 300KD膜包超濾濃縮，PBS溶液透析脫糖，得到狂犬病毒純化液。本發(fā)明試劑盒還包括酶標(biāo)二抗、樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)血清、陽性血清、陰性血清、顯色劑、終止液和洗滌液。本發(fā)明使用的酶標(biāo)抗體為辣根過氧化物酶記羊抗犬IgG抗體；標(biāo)準(zhǔn)血清的制備是將狂犬病病毒滅活抗原三針免疫程序接種比格犬，當(dāng)血清效價(jià)高于6. 0IU/ml時(shí)，1周后采血分離血清，56°C滅活30分鐘；本發(fā)明試劑盒所用的陽性血清為狂犬病病毒CTN-I株滅活抗原免疫犬后獲得的血清，測(cè)定血清狂犬病毒抗體水平；所述陰性血清為未感染狂犬病病毒且未免疫過狂犬病疫苗的健康犬血清。當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，本發(fā)明試劑盒所用的顯色劑由底物A液和底物B 液組成，底物A液含有檸檬酸鈉、雙氧水等，底物B液為TMB ；終止液為2mol/L硫酸溶液；所述洗滌液為含有的Tween-20的PBS緩沖液。一種制備本發(fā)明試劑盒的方法，包括1)狂犬病病毒滅活后，用線性蔗糖梯度區(qū)帶離心純化，純化的狂犬病全病毒顆粒與包被緩沖液配成合適濃度，包被酶標(biāo)板；2)辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗犬IgG，獲得酶標(biāo)二抗；3)狂犬病抗體檢測(cè)陰陽性對(duì)照血清的制備，按常規(guī)方法制備狂犬病抗體檢測(cè)陰性對(duì)照血清、狂犬病抗體檢測(cè)陽性對(duì)照血清和狂犬病抗體標(biāo)準(zhǔn)血清；4)配制試劑，按配方配制封閉液、洗滌液、樣品稀釋液、酶標(biāo)二抗稀釋液、底物顯色液、終止液；5)試劑盒組裝，將純化的狂犬病全病毒顆粒包被的酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗、狂犬病抗體檢測(cè)陰陽性對(duì)照血清、標(biāo)準(zhǔn)血清及封閉液、洗滌液、樣品稀釋液、酶標(biāo)二抗稀釋液、底物顯色液、終止液按試劑盒配制定量分裝。其中步驟1)所述的純化狂犬病全病毒的包被濃度為2 μ g/ml。本發(fā)明還提供了該試劑盒在檢測(cè)動(dòng)物狂犬病病毒中和抗體中的應(yīng)用。采用狂犬病毒全病毒顆粒包被酶標(biāo)板，以中和抗體效價(jià)分別為0.04IU/ml， 0. 02IU/ml，0. 01IU/ml，0. 005IU/ml，0. 0025IU/ml，0. 00125IU/ml,0. 000625IU/ml 的血清作為標(biāo)準(zhǔn)，使用標(biāo)準(zhǔn)血清和待檢血清分別與包被抗原反應(yīng)后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗犬IgG抗體，反應(yīng)結(jié)束顯色后根據(jù)OD值和標(biāo)準(zhǔn)血清中和抗體效價(jià)，計(jì)算待檢血清的中和抗體效價(jià)，從而定量確定動(dòng)物的狂犬病疫苗免疫水平。本發(fā)明提供的試劑盒利用辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗犬IgG抗體、標(biāo)準(zhǔn)血清和包被抗原，能夠簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確定量的檢測(cè)犬血清中的狂犬病中和抗體。經(jīng)各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證，該試劑盒表現(xiàn)為具有良好的特異性，較高的敏感性，較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，其中對(duì)陰性血清檢測(cè)符合率為100%，對(duì)目標(biāo)動(dòng)物的其他常見疾病血清抗體不具有交叉反應(yīng)。敏感性的靈敏度最低檢出限量為0. 0625IU/ml，試劑盒檢測(cè)的重復(fù)性好，變異系數(shù)CV為2. 74%，37°C放置14 天和2 8°C放置390天后，試劑盒敏感性和特異性檢測(cè)結(jié)果均符合試劑盒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，能準(zhǔn)確快速地檢測(cè)狂犬病抗體水平，避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，且由于純化方法先進(jìn)，所以成本相對(duì)于其他檢測(cè)方法降低很多，適用于大批量標(biāo)本的檢測(cè)。本發(fā)明對(duì)狂犬病病毒使用線性蔗糖梯度區(qū)帶離心純化方法，其中雜蛋白Vero細(xì)胞宿主蛋白殘留量比其他廠家的顯著降低約3000ng/ml左右，說明此方法純化的抗原純度高于其他方法。本發(fā)明試劑盒與世界衛(wèi)生組織唯一推薦的ELISA檢測(cè)試劑盒(法國(guó)Synbiotics公司)進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果說明兩個(gè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果無明顯差異，但本發(fā)明試劑盒的成本比后者低一半左右。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。MEM培養(yǎng)基、水解乳蛋白為GIBCO公司產(chǎn)品，新生牛血清為蘭州民海生物公司產(chǎn)品，199培養(yǎng)基為SIGMA公司產(chǎn)品，胰蛋白酶為DIFCO公司產(chǎn)品，谷氨酰胺為^witrogen公司產(chǎn)品，微載體Cytodexl為Amersham公司產(chǎn)品，培養(yǎng)瓶為Corning/Greiner公司產(chǎn)品， 100KD 300KD膜包為Pall公司產(chǎn)品。實(shí)施例1試劑盒的制備包被抗原的制備和包被采用微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)，進(jìn)行Vero細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層，按照一定比例接種狂犬病毒CTN-I株病毒，購自中國(guó)藥品生物制品檢定所，進(jìn)行培養(yǎng)和收獲病毒液。線性蔗糖梯度區(qū)帶離心濃縮提取純化病毒液包括以下步驟1)微載體上Vero細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，按0. 03感染復(fù)數(shù)(Μ. 0. I)的比例接種狂犬病毒，在溫度33 °C、轉(zhuǎn)速40r/min、pH 7. 6、溶氧50 %、添加0. 05 %牛血清白蛋白的199培養(yǎng)基為培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)4-6日后開始收獲上清液至細(xì)胞完全脫落為止；2)將病毒收獲液用0. 45 μ m濾芯過濾澄清后，用300KD膜包超濾濃縮；3)向狂犬病毒濃縮液中加入β-丙內(nèi)酯，在4°C條件下滅活，37°C水解；4)狂犬病毒滅活液用線性蔗糖梯度進(jìn)行區(qū)帶離心，4°C，25000r/min ；離心2. 5小時(shí)，離心后泵入蔗糖頂液，收集狂犬病毒富集峰，得到的狂犬病毒離心液用截留分子量為 100KD膜包超濾濃縮，PBS溶液透析脫糖，得到狂犬病毒純化液。包被時(shí)用包被稀釋液將病毒稀釋成總蛋白濃度為2 μ g/ml，每孔IOOul加入96孔酶標(biāo)板，4 °C過夜。1.酶標(biāo)板的封閉和保存上述包被的酶標(biāo)板取出后，用PBST(含0. 05% Tween20的0.01mol/L、pH 7. 4PBS)洗滌3次，甩干。每孔加入封閉液(蔗糖0. 05g/ml Jroclin-300 0.1%, BSA 0.028/1111，卩85)200111，371孵育2小時(shí)。用PBST洗滌2次，風(fēng)干。采用鋁箔袋
真空封口，4°C保存。2.陽性血清的制備狂犬病毒中和抗體為陰性的3只比格犬，人工免疫狂犬病毒滅活抗原，采用兩針免疫程序(0天，14天)接種比格犬，每次1頭份/只，疫苗接種后21天試血，血清效價(jià)高于2. 0IU/ml時(shí)，于疫苗接種后28天采血分離血清。將犬血清混合后56°C 滅活30min，制備狂犬病毒陽性血清作為試劑盒中陽性血清。3.陰性血清的制備上述陰性比格犬，在免疫前采血，分離血清。4.標(biāo)準(zhǔn)血清的制備使用狂犬病毒中和抗體為陰性的4只比格犬，人工免疫狂犬病毒滅活抗原，采用三針免疫程序(O天，14天，60天)接種比格犬，每次1頭份/只，疫苗接種后67天試血，血清效價(jià)高于6.0IU/ml時(shí)，于疫苗接種后74天采血分離血清。將犬血清混合后56°C滅活30min，制備狂犬病毒抗體標(biāo)準(zhǔn)血清作為試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)血清。5.洗滌液(20XPBST)的配制使用去離子水配制，各組分終濃度至NaCl 0. 16g/ ml, KH2PO4 0. 004g/ml、KCl 0. 004g/ml、Na2HPO4. 12H20 0. 058g/ml,調(diào) pH 值至 7· 4，力口 Tween-20至終濃度為1%，121°C高壓30分鐘。使用時(shí)，用去離子水稀釋20倍即可。6.樣品稀釋液使用PBS溶解配制，各組分終濃度至甘露醇0. 05g/ml、蔗糖0. 05g/ ml, NaCl 0. 00875g/ml、BSA 0. 01g/ml、Proclin-300 0.1%。7.酶標(biāo)二抗稀釋液使用PBS溶解配制，各組分終濃度至酶穩(wěn)定劑0.001g/ml、 Proclin-300 0. 1 %、Tween-20 0. 05%, BSA 0.01g/ml。8.羊抗犬IgG酶標(biāo)抗體羊抗犬IgG酶標(biāo)抗體購自Sigma公司，或用常規(guī)方法制備 HRP標(biāo)記的羊抗犬IgG。使用酶標(biāo)二抗稀釋液進(jìn)行稀釋，定量分裝，使用時(shí)進(jìn)行1 100稀釋。9.底物A液、底物B液購自KPL公司，底物液A液含有檸檬酸鈉、雙氧水，底物B 液為TMB，將A、B液直接分裝，使用時(shí)A、B液等體積混合后立即使用。10.終止液將濃硫酸使用去離子水稀釋至終濃度2mol/L。11.試劑盒的組裝及保存將上述制備好的酶標(biāo)板、陽性血清、陰性血清、標(biāo)準(zhǔn)血清、洗滌液、樣品稀釋液、酶標(biāo)二抗稀釋液、羊抗犬IgG酶標(biāo)抗體、底物A液、底物B液、終止液按試劑盒配制定量分裝。真空包裝鋁箔塑料袋定做。說明說一份。試劑盒保存在2 8V。實(shí)施例2血清中狂犬病中和抗體效價(jià)的測(cè)定程序用0.5ml樣品稀釋液復(fù)溶陽性血清和陰性血清，并10倍系列稀釋至1 100。用0. 5ml樣品稀釋液復(fù)溶標(biāo)準(zhǔn)血清，按照下述稀釋方法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，先將標(biāo)準(zhǔn)血清稀釋至0.4IU/ml，再進(jìn)行1 10稀釋至0.04IU/ml，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行2倍稀釋，即得到下述梯度標(biāo)準(zhǔn)血清0. 04IU/ml,0. 02IU/ml,0. 01IU/ml,0. 005IU/ml,0. 0025IU/ml, 0. 00125IU/ml，0. 000625IU/ml。將待檢血清10倍系列稀釋至1 100。將稀釋好的不同梯度效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)血清、陰性血清、陽性血清和待檢樣品加入板孔內(nèi)，IOOul/孔，2孔重復(fù)。37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30分鐘。用去離子水將濃縮洗滌液進(jìn)行 20倍稀釋備用，棄掉板孔內(nèi)液體，加洗滌液200ul/孔，洗滌5次。用酶標(biāo)抗體稀釋液按照1 100稀釋酶標(biāo)抗體，IOOul/孔。37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60分鐘。棄掉孔內(nèi)液體，加洗滌液200ul/孔，洗滌5次。底物A、B液等體積混合，每孔加IOOul。37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20min。加入終止液50ul。在酶標(biāo)儀上450nm測(cè)量OD值。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)血清的平均OD值，然后計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)血清(從4IU至0. 0625IU/ml，不考慮其 1 100稀釋)的平均OD值的對(duì)數(shù)值(In)。以標(biāo)準(zhǔn)血清滴度的對(duì)數(shù)值(In)為X軸，以標(biāo)準(zhǔn)血清平均OD值的對(duì)數(shù)值(In)為Y軸，匯出標(biāo)準(zhǔn)血清的標(biāo)準(zhǔn)曲線。建立標(biāo)準(zhǔn)血清滴度對(duì)數(shù)(In)和標(biāo)準(zhǔn)血清平均OD值對(duì)數(shù)(In)的線性回歸曲線，數(shù)學(xué)公式為ln (狂犬病毒抗體的滴度(EU/ml)) = aX In (OD)+b，則狂犬病毒抗體滴度(EU/ml) = e(aXln(0D)+b)血清中抗體滴度彡0. 06EU/ml，說明血清中狂犬病毒IgG抗體檢測(cè)為陽性，血清中抗體滴度< 0. 06EU/ml，說明血清中狂犬病毒抗體檢測(cè)為陰性。血清抗體滴度彡0. 6EU/ml，說明血清抗體達(dá)到保護(hù)水平。。實(shí)施例3本發(fā)明試劑盒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定及特性評(píng)價(jià)1.靈敏度將OIE狂犬病陽性血清(6. 7IU/ml)用樣品稀釋液稀釋至0. 4IU/ml， 再進(jìn)行10倍稀釋至0. 04IU/ml后，再2倍倍比稀釋，取0. 04,0. 02,0. 01,0. 005,0. 0025、 0. 00125,0. 000625,0. 0003125,0. 00015625IU/ml效價(jià)的血清，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，每個(gè)稀
釋度重復(fù)2孔，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行，得到高于陰性對(duì)照血清OD值對(duì)應(yīng)的血清抗體滴度即為試劑盒的狂犬病毒抗體最低檢出限量，結(jié)果見表1。表1倍比稀釋后OIE狂犬病陽性血清試劑盒檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)動(dòng)物狂犬病病毒中和抗體的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，其特征在于，酶標(biāo)板包被原為狂犬病毒經(jīng)線性蔗糖梯度區(qū)帶離心純化得到的狂犬病全病毒顆粒。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的線性蔗糖梯度區(qū)帶離心純化狂犬病病毒的方法，其步驟為1)微載體上Vero細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，按0.03 0. 3感染復(fù)數(shù)的比例接種狂犬病毒，在溫度 32 36°C、轉(zhuǎn)速 20 80r/min、pH 7. 20 7. 80、溶氧 20% 70%、添加 0. 05% 5% 牛血清白蛋白的199培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)4 6日后開始收獲上清液至細(xì)胞完全脫落為止；2)將病毒收獲液用0.1 0. 45 μ m濾芯過濾澄清后，用100KD 300KD膜包超濾濃縮；3)向狂犬病毒濃縮液中加入β-丙內(nèi)酯，在2 8°C條件下滅活，37°C水解；4)狂犬病毒滅活液用線性蔗糖梯度進(jìn)行區(qū)帶離心，4°C，20000 50000r/min；離心 1 5小時(shí)，離心后泵入60%蔗糖溶液，收集狂犬病毒富集峰，得到的狂犬病毒離心液用截留分子量為100KD 300KD膜包超濾濃縮，PBS溶液透析脫糖，得到狂犬病毒純化液。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括酶標(biāo)二抗、樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)血清、陽性血清、陰性血清、顯色劑、終止液和洗滌液。
4.如權(quán)利要求1 3任一所述的試劑盒，其特征在于，所用的狂犬病病毒來自狂犬病毒固定毒CTN-I株。
5.如權(quán)利要求1 3任一所述的試劑盒，其特征在于，所述酶標(biāo)二抗為酶標(biāo)羊抗犬 IgG ；所述酶標(biāo)羊抗犬抗體的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶。
6.如權(quán)利要求1 3任一所述的試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)血清，其制備包括將狂犬病病毒滅活抗原三針免疫程序接種比格犬，當(dāng)血清效價(jià)高于6. 0IU/ml時(shí)，1周后采血分離血清，56°C滅活30min獲得；所述陽性血清為狂犬病病毒滅活抗原免疫犬后獲得的血清，測(cè)定血清狂犬病毒抗體水平；所述陰性血清為未感染狂犬病病毒且未免疫過狂犬病疫苗的健康犬血清。
7.如權(quán)利要求1 3任一所述的試劑盒，其特征在于，當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)， 所述顯色劑由底物A液和底物B液組成，底物液A液含有檸檬酸鈉、雙氧水，底物B液為TMB ； 所述終止液為2mol/L硫酸溶液；所述洗滌液為含有1 %的Tween-20的PBS緩沖液。
8.一種制備權(quán)利要求1 7任一所述試劑盒的方法，其特征在于制備方法包括1)狂犬病病毒滅活后，用線性蔗糖梯度區(qū)帶離心純化，純化的狂犬病全病毒顆粒與包被緩沖液配成合適濃度，包被酶標(biāo)板；2)辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗犬IgG，獲得酶標(biāo)二抗；3)狂犬病抗體檢測(cè)陰陽性對(duì)照血清的制備，按常規(guī)方法制備狂犬病抗體檢測(cè)陰性對(duì)照血清、狂犬病抗體檢測(cè)陽性對(duì)照血清和狂犬病抗體標(biāo)準(zhǔn)血清；4)配制試劑，按配方配制封閉液、洗滌液、樣品稀釋液、酶標(biāo)二抗稀釋液、底物顯色液、 終止液；5)試劑盒組裝，將純化的狂犬病全病毒顆粒包被的酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗、狂犬病抗體檢測(cè)陰陽性對(duì)照血清、標(biāo)準(zhǔn)血清及封閉液、洗滌液、樣品稀釋液、酶標(biāo)二抗稀釋液、底物顯色液、 終止液按試劑盒配制定量分裝。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中步驟1)所述的純化狂犬病全病毒的包被濃度為`2 μ g/ml0
10.權(quán)利要求1 7任一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測(cè)動(dòng)物狂犬病病毒中和抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種動(dòng)物狂犬病中和抗體間接ELISA檢測(cè)試劑盒，該試劑盒的酶標(biāo)板包被了用線性蔗糖梯度區(qū)帶離心法純化的狂犬病病毒全病毒顆粒，此包被抗原純度高，可檢測(cè)包括狂犬病病毒糖蛋白、核蛋白等蛋白產(chǎn)生的抗體，研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的試劑盒特異性達(dá)到100％，靈敏度最低檢出量為0.0625IU/ml，變異系數(shù)CV(重復(fù)性)為2.74％，穩(wěn)定性良好。該試劑盒操作簡(jiǎn)單，成本低，適合推廣使用。
文檔編號(hào)G01N33/531GK102520169SQ201110388138
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月29日
發(fā)明者岳雷, 張振山, 李淑芬, 王海霞, 陳靜 申請(qǐng)人:唐山怡安生物工程有限公司