專利名稱：檢測藤黃綠菌素和吩嗪類化合物的反相液相色譜方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種反相液相色譜檢測方法，具體涉及的是一種檢測藤黃綠菌素和吩嗪類化合物的反相液相色譜方法。
背景技術(shù)：
藤黃綠菌素(Pit)與吩嗪類化合物是假單胞菌的兩類主要代謝產(chǎn)物。Plt是一種芳香族聚酮類抗生素，能抑制細(xì)菌、真菌，特別是抑制卵菌屬真菌，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的新型生物農(nóng)藥。吩嗪類化合物是對含有吩嗪結(jié)構(gòu)的一類物質(zhì)的總稱，包括吩嗪-1-羧酸(phenazine-l-carboxilic acid, PCA)、2_ 羥基-PCA(2_hydroxy-PCA，2-0H-PCA)、1-羥基吩嗪(1-hydroxyphenazine, I-OH-PHZ),2-羥基吩嗪(2-hydroxyphenazine, 2-0H-PHZ) 和綠膿菌素(pyocyanin，ΡΥ0)等，研究表明，吩嗪類化合物幾乎均具有抑制病原菌的生物活性，并根部定植及根際競爭存活方面具有重要的作用。反相液相色譜是液相色譜中具有高柱效和分離力的檢測技術(shù)，采用以表面非極性載體為固定相，以極性大于固定相極性的溶劑為流動相的一種液相色譜分離模式。反相色譜固定相大多是硅膠表面鍵合疏水基團(tuán)，利用樣品中各組分和疏水基團(tuán)之間疏水作用的差異而對混合物進(jìn)行分離。目前常用的抗生素檢測技術(shù)主要為高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法。例如，高斌等(Analytical Letters，2010，43，12 1823-1833)提供的方法，其中 Plt、PCA 和 1-0H-PHZ 的最低檢測限僅為0. 107、0. 021、11. 56μ g/mL，靈敏度較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測藤黃綠菌素和吩嗪類化合物的反相液相色譜方法，采用常規(guī)的反相液相色譜方法進(jìn)行檢測，該方法中流動相為5 40mM的乙酸銨-乙腈體系，洗脫條件為體積分?jǐn)?shù)為5% 100%乙腈的梯度洗脫。優(yōu)選地，所述流動相為10 30mM的乙酸銨-乙腈體系，洗脫條件為用體積分?jǐn)?shù)為 8% 80%乙腈進(jìn)行梯度洗脫。優(yōu)選地，所述流動相為15 25mM的乙酸銨-乙腈體系，洗脫條件為用體積分?jǐn)?shù)為 15% 70%乙腈進(jìn)行梯度洗脫。優(yōu)選地，所述流動相的流速為0. 5 1. OmL/min。優(yōu)選地，所述方法中采用的檢測波長為190 400nm。優(yōu)選地，所述反相液相色譜方法采用的色譜柱內(nèi)徑為4. 6mm、長度為25cm，柱溫為 23 28 。本發(fā)明還涉及一種用于檢測藤黃綠菌素和吩嗪類化合物的反相液相色譜用試劑盒，包括乙酸銨、乙腈和超純水。本發(fā)明還涉及一種用于檢測藤黃綠菌素和吩嗪類化合物的反相液相色譜系統(tǒng)，包括高效液相色譜儀及其工作站，色譜柱，乙酸銨-乙腈流動相體系。
本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明的方法能夠分別或者同時檢測藤黃綠菌素、吩嗪類化合物，如PCA，ΡΥ0,1-OH-PHZ, 2-0H-PCA, 2-0H-PHZ等等；本發(fā)明的方法靈敏度較高，最低檢測限為0. 006 0. 1 μ g/mL,最低定量限為0. 02 0. 3 μ g/mL ；當(dāng)待檢物質(zhì)在2 100 μ g/mL之間時，本發(fā)明的方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)大于0.9900。同時，本發(fā)明的方法也可用來分離藤黃綠菌素、吩嗪類化合物。
具體實(shí)施例方式就以下針對的本技術(shù)的特定實(shí)施方式或者特定用途的說明而言，這些說明僅為示范性質(zhì)的，并且僅僅提供示例實(shí)施方式的簡要描述。因此，本發(fā)明并不局限于以下所述的具體實(shí)施方式
，而是相反，本發(fā)明包括落入附帶的權(quán)利要求書的真實(shí)范圍內(nèi)的全部替代方案、 改進(jìn)方案以及等同方案。以下實(shí)施中使用的反相液相色譜分析設(shè)備為1260 hfinity高效液相色譜儀 (Agilent Technologies Group)及其工作站，內(nèi)徑為4. 6mm的C18色譜柱，長度為25cm (Kromasil)。常規(guī)的反相液相色譜方法相關(guān)步驟可參見《于世林，苗鳳琴.分析化學(xué)[M]. 北京化學(xué)工業(yè)出版社，2006. 346 384》。實(shí)施例1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 1、原材料
甲醇(HPLC級)；三蒸水(電導(dǎo)率為0.082 μ S/cm)。2、分析樣品的制備
(1)分別配制2、5、10、25、50、75、100μ g/mL的濃度梯度的PCA (吩嗪羧酸)，PYO (綠膿菌素)，1-0H-PHZ (1-羥基吩嗪)與Plt (藤黃綠菌素)的甲醇溶液；
(2)將步驟(1)中配制的溶液分別通過46μ m濾膜進(jìn)行過濾；
(3)洗脫條件
色譜柱內(nèi)徑4. 6mm,長度25cm ； 檢測波長256nm ；
流動相5 25mM乙酸銨-乙腈體系，其中采用由體積分?jǐn)?shù)為8% 80%乙腈的梯度洗
脫；
流速0. 5 1. OmL/min ；
(4)外標(biāo)法測量PCA，ΡΥ0,1-0H-PHZ與Plt的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為 y=255. 97x-453. 84，
y=132. 32x + 271， y=230. 52x+743. 49， y=12. 932x -38. 304，
其中y代表峰面積，x代表標(biāo)樣濃度，線性相關(guān)系數(shù)分別為0.9993，0.9991，0.9914， 0.9969。實(shí)施例2、發(fā)酵液中PCA、PY0與Plt的測定
挑取假單胞菌M18 (該菌株已經(jīng)在文獻(xiàn)《王沂，嚴(yán)安，黃顯清.假單胞菌M-ISqscR突變株的構(gòu)建及其對抗生素合成的調(diào)控[J].微生物學(xué)報，2007，47 O) 254-259》中公開)，單菌落接種于含50 mL KB液體培養(yǎng)基(蛋白胨，21. 56 g L—1;甘油，17. 70 g L—1 ;Κ2ΗΡ04，0. 514 gL—1 ；無水MgSO4,0.732 g L—1)的250mL三角瓶內(nèi)，在37°C，166 rpm下培養(yǎng)10小時，取發(fā)酵液180 μ L，添加IM HCl JfpH值調(diào)整至2.0。將處理好的發(fā)酵液與三倍體積的乙酸乙酯混勻，振蕩萃取，12000Xg離心5min， 取出500 μ L有機(jī)相，真空干燥，最后溶解于500 μ L甲醇中，混勻。進(jìn)行反相液相色譜分析，條件如下檢測波長256nm，5 25mM乙酸銨-乙腈體系， 洗脫梯度為體積分?jǐn)?shù)為8% 80%乙腈，流速為0. 5 1. OmL/min, C18色譜柱內(nèi)徑4. 6mm, 長度25cm，柱溫為23 ；
測得10小時假單胞菌M18發(fā)酵液中 PCA 的濃度為 31.93yg/mL, Pit 的濃度為 84. 68 μ g/mL, PYO 的濃度為 31. 29 μ g/mL。本實(shí)施例中乙酸銨-乙腈體系的配置溶劑能夠用來組成反相液相色譜用試劑盒， 用于檢測藤黃綠菌素和吩嗪類化合物，該試劑盒的組分包括乙酸銨、乙腈和超純水。同時，高效液相色譜儀及其工作站，色譜柱，乙酸銨-乙腈流動相體系也可組成反相液相色譜系統(tǒng)，用于檢測藤黃綠菌素和吩嗪類化合物。實(shí)施例3、發(fā)酵液中PCA、2-0H_PCA與2-0H-PHZ的檢測
挑取綠針假單胞菌GP72 (該菌株已經(jīng)在文獻(xiàn)《Huang L, Chen M Μ, Wang W, et al. Enhanced production of 2-hydroxyphenazine in Pseudomonas chlororaphis GP72 [J]· Appl Microbiol Biotechnol, 2011，89 (1) : 169-177》中公開)單菌落接種于含 50 mL KB (同實(shí)施例1)液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶內(nèi)，在^°C，166 rpm下培養(yǎng)36小時，取發(fā)酵液 180 μ L，添加 IM HCl JfpH 值調(diào)整至 2. 0。將處理好的發(fā)酵液與三倍體積的乙酸乙酯混勻，振蕩萃取，12000Xg離心5min， 取出500 μ L有機(jī)相，真空干燥，最后溶解于500 μ L甲醇中，混勻。進(jìn)行反相液相色譜分析，條件如下檢測波長256nm，5 25mM乙酸銨-乙腈體系， 洗脫梯度為體積分?jǐn)?shù)為8% 80%的乙腈，流速為0. 5 1. OmL/min, C18色譜柱內(nèi)徑4. 6mm, 長度25cm，柱溫為23 ；
檢測出36小時綠針假單胞菌GP72發(fā)酵液中存在PCA，2-0H-PCA與2-0H-PHZ。以與其結(jié)構(gòu)較為相似的1-0H-PHZ的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算2_0H_PCA與2_0Η_ΡΗΖ的產(chǎn)量。 測得Mh綠針假單胞菌GP72發(fā)酵液中
PCA 的濃度為 16. 18 μ g/mL, 2-0H-PCA 的近似濃度為 27. 42 μ g/mL, 2-0H-PHZ 的近似濃度為 15. 14 μ g/mL。實(shí)施例4、發(fā)酵液中PCA與1-0H-PHZ的測定
挑取銅綠假單胞菌PAOl (該菌株已經(jīng)在文獻(xiàn)《周金鳳，葛宜和，劉婷，等.銅綠假單胞菌Arr基因突變對生物膜和綠膿菌素合成的影響[J].微生物通報，2010，37(6):888-893》 中公開)單菌落接種于含50 mL KB液體培養(yǎng)基(同實(shí)施例1)的250 mL三角瓶內(nèi)，在37°C， 166 rpm下培養(yǎng)48小時，取發(fā)酵液180 μ L，添加IM HCl JfpH值調(diào)整至2. 0。
將處理好的發(fā)酵液與三倍體積的乙酸乙酯混勻，振蕩萃取，12000Xg離心5min，取出 500 μ L有機(jī)相，真空干燥，最后溶解于500 μ L甲醇中，混勻。
進(jìn)行反相液相色譜分析，條件如下檢測波長256nm，5 25mM乙酸銨-乙腈體系， 洗脫梯度為體積分?jǐn)?shù)為8% 80%乙腈，流速為0. 5 1. OmL/min, C18色譜柱內(nèi)徑4. 6mm, 長度25cm，柱溫為23 ；
測得48小時銅綠假單胞菌PAOl發(fā)酵液中 PCA 的濃度為 12. 58 μ g/mL, 1- OH-PHZ 的濃度為 7. 37 μ g/mL。綜上所述，本發(fā)明的方法能夠分別或者同時檢測藤黃綠菌素、吩嗪類化合物，如 PCA, PY0，1-0H-PHZ，2-0H-PCA，2-0H-PHZ等等；本發(fā)明的方法靈敏度較高，最低檢測限為 0. 006 0. 1 μ g/mL,最低定量限為0. 02 0. 3 μ g/mL ；當(dāng)待檢物質(zhì)在2 100 μ g/mL之間時，本發(fā)明的方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)大于0. 9900。同時，本發(fā)明的方法也可用來分離藤黃綠菌素、吩嗪類化合物。
權(quán)利要求
1.一種檢測藤黃綠菌素和吩嗪類化合物的反相液相色譜方法，采用常規(guī)的反相液相色譜方法進(jìn)行檢測，其特征在于，所述方法中流動相為5 40mM的乙酸銨-乙腈體系，洗脫條件為用體積分?jǐn)?shù)為5% 100%乙腈進(jìn)行梯度洗脫。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測藤黃綠菌素和吩嗪類化合物的反相液相色譜方法，其特征在于，所述流動相為10 30mM的乙酸銨-乙腈體系，洗脫條件為用體積分?jǐn)?shù)為8% 80% 乙腈進(jìn)行梯度洗脫。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測藤黃綠菌素和吩嗪類化合物的反相液相色譜方法，其特征在于，所述流動相為15 25mM的乙酸銨-乙腈體系，洗脫條件為用體積分?jǐn)?shù)為15% 70% 乙腈進(jìn)行梯度洗脫。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測藤黃綠菌素和吩嗪類化合物的反相液相色譜方法，其特征在于，所述流動相的流速為0. 5 1. OmL/min。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測藤黃綠菌素和吩嗪類化合物的反相液相色譜方法，其特征在于，所述方法中采用的檢測波長為190 400nm。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測藤黃綠菌素和吩嗪類化合物的反相液相色譜方法，其特征在于，所述反相液相色譜方法采用的色譜柱內(nèi)徑為4. 6mm、長度為25cm，柱溫為23 ^°C。
7.一種用于檢測藤黃綠菌素和吩嗪類化合物的反相液相色譜用試劑盒，其特征在于， 包括乙酸銨、乙腈和超純水。
8.一種用于檢測藤黃綠菌素和吩嗪類化合物的反相液相色譜系統(tǒng)，其特征在于，包括 高效液相色譜儀及其工作站，色譜柱，乙酸銨-乙腈流動相體系。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測藤黃綠菌素和吩嗪類化合物的反相液相色譜方法，采用常規(guī)的反相液相色譜方法進(jìn)行檢測，所述方法中流動相為5～40mM的乙酸銨-乙腈體系，洗脫條件為用體積分?jǐn)?shù)為5%～100%乙腈進(jìn)行梯度洗脫。本發(fā)明的方法能夠分別或者同時檢測藤黃綠菌素、吩嗪類化合物；本發(fā)明的方法靈敏度較高，最低檢測限為0.006～0.1μg/mL，最低定量限為0.02～0.3μg/mL；當(dāng)待檢物質(zhì)在2～100μg/mL之間時，本發(fā)明的方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)大于0.9900。同時，本發(fā)明的方法也可用來分離藤黃綠菌素、吩嗪類化合物。
文檔編號G01N30/89GK102411037SQ20111021063
公開日2012年4月11日 申請日期2011年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月26日
發(fā)明者劉建華, 張雪洪, 王威, 胡洪波, 董卉 申請人:上海交通大學(xué)