專利名稱：一種采用安培免疫傳感器進行夾心免疫反應(yīng)的二抗探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，特別是涉及分子識別的探針，該探針適于采用安培免疫傳感器進行夾心免疫反應(yīng)測量抗原的濃度。
背景技術(shù)：
1990年Henry等提出了免疫傳感器的概念，免疫傳感器利用抗原、抗體作為分子識別原件，把抗原-抗體特異性反應(yīng)過程中產(chǎn)生的信號通過換能器轉(zhuǎn)變成電信號，從而對被測物進行定量分析。與傳統(tǒng)的檢測技術(shù)相比較，具有高靈敏度、高特異性、操作簡便、分析速度快、價格低廉等優(yōu)勢，且易于實現(xiàn)自動化操作，在臨床診斷、醫(yī)療保健、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等領(lǐng)域顯示出良好的應(yīng)用前景。然而已報道的電化學安培傳感器在使用中也存在以下不足①多采用“一步法”即采用抗原抗體結(jié)合后形成的免疫復合物導致電極表面電流下降，根據(jù)下降電流來進行定量，這樣就不可避免的難以克服非特異性吸附的影響；②當電極表面的抗原/抗體發(fā)生免疫結(jié)合后生成物很難除去，電極無法更新，使用多為一次性；③盡管安培免疫傳感器有諸多優(yōu)點，但是面對背景非常復雜的具體檢測對象(如血清樣品)，往往需通過一定的樣品提純處理后再進行檢測，影響了其易用性。所以，上述問題在一定程度上限制了免疫傳感器的優(yōu)勢。近年來，基于夾心免疫的納米修飾電化學傳感器由于其卓越的靈敏度引起人們的廣泛關(guān)注。由于夾心免疫傳感器與“一步法”傳感器相比具有較高的敏感性和特異性， 制備此類傳感器最關(guān)鍵的就在于對二抗的富集。已經(jīng)有報道采用多種納米材料對二抗進行富集，如碳納米球、二氧化硅、納米Pt、二氧化錳、石墨烯(GS)、碳納米管(CNTs)、納米金 (nano-Au)、量子點等。然而這些富集過程繁瑣，需要離心才能分離探針和未結(jié)合抗體；有研究使用磁性納米材料(如四氧化三鐵、金磁納米顆粒)等富集抗體，避免了繁瑣的離心過程，但是其合成的磁性材料容易團聚，穩(wěn)定性差，且單個納米顆粒對抗體的富集效果有限。 袁若等報道了通過抗壞血酸的還原作用形成一種“鏈狀金線”，由多個納米金原子形成串珠狀，由此可大量富集抗體，但是此“鏈狀金線”的合成過程至少需要5天時間，且無磁性，依然需要通過離心來進行分離，探針的分離過程繁瑣。因此研發(fā)一種新的具有分離簡便、富集率高的抗體富集材料并應(yīng)用到電化學免疫傳感器中具有重要的意義。ZrO2作為一種Lewis強酸，通過與蛋白分子上的羧酸和DNA上的磷酸等基團 (Lewis強堿)特異性取向結(jié)合，可被直接用來固定酶及抗體。由于抗體和酶包被在極細 (1 2 μ m)且表面積很大的納米^O2上，標記量顯著增加且能較長時間地保持生物活性。 但是單個納米顆粒對二抗抗體的富集效果有限。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種二抗探針，該探針適于采用安培免疫傳感器進行夾心免疫反應(yīng)測量抗原的濃度，且具有富集抗體效果優(yōu)異和檢測限低的優(yōu)點。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
—種采用安培免疫傳感器進行夾心免疫反應(yīng)的二抗探針，該探針由小牛胸腺DNA 分子鏈和附著在小牛胸腺DNA分子鏈上的納米球構(gòu)成，其中所述的納米球的表面為酶標記的抗體蛋白，內(nèi)部為磁性納米顆粒，該顆粒為在四氧化三鐵納米顆粒表面沉積一層無定形氧化鋯形成。本發(fā)明所述的二抗探針，其中所述的磁性納米顆粒為公知材料，具體制備方法可參照公開號為CN 101302361A的發(fā)明專利申請所述方案進行。本發(fā)明所述的二抗探針的制備方法由以下步驟組成1)將磁性納米顆粒加入pH 7. 0磷酸鹽緩沖液中，再加入重量為磁性納米粒子0. 1 倍的辣根過氧化物酶標記抗體，4°C下反應(yīng)6h，分離得到負載抗體的納米微球；2)將所得到的納米微球加入pH 7.0磷酸鹽緩沖液中，再加入重量為所述納米微球0. 1倍的過氧化物酶和重量為所述納米微球1. 0倍的牛血清白蛋白，4°C下反應(yīng)6h，分離得到納米球；3)將納米球加入pH 7.0磷酸鹽緩沖液中，再加入重量為納米球1.2倍的小牛胸腺 DNA,室溫下反應(yīng)6h，分離得到二抗探針。本發(fā)明所述的探針中，首先制備了具有核殼結(jié)構(gòu)的!^e3O4(核)/&02(殼)磁性納米粒子，該磁性納米粒子表面含有&02可以和抗體結(jié)合，對抗體進行富集。該探針具有以下優(yōu)點1)磁性材料的使用，使探針具有磁性，在外加磁場的作用下即可實現(xiàn)分離，省去了探針合成過程中繁瑣的離心和洗滌過程；幻該探針呈“串珠狀”，每個探針分子上具有10個以上磁珠，增加探針表面標記酶抗體濃度，因此提高免疫傳感器的敏感性。3) 二氧化鋯具有很好的生物相容性，能夠長時間保持抗體的活性，使抗體不易失活，使本探針可以一次制備而長期保存。本發(fā)明所述的二抗探針可以用來檢測抗原濃度，具體檢測由以下步驟組成(a)定量標準曲線的制備(1)配制一系列不同濃度的抗原標準品溶液；(2)按相同的體積分別將每一濃度的抗原標準品溶液加入到安培免疫傳感器的反應(yīng)腔中，先37°C溫育30min，洗滌；再將所制備的二抗探針滴加在安培免疫傳感器的反應(yīng)腔中，37°C溫育30min，洗滌；然后，反應(yīng)腔中加入含有濃度為5mmol/L過氧化尿溶液和lmmol/ L鄰苯二酚的0. lmol/L磷酸鹽緩沖溶液，反應(yīng);3min后，在電化學工作站上用循環(huán)伏安法 (CV)或示差脈沖伏安法(DPV)記錄還原峰電流；(3)將步驟⑵所得到的抗原標準品溶液的濃度及其對應(yīng)的還原峰電流的一組數(shù)據(jù)，以還原峰電流對抗原標準品溶液濃度進行線性回歸便得到，還原峰電流與抗原標準品溶液濃度對應(yīng)關(guān)系的直線方程，即標準曲線；(b)樣品的檢測將待測樣品加入到安培免疫傳感器的反應(yīng)腔中，以步驟(a)同樣的方法和反應(yīng)條件采用循環(huán)伏安法(CV)記錄還原峰電流，然后，將檢測樣品得到的還原峰電流值代入步驟 (a)所得到的直線方程中即可算出待測樣品中抗原的濃度。上述檢測抗原濃度的方法中所使用的安培免疫傳感器可根據(jù)待測抗原按公知的方法自行制備。本發(fā)明所述的二抗探針適用于采用安培免疫傳感器進行夾心免疫反應(yīng)測量抗原
4的濃度，由于本發(fā)明所述的二抗探針具有一維“串珠狀”結(jié)構(gòu)，極大的提高探針表面二抗的負載量，由于電化學免疫傳感器的線性范圍和靈敏度與二抗富集效果正相關(guān)，因此本發(fā)明所述檢測抗原濃度的方法具有線性范圍寬，檢測限低的優(yōu)點。


圖1是二抗探針的檢測原理及二抗探針合成過程示意圖。右側(cè)方框內(nèi)是二抗探針的合成過程示意圖。圖2是合成的探針利用外加磁場進行分離結(jié)果圖。圖3是下述實施例1所合成的二抗探針的透射電鏡圖；圖4是不同濃度AFP檢測時的電化學CV響應(yīng)圖，其內(nèi)插圖為測定標準曲線。圖5是不同濃度HIV pM檢測時的電化學DPV響應(yīng)圖，其內(nèi)插圖為測定標準曲線。
具體實施例方式實施例11、二抗探針的制備和表征(1)磁性納米顆粒的制備磁性納米顆粒的制備具體制備方法可參照公開號為CN 101302361A的發(fā)明專利
申請°磁性納米顆粒的表征采用X射線熒光光譜(XRF)對!^e3O4AiO2進行表征，出現(xiàn)了 Zr-K0 (17. 8keV)、Zr-Ka (15. 8keV)、Zr-L0 (2. Ike)、Zr-La (2. OkeV)峰和 Fe-K0 (7. IKeV)、 Fe-Ka (6. 4keV)峰，說明該磁性微粒中存在rLx和！^元素。(2)負載抗體的納米微球的制備和表征負載抗體的納米微球的制備將IOmg磁性納米粒子分散在5mL pH 7. 0磷酸鹽緩沖液中，加入Img辣根過氧化物標記的甲胎蛋白二抗(HRP-anti-AFP)，攪拌他后，外加磁性條件下磁性分離，得到負載抗體的納米微球。(3)納米球的制備將IOmg負載抗體的納米微球分散在5mL的pH 7. 0磷酸鹽緩沖液中，依次加入5mg 辣根過氧化物酶、IOmg牛血清白蛋白(BSA)，4°C攪拌他，利用外加磁場分離磁性納米顆粒， 洗滌，得到納米球。(4) 二抗探針的制備將IOmg納米球分散在5mL的pH 7. 0磷酸鹽緩沖液中，加入12mg小牛胸腺DNA，室溫下攪拌他，磁性分離即獲得二抗探針。二抗探針的表征采用透射電鏡對探針制備過程進行了表征(圖幻。由圖3可見二抗探針具有一維“珠鏈狀”線性結(jié)構(gòu)。采用X射線熒光光譜(測定元素范圍為9F 5^)對二抗探針進行了表征，顯示了 Zr-ka 峰 2. lkeV、Fe-ka 峰 6. 4keV、P_ka 峰 1. 13keV 和 S_k α 峰 2. 3keV，由于 DNA 含有大量磷酸基團，故而P峰的出現(xiàn)進一步說明了磁性納米粒子表面包覆了 DNA。測定磁性納米顆粒與DNA作用后的紫外光譜，發(fā)現(xiàn)DNA特征吸收峰由520nm紅移至524nm，說明DNA與磁性納米顆粒子發(fā)生了相互作用，使吸收峰發(fā)生紅移。由圖2可見，在0. 3mTde外磁場作用下二抗探針磁性探針具有良好的超順磁性。2.安培免疫傳感器的制備對商品化的絲網(wǎng)印刷電極進行修飾(a)石墨烯/殼聚糖(GS/CS)在絲網(wǎng)印刷電極表面修飾成膜在5mL離心管中加入2mL pH5. 0的0. 2%的殼聚糖(CS)醋酸溶液和Img的GS，混合得到懸濁液；將5mL懸濁液滴在絲網(wǎng)印刷電極中的工作電極表面，室溫下自然干燥，然后用pH7. 0磷酸鹽緩沖溶液洗滌除去結(jié)合不牢固納米顆粒。(b)采用電流時間曲線法在絲網(wǎng)印刷電極的工作電極表面直接電鍍金將20 μ L 的HAuCl4滴加在工作電極表面，施加-0. 2V恒電位30S。電鍍后用PBS充分洗滌。(c)在絲網(wǎng)印刷電極的反應(yīng)腔中加入10 μ L AFP單克隆一抗后，絲網(wǎng)印刷電極放入4°C冰箱低溫溫育12小時后用PBS充分洗滌未結(jié)合和結(jié)合不牢固抗體。(d)用3mg/mL牛血清白蛋白(BSA)封閉未結(jié)合電極表面未結(jié)合活性位點，得到安培免疫傳感器。3.抗原濃度的檢測對抗原的檢測過程是利用固定好一抗的傳感器依次與樣品和制備的二抗探針進行溫育，若樣品中含有所待測抗原，則制備的二抗探針通過免疫復合物的形式固定在電極表面，加入底物后可以催化底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生電信號。其檢測原理如附圖1.(1)定量標準曲線制備(a)將 AFP 抗原溶液標準品稀釋成 0. 01ng/ml，0. 05ng/ml,0. lng/ml，lng/ml，5ng/ ml, 10ng/ml,50ng/ml, lOOng/ml, 150ng/ml，200ng/ml，在安培免疫傳感器的反應(yīng)腔中分別加入10 μ L不同濃度的AFP抗原溶液標準品，并在37°C下溫育30min。反應(yīng)完后用PBS小心洗去未反應(yīng)抗原。(b)將步驟1合成的二抗探針配成lmg/ml懸液，在安培免疫傳感器的反應(yīng)腔中滴加IOmL 二抗探針懸液，37°C溫育30min，PBS小心洗滌；(c)在安培免疫傳感器的反應(yīng)腔中加入含有濃度為5mmol/L過氧化尿溶液和 lmmol/L鄰苯二酚的0. lmol/L磷酸鹽緩沖溶液反應(yīng)^iin ；在電化學工作站上，用循環(huán)伏安法(CV)記錄還原峰電流I (掃描范圍從-0. 3V至-0. 8V)。(d)步驟(C)所得到還原峰電流與對應(yīng)抗原標準品溶液的濃度一組數(shù)據(jù)，采用平均斜率法以還原峰電流對抗原標準品溶液濃度進行線性回歸分析，便得到還原峰電流與抗原標準品溶液濃度對應(yīng)關(guān)系的直線方程，即標準曲線。CV還原峰電流和AFP抗原濃度數(shù)值見圖4內(nèi)插圖。線性方程為IogI = 0. 661og[CAFP]-5. 15。將待測樣品加入到安培免疫傳感器的反應(yīng)腔中，以步驟(1)同樣的方法和反應(yīng)條件采用循環(huán)伏安法(CV)記錄還原峰電流，然后，將檢測樣品得到的還原峰電流值代入步驟 (a)所得到的直線方程中即可算出待測樣品中抗原的濃度。采用10個空白樣品進行檢測， 計算平均值X和標準差s，以作為檢測限。在本例中，對AFP的檢測范圍為0. 01 200ng/mL，檢測限為4pg/mL。實施例2 (對比實驗1)一、實驗材料1.抗原和抗體:AFP抗原標準品、甲胎蛋白單克隆一抗(anti-AFP)、辣根過氧化物酶標記的甲胎蛋白多克隆抗體(HRP-anti-AFP)和AFP ELISA試劑盒均購置鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司。
申請°
2.安培免疫傳感器按實施例1所述方法制得。
3.二抗探針
3. 1、樣品按實施例1所述方法制得的二抗探針。 3. 2、對照品對照品1
(1)磁性納米顆粒的制備
磁性納米顆粒的制備具體制備方法可參照公開號為CN 101302361A的發(fā)明專利
(2)負載抗體的納米微球的制備和表征
負載抗體的納米微球的制備將IOmg磁性納米粒子分散在5mL pH 7. 0磷酸鹽緩沖液中，加入Img辣根過氧化物標記的甲胎蛋白二抗(HRP-anti-AFP)，攪拌他后，外加磁場分離未結(jié)合的抗體，外加磁性條件下磁性分離，得到負載抗體的納米微球。
(3)磁性探針的制備 將IOmg負載抗體的納米微球分散在5mL的pH 7. 0磷酸鹽緩沖液中，依次加入5mg 辣根過氧化物酶、IOmg牛血清白蛋白(BSA)，4°C攪拌他，利用外加磁場分離磁性納米顆粒， 洗滌，得到磁性探針用HRP-anti-AFP-ZMPs探針表示。對照品2 參照下述文獻報告的方法制備獲得Tang J，Su B, Tang D，et al.Conductive carbon nanoparticles-based electrochemical immunosensor with enhanced sensitivity for[alpha]-fetoprotein using irregular-shaped gold nanoparticles-labeled enzyme-linked antibodies as signal improvement[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2010, 25 (12) :2657-26620 所得二抗探針用代號 HRP-anti-AFP-GNGs 表示。對照品3 :參照下述文獻報告的方法制備獲得Zhuo Y，Yi W J, Lian W B， et al. Ultrasensitive electrochemical strategy for NT-proBNP detection with gold nanochains and horseradish peroxidase complex amplification[J]. Biosens Bioelectron. 2011,26(5) :2188_2193。所得二抗探針用代號 AuNCs-HRP-Ab2 表示。對照品4:以AFP ELISA試劑盒(購自鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司)中的辣根過氧化物酶標記的AFP多克隆抗作為對照品4。以HRP-anti-AFP表示。二、實驗方法1.實驗分為5組，每組中實驗除加入的二抗探針不同外，其余操作相同。2.實驗過程2.1定量標準曲線制備(a)將 AFP 抗原溶液標準品稀釋成 0. 01ng/ml，0. 05ng/ml,0. lng/ml，lng/ml，5ng/ ml, 10ng/ml,50ng/ml, lOOng/ml, 150ng/ml，200ng/ml，將制備的安培免疫傳感器分為 5 組， 每組含10個傳感器，安培免疫傳感器的反應(yīng)腔中分別加入10 μ L不同濃度的AFP抗原溶液標準品，并在37°C下溫育30min。反應(yīng)完后用PBS小心洗去未反應(yīng)抗原。(b)將本例中制備的樣品和對照品配合成的配成lmg/ml懸液，組1中安培免疫傳感器的反應(yīng)腔中滴加10 μ L樣品，組2 組5傳感器的反應(yīng)腔中分別滴加加對照品1 4 探針懸液10 μ L，37°C溫育30min。(c)在安培免疫傳感器的反應(yīng)腔中加入含有濃度為5mmol/L過氧化尿溶液和 lmmol/L鄰苯二酚的0. lmol/L磷酸鹽緩沖溶液反應(yīng)^iin ；在電化學工作站上，用循環(huán)伏安法(CV)記錄還原峰電流I (掃描范圍從-0. 3V至-0. 8V)。(d)步驟(C)所得到還原峰電流與對應(yīng)抗原標準品溶液的濃度一組數(shù)據(jù)，采用平均斜率法以還原峰電流對抗原標準品溶液濃度進行線性回歸分析，便得到還原峰電流與抗原標準品溶液濃度對應(yīng)關(guān)系的直線方程，即標準曲線；采用10個空白標本進行檢測，計算平均值X和標準差S，以I+3S作為檢測限。表1是不同二抗探針檢測AFP抗原效果的比較，由表1可以得出，本申請所制備的二抗探針進行電化學檢測時，與其他方法制備的二抗探針相比具有線性范圍寬、靈敏度高的優(yōu)點。表1不同二抗探針檢測AFP抗原的效果比較
權(quán)利要求
1.一種采用安培免疫傳感器進行夾心免疫反應(yīng)的二抗探針，該探針由小牛胸腺DNA分子鏈和附著在小牛胸腺DNA分子鏈上的納米球構(gòu)成，其中所述的納米球的表面為酶標記的抗體蛋白，內(nèi)部為磁性納米顆粒，該顆粒為在四氧化三鐵納米顆粒表面沉積一層無定形氧化鋯形成。
2.權(quán)利要求1所述的二抗探針的制備方法，該方法由以下步驟組成1)將磁性納米顆粒加入PH7. 0磷酸鹽緩沖液中，再加入重量為磁性納米粒子0. 1倍的辣根過氧化物酶標記抗體，4°C下反應(yīng)6h，分離得到負載抗體的納米微球；2)將所得到的納米微球加入pH7.0磷酸鹽緩沖液中，再加入重量為所述納米微球0. 1 倍的過氧化物酶和重量為所述納米微球1.0倍的牛血清白蛋白，4°C下反應(yīng)6h，分離得到納米球；3)將納米球加入pH7.0磷酸鹽緩沖液中，再加入重量為納米球1.2倍的小牛胸腺 DNA,室溫下反應(yīng)6h，分離得到二抗探針。
3.一種采用權(quán)利要求1所述的二抗探針測量抗原濃度的方法，該方法由以下步驟組成(a)定量標準曲線的制備(1)配制一系列不同濃度的抗原標準品溶液；(2)按相同的體積分別將每一濃度的抗原標準品溶液加入到安培免疫傳感器的反應(yīng)腔中，先37°C溫育30min ；再將所制備的二抗探針滴加在安培免疫傳感器的工作電極表面， 37°C溫育30min ；然后，反應(yīng)腔中加入含有濃度為5mmol/L過氧化尿溶液和lmmol/L鄰苯二酚的0. lmol/L磷酸鹽緩沖溶液，反應(yīng);3min后，在電化學工作站上用循環(huán)伏安法(CV)或者示差脈沖伏安法(DPV)記錄還原峰電流；(3)將步驟( 所得到的抗原標準品溶液的濃度及其對應(yīng)的還原峰電流的一組數(shù)據(jù)， 以還原峰電流對抗原標準品溶液濃度進行線性回歸便得到，還原峰電流與抗原標準品溶液濃度對應(yīng)關(guān)系的直線方程，即標準曲線；(b)樣品的檢測將待測樣品加入到安培免疫傳感器的反應(yīng)腔中，以步驟(a)同樣的方法和反應(yīng)條件采用循環(huán)伏安法(CV)記錄還原峰電流，然后，將檢測樣品得到的還原峰電流值代入步驟(a) 所得到的直線方程中即可算出待測樣品中抗原的濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物監(jiān)測領(lǐng)域，具體涉及一種采用安培免疫傳感器進行夾心免疫反應(yīng)的二抗探針，其中所述的二抗探針由小牛胸腺DNA分子鏈和附著在小牛胸腺DNA分子鏈上的納米球構(gòu)成，其中所述的納米球的表面為酶標記的抗體蛋白，內(nèi)部為磁性納米顆粒，該顆粒為在四氧化三鐵納米顆粒表面沉積一層無定形氧化鋯形成。本發(fā)明所述的二抗探針適于采用安培免疫傳感器進行夾心免疫反應(yīng)測量抗原的濃度，且具有檢測線性范圍寬，檢測極限低的優(yōu)點。
文檔編號G01N33/53GK102253194SQ20111017413
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月25日
發(fā)明者巫遠招, 干寧, 李博, 王前, 賈立永, 鄭磊 申請人:南方醫(yī)科大學