專利名稱：一種葉酸的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測食品、飼料和維生素產(chǎn)品中的葉酸含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，屬于食品和飼料成分的檢測分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
葉酸(Folic acid)是一種水溶性B族維生素，又稱維生素氏或維生素M，為機體細(xì)胞生長和繁殖所必需的物質(zhì)。在體內(nèi)葉酸以四氫葉酸的形式起作用，四氫葉酸在體內(nèi)參與嘌呤核酸和嘧啶核苷酸的合成和轉(zhuǎn)化。在制造核酸上扮演重要的角色。人體在利用糖分和氨基酸時的必要物質(zhì)。葉酸缺乏時，脫氧胸苷酸，嘌呤核苷酸的形式及氨基酸的互變受阻， 細(xì)胞內(nèi)DNA合成減少，細(xì)胞的分裂成熟發(fā)生障礙，引起巨幼紅細(xì)胞性貧血。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，葉酸對孕婦尤其重要。如在懷孕頭3個月內(nèi)缺乏葉酸，可導(dǎo)致胎兒神經(jīng)管發(fā)育缺陷，從而增加裂腦兒，無腦兒的發(fā)生率。葉酸廣泛存在于各種動植物食品中，但天然食品所含葉酸大部分含量不高，以多谷氨酸葉酸形式存在，吸收率不高，且葉酸在人體內(nèi)停留時間不長，人們通常在食品中強化吸收率高的單谷氨酸鹽形式葉酸。美國1998年1月1日起已強制在某些谷物食品中強化葉酸，F(xiàn)DA規(guī)定每1千克谷物食品強化1.4 mg葉酸。我國已在嬰幼兒、孕婦、老年食品中強化葉酸。為了避免維生素缺乏，如今，生產(chǎn)商通過混合或噴霧的方式向食品中加入適量的維生素，然而要使其均勻地分布于食品中并非易事。此外，在產(chǎn)品的標(biāo)簽上必須標(biāo)注保質(zhì)期內(nèi)的維生素含量。考慮到在食品生產(chǎn)儲存中部分維生素的流失，德國化工企業(yè)協(xié)會建議，超量添加的維生素量不應(yīng)超過標(biāo)簽注明含量的50%。因此，生產(chǎn)商和監(jiān)督部門都有必要對產(chǎn)品中維生素的含量進行控制。葉酸作為B族維生素其分析方法很多，主要有化學(xué)法、微生物法、薄層掃描法、熒光分析法和氣相色譜法等。這些方法比較繁雜、費時、重現(xiàn)性差、檢出極限低，氣相色譜法易對維生素造成破壞。近年來用高效液相色譜法(HPLC)測定B族維生素的報道較多。HPLC 法雖具有快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的特點，但所用儀器昂貴笨重，且需要大量的有機溶劑，樣品前處理復(fù)雜，費時，費力，難以用于現(xiàn)場操作。酶聯(lián)免疫檢測法(ELISA)具有快速，準(zhǔn)確，簡易，不需要專門人員操作等優(yōu)點，因此研究開發(fā)一種葉酸的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒具有直接的經(jīng)濟效益和社會效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種葉酸的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。本發(fā)明所述葉酸的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒中試劑的組成包括
(1)包被有葉酸包被抗原的酶標(biāo)板；
(2)葉酸的多克隆抗體；
(3)酶標(biāo)二抗即辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔的抗體；(4)葉酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液；
(5)濃縮磷酸鹽緩沖液；
(6)濃縮洗滌液；
(7)底物顯色液A；
(8)底物顯色液B；
(9)終止液。其中所述的葉酸包被抗原是將葉酸半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)得到的，葉酸包被抗原的濃度為lyg/ml。所述偶聯(lián)物的載體蛋白為分子量范圍是6. 7KDa 6. SKDa的牛血清蛋白或卵清蛋白。所述葉酸的多克隆抗體是由葉酸與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原免疫動物(新西蘭大白兔)制備得到；所述葉酸多克隆抗體的工作濃度為1:10000 1:20000，優(yōu)選 1:20000。所述的酶標(biāo)二抗是采用過碘酸鈉將辣根過氧化物酶與羊抗兔抗體進行偶聯(lián)得到的；所述酶標(biāo)二抗的工作濃度優(yōu)選為1:2000。所述葉酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為3ng/ml、6 ng/ml、12. 5 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ ml、100 ng/ml0所述濃縮洗滌液為含有體積分?jǐn)?shù)0. 05%吐溫-20的pH7. 4,0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液。所述底物顯色液A為TMB溶液，底物顯色液B為pH5. 0 6. 0的過氧化脲溶液，使用時顯色液A與顯色液B等體積混合；終止液為2mol/L的硫酸溶液。本發(fā)明提供的試劑盒可用于檢測食品、飼料和維生素產(chǎn)品中的葉酸含量。本發(fā)明的原理是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體反應(yīng)的高度特異性與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來，根據(jù)酶作用底物后顯色，以顏色變化判斷試驗結(jié)果，可經(jīng)酶標(biāo)儀作定量分析。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果
本發(fā)明的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒具有靈敏度高、簡便快速、準(zhǔn)確的特點，可在食品、飼料和維生素產(chǎn)品中檢測葉酸含量發(fā)揮重要作用。


圖1為本發(fā)明葉酸抗體的抑制率曲線。圖2為本發(fā)明葉酸的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施例方式實施例1、免疫原、包被抗原的合成及抗體的制備 1、免疫原的合成
將葉酸與牛血清蛋白(BSA)采用EDC法進行偶聯(lián)得到免疫原。具體包括以下步驟 A、分別稱取葉酸 22. 7mg (51. 5 μ mol)，水溶性碳二亞胺(EDC) 98. 7mg (514. 7ymol), N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 29. 6mg (257.4ymol)依次溶于5mLDMF中，避光、室溫磁力攪拌反應(yīng)24小時；
B、將IOOmg(1. 5ymol)BSA (分子量范圍為6. 7KDa 6. 8 KDa)溶于IOmL磷酸鹽緩沖液(PBS) (0. 01M, ρΗ7· 4)中；
C、將“步驟A的產(chǎn)物”緩慢加入到“步驟B的產(chǎn)物”中，室溫磁力攪拌反應(yīng)3小時；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到半透膜中，在0 4°C用PBS緩沖液(0. 01M, pH7. 4)透析3天， 期間每4 6小時換一次透析液；隨后用蒸餾水透析3天，期間每4 6小時換一次透析液；透析完畢，用冷凍干燥機凍干，得到黃色絮狀固體即為免疫原(葉酸與牛血清蛋白的偶聯(lián)物)，-20°C保存，備用。2、包被抗原的合成
將葉酸與卵清蛋白(OVA)采用混合酸酐法進行偶聯(lián)得到包被抗原。具體步驟如下 A、稱取49mg (111. Ιμπιο )葉酸溶于5mL無水DMF(無水N-N 二甲基甲酰胺)中振蕩溶解，加入^μ L(122. 2μ mol)三正丁胺，冰浴反應(yīng)30分鐘，然后逐滴加入20. 2 μ L (155. 5ymol)氯甲酸異丁酯，室溫反應(yīng)1小時。B、稱取 IOOmg OVA (卵清蛋白)(2. 22 μ mol)溶于 PBS 中。C、將“步驟A的產(chǎn)物”逐滴加入到“步驟B的產(chǎn)物”中，室溫攪拌反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，先后用PBS緩沖液(0. 01M，pH7. 4)和蒸餾水透析6天，期間更換透析液；透析完畢， 用冷凍干燥機凍干，得到黃色絮狀固體即為包被抗原(葉酸與卵清蛋白的偶聯(lián)物)，_20°C保存，備用。3、葉酸多克隆抗體的制備
采用雄性新西蘭大白兔作為免疫動物，以葉酸與牛血清蛋白的偶聯(lián)物為免疫原。首次免疫，將弗氏完全佐劑與免疫原按1 1混合成油包水的乳濁液，每只兔注射0. 5mg免疫原， 進行背部皮下多點注射(5 10點)；20天后第一次加強免疫，用弗氏不完全佐劑與等體積免疫原混合，進行第二次免疫，劑量減半，方法同首免；以后每隔兩周加強免疫一次，第五次不加佐劑只用生理鹽水進行末次免疫，注射七天后進行心臟采血。血液在4°C靜置過夜，次日IOOOOrpm離心15分鐘得抗血清，即為葉酸多克隆抗體。
實施例2、ELISA檢測方法的建立 1、抗體與包被抗原濃度的優(yōu)選(方陣法)
縱向用包被抗原按 8.0 μ g/mL,4. 0 μ g/mU2. 0 μ g/mLU. 0 μ g/mL、0. 5 μ g/mL、 0. 25 μ g/mL的系列濃度包被酶標(biāo)板，100 μ L/孔，37 °C放置2小時，用洗滌液300 μ L/孔洗板三次；再用封閉溶液250 μ L/孔封閉，(T4°C放置過夜，洗板三次；橫向加入100 μ L/ 孔一系列稀釋的抗體(1:2500至1:80000)，37 °C放置30分鐘，洗板三次；加入100 μ L/孔 1:2000的酶標(biāo)二抗即辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔抗體，37 °C放置30分鐘，洗板三次；加入 100 μ L/孔的底物顯色液，測定吸光度值。以吸光度值隨包被抗原的濃度有明顯梯度變化的包被抗原濃度和抗體稀釋度為最佳濃度進行特異性測定。2、抗體靈敏度的測定
根據(jù)上述對抗體及包被抗原濃度的優(yōu)選實驗，選擇并確定抗體濃度為1:20000，包被抗原濃度為1 μ g/mL進行抗體的靈敏度的測定
A、包被用0. 05M pH9. 6的碳酸鹽緩沖液將葉酸的包被抗原配成1 μ g/mL的溶液，每個酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中加100 μ L，37°C放置2小時，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，300 μ L/孔，每次3鐘，拍干。(此步簡稱洗滌，下同)。B、封閉用封閉溶液封閉上述已包被的酶標(biāo)板，250 4 17孔，0、1放置過夜，然后洗滌。C、加樣加稀釋葉酸抗體(1 20000 ) 50 μ L/孔與不用濃度的葉酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液 50 μ L/孔于上述已封閉的反應(yīng)孔中，37°C放置30分鐘，然后洗滌。D、加酶標(biāo)二抗于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(1:2000) 100 μ L/孔，30 分鐘，洗滌。Ε、顯色于各反應(yīng)孔中加入臨時配置的顯色液100 μ L/孔(顯色液Α50 μ L+顯色液 B50yL)，37°C放置 15 分鐘。F、終止于各反應(yīng)孔中加入終止液100 μ L/孔，立即用酶標(biāo)儀檢測。G、計算過程檢測結(jié)果以抑制率計算，％抑制率=%Β/ Β0，Β是加入藥物作為競爭者的吸光值，BO是不加競爭者的吸光值。計算50%抑制率時藥物的濃度即為該抗體的靈敏度。
實施例3、檢測葉酸的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的組裝 1、檢測葉酸的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的組成
A、包被有包被抗原(葉酸與卵清蛋白的偶聯(lián)物)的固相載體(酶標(biāo)板)；
B、葉酸抗體工作液(體積比濃度為1:20000)；
C、葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，濃度分別為:3ng/ml、6ng/ml、12.5 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、 100 ng/ml ；
D、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體工作液(工作濃度為1:2000)；
E、濃縮磷酸鹽緩沖液是每升含NaCl 80g、KH2PO4 2. 0g、Na2HPO4 · 12 29. 0g、KCl 2. Og的水溶液。F、濃縮洗滌液是上述濃縮磷酸鹽緩沖液加入體積比濃度為0. 05%的吐溫 20(Tween20)；
G、底物顯色液顯色液A為TMB溶液；顯色液B為pH5.0 6. 0的過氧化脲溶液；
H、終止液濃度為2mol/L的硫酸溶液。2、酶標(biāo)板的制備
用碳酸鹽緩沖液(0. 05M, pH9. 6)將包被抗原稀釋成1 μ g/mL,酶標(biāo)板的每孔加入100 UL, 37 °C孵育2 h，傾去包被液，每孔加入300 μ L洗滌液洗滌3次，拍干；然后每孔加入封閉液250 uL, 4 °C過夜，傾去孔內(nèi)液體，洗滌液洗滌3次，拍干，用錫箔紙真空密封4°C保存。
實施例4、檢測葉酸的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的應(yīng)用
I、試劑的配制
A、樣品稀釋液將試劑盒中提供的濃縮磷酸鹽緩沖液用蒸餾水稀釋10倍后使用。B、洗滌溶液將試劑盒中提供的濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋10倍后使用。C、底物顯色液顯色液A與顯色液B等體積混合后使用。2、樣品前處理A、牛奶將牛奶樣品在4°C，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，脫除脂肪層；將脫脂的牛奶用磷酸鹽緩沖液稀釋成1 10，得到待測樣品。B、奶粉稱取IOg奶粉加入90ml蒸餾水溶解，然后在4°C，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15 分鐘，脫除脂肪層；將脫脂的牛奶用磷酸鹽緩沖液稀釋成1:10，得到待測樣品。C、維生素功能飲料將樣品在4°C，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，取上清，用磷酸鹽緩沖液稀釋成1 100，得到待測樣品。D、維生素片或膠囊稱取Ig樣品用IOOml蒸餾水溶解，然后在4°C，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，取上清，用磷酸鹽緩沖液稀釋成1:10，得到待測樣品。3、檢測步驟
A、加樣向酶標(biāo)板微孔中加入葉酸系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液50μ L，然后加入葉酸抗體溶液50 μ L，室溫(25°C )恒溫孵育1 h ；
B、洗滌傾出孔中液體，每孔加入洗滌溶液300μ L，洗滌3次，拍干；
C、加酶標(biāo)羊抗兔抗體溶液每孔加入酶標(biāo)羊抗兔抗體溶液100μ L，室溫恒溫孵育1
h；
D、洗滌傾出孔中液體，每孔加入洗滌溶液300μ L，洗滌3次，拍干； Ε、加顯色液每孔加入顯色液100 μ L，室溫(25°C)恒溫孵育15分鐘； F、終止每孔加入終止液100 μ L ；
F、檢測用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度值。4、結(jié)果判斷
標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制橫坐標(biāo)為葉酸濃度的對數(shù)值，縱坐標(biāo)為各標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光值與標(biāo)準(zhǔn)液為Ong/ml的吸光值的比值，即抑制率，每一個樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。%抑制率=%標(biāo)準(zhǔn)品吸光值(或樣品)/O標(biāo)準(zhǔn)品吸光值。
實施例5、試劑盒精密度和準(zhǔn)確度試驗
取20，50，100 ppb的葉酸標(biāo)樣，添加到牛奶樣品中，來檢測葉酸的回收率。每個濃度的批間變異系數(shù)都以不同的5天的5個重復(fù)數(shù)據(jù)進行計算，批內(nèi)變異系數(shù)以同一天的5次
重復(fù)數(shù)據(jù)計算。根據(jù)制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程進行回收率的定量計算。結(jié)果見下表。
添加濃
度檢測次檢測結(jié)回收率變異系檢測次檢測結(jié)回收率變異系數(shù)η果(！(%)數(shù)(％)數(shù)η果(ppti)m數(shù)⑶20521.183105.911,1522.055110.39.050550.188100,410.9550.562101.19.3100589.1098Ρ.17,7594.04094.011.8
從上述測定結(jié)果看，變異系數(shù)低于11. 8%，回收率在89. 1 110. 3%之間。表明本試劑盒有很好的重復(fù)性和準(zhǔn)確度。
權(quán)利要求
1.一種葉酸的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒中試劑的組成包括(1)包被有葉酸包被抗原的酶標(biāo)板；(2)葉酸的多克隆抗體；(3)酶標(biāo)二抗即辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔的抗體；(4)葉酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(5)濃縮磷酸鹽緩沖液；(6)濃縮洗滌液；(7)底物顯色液A；(8)底物顯色液B；(9)終止液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的葉酸包被抗原是將葉酸半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)得到的；所述的葉酸包被抗原的濃度為1 μ g/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述葉酸的多克隆抗體是由葉酸與分子量范圍是6. 7KDa — 6. SKDa的牛血清蛋白偶聯(lián)制成的偶聯(lián)物作為免疫原免疫新西蘭大白兔制備得到；其中所述葉酸多克隆抗體的工作濃度為1:10000 1:20000。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)二抗是采用過碘酸鈉將辣根過氧化物酶與羊抗兔抗體進行偶聯(lián)得到的；所述酶標(biāo)二抗的工作濃度為1:2000。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的葉酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度依次為 3ng/ml、6 ng/mK12. 5 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述濃縮磷酸鹽緩沖液是每升含NaCl 80g、KH2PO4 2. 0g、Na2HPO4 ‘ UH2O2 29. 0g, KCl 2. Og 的水溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液是含有體積分?jǐn)?shù)0.05% 吐溫-20的pH7. 4,0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的底物顯色液A為TMB溶液；所述的底物顯色液B為pH5. 0 6. 0的過氧化脲溶液，使用時顯色液A與顯色液B等體積混合后使用；所述的終止液為2mol/L的硫酸溶液。
9.權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒在檢測食品、飼料和維生素產(chǎn)品中葉酸含量的應(yīng)用。
全文摘要
一種葉酸的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，屬于酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)領(lǐng)域。所述試劑盒中試劑的組成包括包被有葉酸包被抗原(由葉酸與卵清蛋白偶聯(lián)制成)的酶標(biāo)板；葉酸多克隆抗體；酶標(biāo)二抗即辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體；葉酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液；濃縮磷酸鹽緩沖液；濃縮洗滌液；底物顯色液A；底物顯色液B；終止液。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒利用多克隆抗體進行酶聯(lián)免疫檢測，IC50=15.5ng/ml。在牛奶樣品中最低檢測限為11.9ng/ml，批間批內(nèi)變異系數(shù)<11.8%，回收率為89.1～110.3%。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒具有簡單、快捷、準(zhǔn)確、靈敏度高的特點，可用于快速定量檢測食品、飼料和維生素產(chǎn)品中所含的葉酸。
文檔編號G01N33/82GK102175878SQ20111000410
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月11日
發(fā)明者孟萌, 張元陽, 張?zhí)? 徐靜, 薛虎寅, 郗日沫 申請人:南開大學(xué)