專利名稱：前列腺癌的代謝特征的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥標(biāo)志物。特別地，本發(fā)明提供在癌癥(例如，前列腺癌或乳腺癌)中差別存在的代謝物和代謝物組。
背景技術(shù)：
前列腺癌(PCA)已經(jīng)成為男性癌癥致死的頂級(jí)殺手，僅次于肺癌，65歲以上男性摧患前列腺癌的概率高達(dá) 1/9 (Abate-Shen 和 Shen, Genes Devl4 :2410 [2000] ;Rui jter 等Endocr Rev, 20 :22[1999])。美國癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)，2001年大約有184，500的美國男性會(huì)診斷出前列腺癌，大約39，200患者會(huì)因前列腺癌死亡。通常使用直腸指診和/或前列腺特異性抗原(PSA)篩查來診斷前列腺癌。升高的血清PSA水平能夠表明存在PCA。所以將PSA作為前列腺癌標(biāo)志物使用，因?yàn)槠渲挥汕傲邢偌?xì)胞分泌。健康的前列腺會(huì)產(chǎn)生穩(wěn)定的PSA量-通常低于每毫升4毫微克，或“4”或更低的PSA讀數(shù)-而癌癥細(xì)胞則產(chǎn)生與癌癥嚴(yán)重性相關(guān)的升高的PSA量。PSA水平達(dá)到4至10之間時(shí)，醫(yī)生會(huì)認(rèn)為患者疑似罹患前列腺癌，而PSA量高于50則可能表明腫瘤已經(jīng)擴(kuò)散到身體其他部位。當(dāng)PSA或直腸檢測表明癌癥有很大可能存在時(shí)，使用經(jīng)直腸超聲(TRUS)繪制前列腺圖像并顯示任何可疑之處。使用前列腺多部位活檢來確定是否存在前列腺癌。治療選擇取決于癌癥的發(fā)展階段。對(duì)有10年或更短存活期的男性患者，其具有低格里森指數(shù)并且腫瘤未擴(kuò)散到前列腺之外，通常采用觀察治療(不治療)。對(duì)較高侵入性癌癥的治療選擇包括外科治療，諸如根治性前列腺切除術(shù)(RP)，這種治療將完全切除前列腺(采用或不采用神經(jīng)保留技術(shù))，和放射治療，通過使用從體外直接向前列腺照射劑量的外束或通過植入前列腺內(nèi)的低劑量放射性粒子來局部殺滅癌細(xì)胞。也采用抗雄激素治療，單獨(dú)使用或與外科治療或放射治療聯(lián)合使用。激素治療使用黃體生成素釋放激素(LH-RH)類似物，其阻礙腦垂體產(chǎn)生激素刺激睪酮的產(chǎn)生?；颊弑仨毥K生注射LH-RH類似物。外科治療和激素治療通常對(duì)局部PCA有效，但對(duì)進(jìn)展惡化的疾病沒有實(shí)質(zhì)性作用。雄激素切除術(shù)是治療進(jìn)展惡化的PCA最常用的療法，其導(dǎo)致依賴雄激素的惡性癌細(xì)胞的大量細(xì)胞凋亡和暫時(shí)的腫瘤退化。然而在大多數(shù)實(shí)例中，腫瘤會(huì)報(bào)復(fù)性重現(xiàn)，而且能夠不依賴雄激素的信號(hào)獨(dú)立增殖。前列腺特異性抗原(PSA)篩查已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了 PCA的較早期診斷并極大地降低了 PCA相關(guān)的死亡數(shù)量。然而，還未有前瞻性隨機(jī)報(bào)告研究結(jié)果顯示PSA篩查對(duì)癌癥特異性死亡率的影響(Etzioni 等 J. Natl. Cancer Inst. ,91 :1033 [1999] ；Maattanen 等 Br. J. Cancer79 :1210 [1999] ;Schroder 等 J. Natl. Cancer Inst. ,90 1817 [1998]) 血清 PSA 檢驗(yàn)的主要局限是特別在PSA檢測的中間范圍(4至10ng/ml)缺乏對(duì)前列腺癌敏感度和特異性。在諸如前列腺良性增生(BPH)和前列腺炎這樣的非惡性病狀的患者體內(nèi)，經(jīng)常檢測到升高的血清PSA水平，而且無法得知檢測到的癌癥的侵入性。與增加的血清PSA檢測一致，實(shí)施前列腺穿刺活檢數(shù)量也顯著增加了(Jacobsen等JAMA 274 :1445[1995])。這導(dǎo)致大量模糊的前列腺穿刺活檢結(jié)果產(chǎn)生(Epstein和Potter J. Urol.，166 :402 [2001])。因此，需要研究出其他的血清和組織的生物標(biāo)志物來完善PSA篩查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及癌癥標(biāo)志物。特別地，本發(fā)明提供在癌癥(例如，前列腺癌或乳腺癌)中差別存在的代謝物和代謝物組。·例如，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供診斷前列腺癌或乳腺癌的方法，包括檢測受試者的樣本(例如,組織(例如,活檢)樣本、血液樣本、血清樣本或尿液樣本)中的一種或多種(例如，2種或多種、3種或多種、5種或多種、10種或多種等。以多重或組形式一起測量)的癌癥特異性代謝物(例如，哌可酸或脂肪酸(包括但不限于肉豆蘧酸、棕櫚酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸、油酸)或聚胺(例如、腐胺、牙精胺、精胺))的存在或缺失；和基于癌癥特異性代謝物的存在或缺失診斷前列腺癌或乳腺癌。在某些實(shí)施方案中，癌癥特異性代謝物在癌癥樣本中存在，而在非癌癥樣本中缺失。在某些實(shí)施方案中，癌癥特異性代謝物在癌癥樣本中缺失，而在非癌癥樣本中存在。在某些實(shí)施方案中，檢測一種或多種其他的癌癥標(biāo)志物(例如，以組或多重形式)和癌癥特異性代謝物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種診斷前列腺癌的方法，包括檢測受試者的尿液樣本中的肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的水平；和當(dāng)肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的水平相對(duì)于非癌癥受試者升高時(shí)診斷前列腺癌。在某些實(shí)施方案中，該方法還包含檢測一種或多種代謝物水平的步驟，該代謝物選自例如，乙酰氨基葡糖、犬尿胺酸、尿嘧啶、高半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、牙精胺、精胺、2-氨基己二酸、亮氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、馬來酸鹽、組氨酸、瓜氨酸、腺苷和肌苷。本發(fā)明進(jìn)一步提供鑒定前列腺癌或乳腺癌的方法，包括檢測診斷出癌癥的受試者樣本(例如，組織樣本、血液樣本、血清樣本、尿液樣本、尿沉渣樣本)中的升高水平的癌癥特異性代謝物(例如，哌可酸或脂肪酸(包括但不限于肉豆蘧酸、棕櫚酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸、油酸)或聚胺(例如，腐胺、牙精胺、精胺))的存在或缺失；并基于癌癥特異性代謝物的存在或缺失鑒定前列腺癌或乳腺癌。在某些實(shí)施方案中，在樣本中升高水平的脂肪酸(例如，到肉豆蘧酸、棕櫚酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸、油酸)的存在表明受試者體內(nèi)存在侵入性前列腺癌。在某些實(shí)施方案中，在樣本中升高水平的哌可酸的存在表明受試者體內(nèi)存在侵入性前列腺癌。在某些實(shí)施方案中，在前列腺組織樣本(例如，前列腺活檢樣本)中降低水平的一種或多種聚胺(例如，腐胺、牙精胺、精胺)的存在顯示存在前列腺癌。在某些實(shí)施方案中，尿液樣本中升高水平的一種或多種聚胺(例如，腐胺、牙精胺、精胺)的存在表明存在前列腺癌。在指定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種診斷乳腺癌的方法，包括檢測受試者的樣本中一種或多種癌癥特異性代謝物，諸如哌可酸、絲氨酸、聚胺和脂肪酸的存在或缺失；基于癌癥特異性代謝物的存在或缺失診斷乳腺癌。在某些實(shí)施方案中，聚胺是諸如腐胺、牙精胺和精胺的聚胺。在某些實(shí)施方案中，脂肪酸類型諸如肉豆蘧酸、棕櫚酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸和油酸。在某些實(shí)施方案中，樣本類型是諸如組織樣本、血液樣本、血清樣本和尿液樣本。在某些實(shí)施方案中，組織樣本是活檢樣本。在某些實(shí)施方案中，一種或多種癌癥特異性代謝物在癌癥樣本中存在，而在非癌癥樣本中缺失。在某些實(shí)施方案中，一種或多種癌癥特異性代謝物在癌癥樣本中缺失，但在非癌癥樣本中存在。在某些實(shí)施方案中，該方法包括同時(shí)檢測一種以上的所述癌癥特異性代謝物的存在或缺失。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種鑒定乳腺癌的方法，包括在受試者的樣本中檢測一種或多種癌癥特異性代謝物諸如哌可酸、絲氨酸、聚胺和脂肪酸的存在或缺失；和基于癌癥特異性代謝物的存在或缺失鑒定乳腺癌。在某些實(shí)施方案中，聚胺是諸如腐胺、牙精胺和精胺的聚胺。在某些實(shí)施方案中，脂肪酸是諸如肉豆蘧酸、棕櫚酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸和油酸的脂肪酸。在某些實(shí)施方案中，樣本類型諸如組織樣本、血液樣本、血清樣本和尿液樣本。在某些實(shí)施方案中，組織樣本是活檢樣本。在某些實(shí)施方案中，樣本中一種或多種升高水平的癌癥特異性代謝物的存在表明受試者體內(nèi)存在乳腺癌。在某些實(shí)施方案 中，樣本中一種或多種降低水平的癌癥特異性代謝物的存在表明受試者體內(nèi)存在乳腺癌。在某些實(shí)施方案中，方法包括同時(shí)檢測一種以上的癌癥特異性代謝物的存在或缺失。在指定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種診斷前列腺癌的方法，包括檢測受試者的尿液樣本中一種或多種癌癥特異性代謝物諸如哌可酸、絲氨酸、聚胺和脂肪酸的存在或缺失；和基于在尿液樣本中的癌癥特異性代謝物的存在或缺失診斷前列腺癌。在某些實(shí)施方案中，聚胺是諸如腐胺、牙精胺和精胺的聚胺。在某些實(shí)施方案中，脂肪酸是諸如肉豆蘧酸、棕櫚酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸和油酸的脂肪酸。在某些實(shí)施方案中，尿液樣本是尿沉渣樣本。在某些實(shí)施方案中，一種或多種癌癥特異性代謝物在癌癥樣本中存在，而在非癌癥樣本中缺失。在某些實(shí)施方案中，一種或多種癌癥特異性代謝物在癌癥樣本中缺失，而在非癌癥樣本中存在。在某些實(shí)施方案中，該方法包括同時(shí)檢測一種以上癌癥特異性代謝物的存在或缺失。在指定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種診斷前列腺癌的方法，包括檢測前列腺組織樣本中一種或多種降低水平的聚胺；和基于在前列腺組織樣本中一種或多種降低水平的聚胺診斷前列腺癌。在某些實(shí)施方案中，前列腺組織樣本是活檢樣本。在某些實(shí)施方案中，聚胺類型諸如腐胺、牙精胺和精胺。在指定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種診斷前列腺癌的方法，包括檢測尿液樣本中一種或多種升高水平的聚胺；和基于在尿液樣本中一種或多種降低水平的聚胺診斷前列腺癌。在某些實(shí)施方案中，尿液樣本是尿沉渣樣本。在某些實(shí)施方案中，聚胺類型諸如腐胺、牙精胺和精胺。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于檢測代謝物的水平的組合物、試劑盒和系統(tǒng)。在某些實(shí)施方案中，試劑盒和系統(tǒng)包含必要組件，其足以或有效檢測出代謝物的水平。本發(fā)明的其他實(shí)施方案在以下說明和實(shí)驗(yàn)部分詳細(xì)描述。


圖I示出了谷氨酸的水平在局部癌癥和轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織樣本中比在良性前列腺組織中更高。圖2示出了甘氨酸的水平在局部癌癥和轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織樣本中比在良性前列腺組織中更高。圖3示出了半胱氨酸的水平在局部癌癥和轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織樣本中比在良性前列腺組織中更高。圖4示出了胸腺嘧啶的水平在轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織樣本中比在良性前列腺組織中更高圖5示出了哌可酸的水平在轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織樣本中比在良性前列腺組織中
更高。 圖6示出了尿嘧啶的水平在局部癌癥和轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織樣本中比在良性前列腺組織中更高。圖7示出了絲氨酸的水平在良性、局部癌癥和轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織樣本中沒有變化。圖8示出了哌可酸的水平在侵入性前列腺癌細(xì)胞系(VCAP、Dul45和2RVV1)中比非侵入性前列腺細(xì)胞系(RWPE)中更高。圖9示出了侵入性前列腺癌細(xì)胞系(LnCaP、Dul45、PC3、2RVVl)比非侵入性前列腺細(xì)胞系(RWPE)具有更高水平的尿嘧啶。圖10示出了前列腺活檢陽性患者的尿沉渣樣本顯示比來自前列腺活檢陰性患者的尿沉渣樣本具有更高的肌氨酸水平。圖11示出了前列腺活檢陽性患者的尿沉渣樣本顯示比來自前列腺活檢陰性患者的尿沉渣樣本具有更高的谷氨酸水平。圖12示出了前列腺活檢陽性患者的尿沉渣樣本顯示比來自前列腺活檢陰性患者的尿沉渣樣本具有更高的甘氨酸水平。圖13示出了前列腺活檢陽性患者的尿沉渣樣本顯示比來自前列腺活檢陰性患者的尿沉渣樣本具有更高的半胱氨酸水平。圖14示出了前列腺活檢陽性患者的尿沉渣樣本顯示與來自前列腺活檢陰性患者的尿沉渣樣本具有同等的甲硫氨酸水平。圖15示出了表明在前列腺活檢陽性的尿沉渣樣本中的谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的水平比前列腺活檢陰性對(duì)照更高的箱線圖。圖16示出了轉(zhuǎn)移性前列腺組織樣本比良性和局部前列腺癌樣本具有更低的精胺水平。圖17示出了轉(zhuǎn)移性前列腺組織樣本比良性和局部前列腺癌樣本具有更低的腐胺水平。圖18示出了轉(zhuǎn)移性前列腺組織樣本比良性和局部前列腺癌樣本具有更低的牙精胺水平。圖19示出了在良性、局部癌癥和轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織樣本中精胺、腐胺和牙精胺水平的箱線圖。圖20示出了非侵入性前列腺細(xì)胞系(RWPE)顯示比侵入性前列腺癌細(xì)胞系(VCAP、LnCaP、DU145、PC3和2RVV1)更高的精胺、腐胺和牙精胺水平。圖21示出了精胺/甲硫氨酸之比在活檢陽性前列腺癌患者的尿沉渣樣本中比活檢陰性對(duì)照中更高。圖22示出了牙精胺/甲硫氨酸之比在活檢陽性前列腺癌患者的尿沉渣樣本中比活檢陰性對(duì)照中更高。圖23示出了在活檢陽性前列腺癌患者和活檢陰性對(duì)照的尿沉渣樣本中精胺/甲硫氨酸和牙精胺/甲硫氨酸之比的箱線圖。圖24示出了肉豆蘧酸的水平在局部和轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織樣本中比在良性對(duì)照中更高。圖25示出了棕櫚酸的水平在局部和轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織樣本中比在良性對(duì)照中 更高。圖26示出了花生四烯酸的水平在局部和轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織樣本中比在良性對(duì)照中更高。圖27示出了硬脂酸的水平在轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織樣本中比在良性對(duì)照中更高。圖28示出了月桂酸的水平在轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織樣本中比在良性對(duì)照中更高。圖29示出了油酸的水平在轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織樣本中比在良性對(duì)照中更高。圖30示出了表明棕櫚酸、肉豆蘧酸、硬脂酸、花生四烯酸、油酸和月桂酸在良性、局部癌癥和轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織樣本中的水平箱線圖。圖31示出了在乳腺癌組織樣本中比在良性組織樣本中具有更高的水平。圖32示出了侵入性乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231、BT-549、T578、SVM-245)具有比非侵入性細(xì)胞系(HME)更高的肌氨酸水平。圖33示出了侵入性乳腺癌細(xì)胞系(MCF7、MDA-MB-231、T470、SKBR3)具有比非侵入性細(xì)胞系(MCFlOA)更高的腐胺、牙精胺和精胺水平。圖34示出了顯示在70個(gè)指診后尿沉渣中(35Bx_ve和35Bx+ve)基于GC-MS分析的代謝物(肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸)水平的箱線圖。圖35示出了在包含4種代謝物(肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸)的70個(gè)尿沉渣訓(xùn)練集上使用回歸分析發(fā)展的多重組的ROC曲線。圖36示出了顯示基于前列腺癌組織中的GC-MS分析的代謝物水平的箱線圖。圖37示出了前列腺癌組織顯示較高的亮氨酸水平。圖38示出了前列腺癌組織顯示較高的天冬酰胺水平。圖39示出了前列腺癌組織顯示較高的色氨酸水平。圖40示出了前列腺癌組織顯示較高的犬尿胺酸水平。圖41示出了前列腺癌組織顯示較高的3-氨基丁酸水平。圖42示出了活檢陽性尿沉渣顯示升高的肌氨酸水平。圖43示出了活檢陽性尿沉渣顯示較高的尿嘧啶水平(尿嘧啶/丙氨酸的比)。圖44示出了肌氨酸的再生性(獨(dú)立制備)。圖45示出了肌氨酸的再生性(復(fù)制)。圖46示出了在指診后尿沉渣中肌氨酸的穩(wěn)定性。圖47示出了在兩次獨(dú)立制備中谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的可再生性。
定義為了便于理解本發(fā)明，以下限定一些術(shù)語和短語“前列腺癌”是指癌癥發(fā)生在前列腺部位的疾病，前列腺是指男性生殖系統(tǒng)中的腺體。“低級(jí)”或“較低級(jí)”的前列腺癌是指非轉(zhuǎn)移性前列腺癌，包括低轉(zhuǎn)移潛力的惡性腫瘤(例如，認(rèn)為是具有低侵入性的前列腺癌)?！案呒?jí)”或“較高級(jí)”前列腺癌是指在受試者體內(nèi)已經(jīng)轉(zhuǎn)移的前列腺癌，包括高轉(zhuǎn)移潛力的惡性腫瘤(認(rèn)為是具有侵入性的前列腺癌)。如本文所使用的，術(shù)語“癌癥特異性代謝物”是指在癌癥細(xì)胞中與在非癌癥細(xì)胞中相比差別存在的代謝物。例如，在某些實(shí)施方案中，癌癥特異性代謝物在癌癥細(xì)胞中存在，而在非癌癥細(xì)胞中缺失。在其他的實(shí)施方案中，癌癥特異性代謝物在癌癥細(xì)胞中缺失，但在非癌癥細(xì)胞中存在。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，癌癥特異性代謝物在癌癥細(xì)胞中與在非癌癥細(xì)胞中相比差別存在。例如，癌癥特異性代謝物可能以任何水平差別存在，但一般以升高至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%或更多的水平存在，或一般以降低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100% (例如，缺失)的水平存在。癌癥特異性代謝物優(yōu)選地以統(tǒng)計(jì)性顯著(例如，通過使用Welch的T檢驗(yàn)或Wilcoxon的秩和檢驗(yàn)確定的P值小于O. 05和/或q值小于O. 10)的水平差別存在。典型的癌癥特異性代謝物在以下說明和實(shí)驗(yàn)部分詳細(xì)描述。如本文所使用的，術(shù)語“樣本”以其最廣義的含義使用。在一個(gè)含義中，其是指包括標(biāo)本或從任何源獲得的培養(yǎng)物，以及生物學(xué)和環(huán)境樣本。生物學(xué)樣本可以從動(dòng)物(包括人類)中獲得，而且包括流體、液體、組織和氣體。生物學(xué)樣本包括血液制品，諸如血漿、血清等等。然而，這種實(shí)例不能解釋為限制本發(fā)明可用的樣本類型。生物學(xué)樣本可以是動(dòng)物(包括人類)、流體、液體(例如，糞便)或組織，以及液體和固體食物和飼料產(chǎn)品，以及配料諸如乳品項(xiàng)目、蔬菜、肉類和肉類副產(chǎn)品以及廢料。生物學(xué)樣本可以從全部家族種類的家畜以及野化和野生動(dòng)物中獲得，這些動(dòng)物包括但不限于諸如蹄類動(dòng)物、熊、魚、兔類動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物等。生物學(xué)樣本可以含有任何適合檢測所需生物標(biāo)志物的生物學(xué)材料，而且可以包含來自受試者的細(xì)胞和/或非細(xì)胞的材料。該樣本能夠從任何適合的生物學(xué)組織或流體，例如，前列腺組織、血液、血漿、尿液或腦脊髓液(CSF)中分離。代謝物的“參考水平”是指顯示特殊疾病狀態(tài)、表型或其缺陷，以及疾病狀態(tài)、表型或其缺陷的組合的代謝物水平。代謝物的“陽性”參考水平是指顯示特殊疾病狀態(tài)或表型的水平。代謝物的“陰性”參考水平是指顯示缺乏特殊疾病狀態(tài)或表型的水平。例如，代謝物的“前列腺癌陽性參考水平”是指顯示受試者體內(nèi)前列腺癌的陽性診斷的代謝物水平，而且代謝物的“前列腺癌陰性參考水平”是指顯示受試者體內(nèi)前列腺癌陰性診斷的水平。代謝物的“參考水平”可以是代謝物的絕對(duì)或相對(duì)量或濃度、代謝物的存在或缺失、代謝物的量或濃度范圍、代謝物的最小和/或最大量或濃度、代謝物的平均量或平均濃度，和/或代謝物的中值量或中值濃度；而且，此外，代謝物的組合的“參考水平”還可以是兩種或多種代謝物彼此的絕對(duì)或相對(duì)量的比例。對(duì)特殊疾病狀態(tài)、表型或其缺陷的代謝物的適當(dāng)陽性和陰性參考水平可以通過在一種或多種適當(dāng)受試者體內(nèi)測量所需代謝物的水平來確定，而且這種參考水平可以根據(jù)受試者具體群體來調(diào)整(例如，參考水平可以與年齡匹配以便可以在特定年齡的受試者樣本中的代謝物水平和對(duì)特定年齡群的特殊疾病狀態(tài)、表型或其缺陷的參考水平之間作比較)。這種參考水平還可以根據(jù)用于測量生物學(xué)樣本(例如，LC-MS、GC-MS等)的代謝物水平的具體技術(shù)來調(diào)整，其中代謝物的水平可以根據(jù)使用的具體技術(shù)而不同。如本文所使用的，術(shù)語“細(xì)胞”是指任何真核或原核細(xì)胞(例如，細(xì)菌細(xì)胞諸如大腸桿菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、禽細(xì)胞、兩棲類動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、魚細(xì)胞核昆蟲細(xì)胞)，不論是位于體外或體內(nèi)。“質(zhì)譜測定法”(MS)是測量和分析分子的技術(shù)，其包括分割靶分子，然后基于它們的質(zhì)荷比分析碎片以產(chǎn)生質(zhì)譜，作為“分子指紋”。通過確定波長的方式確定對(duì)象的質(zhì)荷比，其中由該對(duì)象吸收電磁能量。有幾種確定離子質(zhì)荷比的常用方法，某些方法使用電磁波測 量離子軌道的相互作用，其他方法測量離子行進(jìn)特定距離的時(shí)間，或兩者都有。能夠在數(shù)據(jù)庫中查詢來自這些碎片質(zhì)量測量的數(shù)據(jù)以獲得靶分子的確切鑒定。質(zhì)譜測定法還廣泛應(yīng)用于化學(xué)的其他領(lǐng)域，諸如石油化學(xué)或藥品質(zhì)量控制等其他領(lǐng)域。術(shù)語“代謝”是指在有機(jī)體組織內(nèi)發(fā)生的化學(xué)變化，包括“合成代謝”和“分解代謝”。合成代謝是指分子的生物合成或聚集，而分解代謝是指分子斷裂?！按x物”是中間的或源自代謝的產(chǎn)物。代謝物通常是指“小分子”。術(shù)語“代謝學(xué)”是指分子代謝物研究?！吧锞酆衔铩笔且环N或多種類型的重復(fù)單位的聚合物。生物聚合物通常在生物系統(tǒng)中出現(xiàn)，特別包括多糖(諸如碳水化合物)和多肽(其術(shù)語用于包括多肽和蛋白質(zhì))和多核苷酸及其類似物，諸如那些由氨基酸類似物或非氨基酸基團(tuán)，或核苷酸類似物或非核苷酸基團(tuán)組成，或包含這些產(chǎn)物的化合物。這包括多核苷酸，其中常規(guī)主鏈由非天然產(chǎn)生或合成主鏈替代，和核酸(或合成或天然產(chǎn)生的類似物)，其中一種或多種常規(guī)堿基已經(jīng)由能夠參與Watson-Crick型氫鍵相互作用的基團(tuán)(天然或合成的)替代。多核苷酸包括單鏈或多鏈配置，其中一條或多條鏈可以或可以不是彼此完全排成一列的。如本文所使用的，術(shù)語“術(shù)后組織”是指已經(jīng)在外科流程中從受試者體內(nèi)移除的組織。術(shù)后組織的實(shí)例包括但不限于活檢樣本、切除的器官和切除的器官部分。如本文所使用的，術(shù)語“檢測(detect) ”、“檢測(detecting)”或“檢測(detection) ”可以描述為發(fā)現(xiàn)或鑒定的一般行為，或可檢測標(biāo)記成分的具體觀察。如本文所使用的，術(shù)語“臨床失敗”是指前列腺切除術(shù)之后的負(fù)面結(jié)果。與臨床失敗相關(guān)的結(jié)果實(shí)例包括但不限于前列腺切除術(shù)之后的PSA水平升高(例如，上升至少O. 2ng/ml)或疾病復(fù)發(fā)(例如，轉(zhuǎn)移性前列腺癌)。如本文所使用的，術(shù)語“多重”是指同時(shí)檢測樣本中一種以上的物質(zhì)(例如，分析物、代謝物、化合物)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及癌癥標(biāo)志物。特別地實(shí)施方案，本發(fā)明提供在癌癥(例如，前列腺癌或乳腺癌)中差別存在的代謝物。在研究本發(fā)明實(shí)施方案過程中操作的實(shí)驗(yàn)辨識(shí)出，例如，肌氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、亮氨酸、乙酰氨基葡糖、高半胱氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、組氨酸、正乙酰天門冬氨酸、馬來酸鹽、瓜氨酸、肌苷、肌醇、腺苷、?；撬帷⒓∷?、尿酸、谷胱甘肽、尿嘧啶、犬尿氨酸、甘油-3-磷酸、甘氨膽酸、辛二酸、胸腺嘧啶、谷氨酸、絲氨酸、尿嘧啶、黃苷、4-乙酰胺基丁酸、哌可酸、棕櫚酸、硬脂酸、月桂酸、油酸、花生四烯酸、甲硫氨酸、精胺、色氨酸、2-氨基己二酸、3-氨基異丁酸、牙精胺、腐胺、肉豆蘧酸和胸腺嘧啶差別存在于罹患癌癥的受試者體內(nèi)。其他標(biāo)志物在本文中和WO 2009/026152以及W02008/036691中描述，它們的全部內(nèi)容通過弓I用納入本文。公開的標(biāo)志物作為診斷、調(diào)查、篩查和治療目的使用。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供診斷癌癥(例如，前列腺癌或乳腺癌)的組合物和方法。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供基于升高水平的代謝物的存在鑒定侵入性癌癥(例如，侵入性前列腺癌、侵入性乳腺癌)的方法。本發(fā)明的實(shí)施方案提供組(例如，包含2種或多種、5種或多種、10種或多種、25種或多種或50種或多種)標(biāo)志物用于診斷、預(yù)斷、篩查或治療應(yīng)用 診斷和篩查應(yīng)用在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供診斷和篩查癌癥(例如，前列腺癌或乳腺癌)的方法和組合物，包括但不限于基于癌癥特異性代謝物或其衍生物、前提、代謝物等的存在，鑒定或診斷癌癥風(fēng)險(xiǎn)、癌癥階段的存在或缺失、轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)或存在、癌癥的侵入性等。典型的診斷方法描述如下。樣本根據(jù)本文的方法測驗(yàn)任何疑似含有癌癥特異性代謝物的患者樣本。通過非限制性的實(shí)施例，該樣本可以是組織(例如，前列腺或乳腺活檢樣本或術(shù)后組織)、血液、尿液或其部分(例如，血漿、血清、尿上清液、尿細(xì)胞沉淀、尿沉渣或前列腺細(xì)胞)。在某些實(shí)施方案中，樣本是從活檢或手術(shù)后(例如，前列腺活檢)獲得的組織樣本。尿液樣本優(yōu)選地在留意的直腸指檢(DRE)后立即收集，其使得前列腺細(xì)胞從前列腺腺體流進(jìn)尿道中。在某些實(shí)施方案中，患者樣本經(jīng)過用于對(duì)癌癥特異性代謝物或含有癌癥特異性代謝物的細(xì)胞分離或培養(yǎng)樣本的預(yù)處理?？梢允褂脤?duì)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的多種技術(shù)達(dá)到此目的，這些技術(shù)包括但不限于離心、免疫捕捉和細(xì)胞裂解。代謝物的檢測可以使用任何合適的方法檢測代謝物，這些方法包括但不限于液相和氣相色譜法、單獨(dú)或耦合進(jìn)行質(zhì)譜測定法(參見例如，以下實(shí)驗(yàn)部分)、NMR(參見例如，美國專利公開文本20070055456，通過引用納入本文)、免疫測定、化學(xué)測定、分光鏡檢查諸如此類。在某些實(shí)施方案中，使用色譜法和NMR分析的商業(yè)系統(tǒng)。在其他的實(shí)施方案中，使用光學(xué)成像技術(shù)檢測代謝物(例如，生物標(biāo)志物及其衍生物)，諸如磁共振波譜(MRS)、磁共振成像(MRI)、CAT掃描、超聲、基于MS的組織成像或X射線檢測方法(例如，能量色散X射線熒光檢測)?？梢允褂萌魏魏线m的方法分析生物學(xué)樣本以確定樣本中一種或多種代謝物的存在、缺失或水平。合適的方法包括色譜法(例如，HPLC、氣相色譜法、液相色譜法)、質(zhì)譜測定法(例如，MS、MS-MS)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、抗體連接、其他免疫化學(xué)技術(shù)、生物化學(xué)或酶促反應(yīng)或測定及其組合。此外，可以間接測量一種或多種代謝物的水平，例如通過使用測量與所需測量的生物標(biāo)志物水平相關(guān)的化合物(或化合物)水平測定。可以使用本發(fā)明的方法確定一種或多種列舉的代謝物水平。例如，可以使用這些方法確定一種代謝物、2種或多種代謝物、3種或多種代謝物、4種或多種代謝物、5種或多種代謝物、6種或多種代謝物、7種或多種代謝物、8種或多種代謝物、9種或多種代謝物、10種或多種代謝物等的水平，包括本文所述的某些或全部代謝物的組合的水平。確定代謝物組合的水平可以允許方法中存在更多敏感度和特異性，諸如診斷前列腺癌和輔助診斷前列腺癌，而且可以允許更好的鑒別或鑒定前列腺癌，使之與前列腺其他疾病(例如良性前列腺增生(BPH)、前列腺炎等)或可能與前列腺癌具有相似或重疊代謝物的其他癌癥(比較未罹患前列腺癌的受試者)區(qū)分開。例如，生物學(xué)樣本中特定代謝物水平比例可以允許在診斷前列腺癌和輔助診斷前列腺癌的過程中具有更大敏感度和特異性，并允許更好地鑒別或鑒定前列腺癌，使之與前列腺其他疾病或可能與前列腺癌具有相似或重疊代謝物的其他癌癥(比較未罹患前列腺癌的受試者)區(qū)分開。在某些實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)一種或多種代謝物(例如，哌可酸或脂肪酸(包括但不限于肉豆蘧酸、棕櫚酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸、油酸))的水平用于鑒定或鑒別乳腺癌。
數(shù)據(jù)分析在某些實(shí)施方案中，使用基于計(jì)算機(jī)的分析程序?qū)⒂蓹z測試驗(yàn)生成的原始數(shù)據(jù)(例如，癌癥特異性代謝物的存在、缺失或量)為臨床醫(yī)師解釋成預(yù)測值數(shù)據(jù)。臨床醫(yī)師能夠使用任何合適的方法訪問預(yù)測數(shù)據(jù)。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明具有進(jìn)一步優(yōu)勢，未經(jīng)過代謝物分析訓(xùn)練的臨床醫(yī)師不需要理解原始數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以其最有效的形式直接顯示給臨床醫(yī)師。然后臨床醫(yī)師能夠立刻使用信息以優(yōu)化對(duì)受試者的治療方案。本發(fā)明考慮到任何能夠接收、處理和傳輸信息的方法，這些信息來自實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析的信息、提供的信息、來自醫(yī)務(wù)人員和受試者的信息。例如，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，樣本(例如，活檢或血液、尿液或血清樣本)從受試者體內(nèi)獲得并提交到分析系統(tǒng)中(例如，醫(yī)療設(shè)施的臨床實(shí)驗(yàn)室等。)，其位于世界的任何地方(例如，位于與受試者居住國家不同的國家或信息最終使用的國家)以生成原始數(shù)據(jù)。如果樣本包含組織或其他生物學(xué)樣本，受試者可以去醫(yī)療中心獲取樣本并發(fā)送到分析中心，或受試者可以自己收集樣本(例如，尿液樣本)并直接發(fā)送到分析中心。如果樣本包含之前確定的生物學(xué)信息，受試者可以直接發(fā)送信息到分析中心(例如，含有信息的信息卡可以通過計(jì)算機(jī)掃描，并使用電子通訊系統(tǒng)將數(shù)據(jù)傳輸?shù)椒治鲋行牡挠?jì)算機(jī)上)。一旦分析中心接收信息，處理樣本，產(chǎn)生特異于受試者所需的診斷或預(yù)后信息的分析文件(例如，代謝特征)。然后由治療的臨床醫(yī)師將分析數(shù)據(jù)制成適合轉(zhuǎn)譯的格式。例如，并非提供原始數(shù)據(jù)，制成的格式可以表現(xiàn)出對(duì)受試者的診斷或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估(例如，存在癌癥的可能性)，以及對(duì)特別治療選擇的建議。數(shù)據(jù)可以通過任何合適的方法顯示給臨床醫(yī)師。例如，在某些實(shí)施方案中，分析系統(tǒng)產(chǎn)生報(bào)告，由臨床醫(yī)師(例如，在治療點(diǎn)上)打印或系統(tǒng)顯示給計(jì)算機(jī)監(jiān)控的臨床醫(yī)師。在某些實(shí)施方案中，信息在治療點(diǎn)上或在局部設(shè)施上首先分析。然后將原始數(shù)據(jù)發(fā)送到中央處理設(shè)施以作進(jìn)一步分析和/或以將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成對(duì)臨床醫(yī)師或患者有用的信息。中央處理設(shè)施具有隱私保密(所有數(shù)據(jù)按照統(tǒng)一的安全協(xié)議存儲(chǔ)在中央設(shè)施中)、速度和數(shù)據(jù)分析一致性的優(yōu)勢。然后中央處理設(shè)施在治療受試者之后能夠控制的命運(yùn)。例如，使用電子通訊系統(tǒng)，中央處理設(shè)施能夠提供數(shù)據(jù)給臨床醫(yī)師、受試者或研究者。在某些實(shí)施方案中，受試者能夠使用電子通訊系統(tǒng)直接獲取數(shù)據(jù)。受試者可以根據(jù)結(jié)果選擇進(jìn)一步干預(yù)或咨詢。在某些實(shí)施方案中，數(shù)據(jù)用于調(diào)查使用。例如，數(shù)據(jù)可以用于進(jìn)一步優(yōu)化包含或清除作為疾病的特殊狀況或階段的有效指示物的標(biāo)志物。在某些實(shí)施方案中，代謝物升高或降低的水平(例如，相對(duì)于在正常前列腺細(xì)胞中的水平、相對(duì)于先前時(shí)間點(diǎn)水平上升、相對(duì)于預(yù)先建立的閾水平上升等。)表明樣本中存在癌癥。當(dāng)確定樣本中一種或多種代謝物的量或水平時(shí)，這種量或水平可以與癌癥代謝物參考水平比較，諸如癌癥陽性和/或癌癥陰性參考水平，以便輔助診斷或診斷受試者是否罹患癌癥。樣本中一種或多種代謝物的水平對(duì)應(yīng)于癌癥陽性參考水平(例如，與參考水平相同的水平、與參考水平大體上相同的水平、高于和/或低于最小和/或最大參考水平的水平、和/或在參考水平范圍內(nèi)的水平)表明受試者體內(nèi)存在癌癥的診斷。樣本中一種或多種代謝物的水平對(duì)應(yīng)于癌癥陰性參考水平(例如，與參考水平相同的水平、與參考水平大 體上相同的水平、高于和/或低于最小和/或最大參考水平的水平、和/或在參考水平范圍內(nèi)的水平)表明受試者體內(nèi)沒有癌癥的診斷。此外，樣本中差別存在的一種或多種代謝物的水平(特別在統(tǒng)計(jì)上顯著的水平上)與癌癥陰性參考水平相比，表明受試者體內(nèi)存在癌癥的診斷。樣本中差別存在的一種或多種代謝物的水平(特別在統(tǒng)計(jì)上顯著的水平上)與癌癥陽性參考水平相比，表明受試者體內(nèi)沒有癌癥的診斷。使用多種技術(shù)，一種或多種代謝物的水平與癌癥陽性和/或前列腺癌陰性參考水平比較，包括在生物學(xué)樣本中一種或多種代謝物水平與癌癥陽性和/或癌癥陰性參考水平的簡單比較(例如，手動(dòng)比較)。還可以使用一種或多種統(tǒng)計(jì)分析(例如，t檢驗(yàn)、Welch的T檢驗(yàn)、Wilcoxon的秩和檢驗(yàn)、隨機(jī)森林)比較在生物學(xué)樣本中一種或多種代謝物水平與癌癥陽性和/或癌癥陰性參考水平。組合物&試劑盒用于(例如，足以用于、必須用于或有效用于)本發(fā)明的某些實(shí)施方案的診斷、調(diào)查或篩查方法的組合物包括必須、足以或有效用于檢測癌癥特異性代謝物存在或缺失的試齊U。所有這些組合物，單獨(dú)或與本發(fā)明的其他組合物結(jié)合，可以以試劑盒的形式提供。試劑盒還可以包含適當(dāng)?shù)目刂破骱?或檢測試劑。組本發(fā)明的實(shí)施方案提供同時(shí)檢測一種或多種本發(fā)明標(biāo)志物(例如，肌氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、組氨酸、正乙酰天門冬氨酸、肌苷、肌醇、腺苷、?；撬帷⒓∷?、尿酸、谷胱甘肽、尿嘧啶、犬尿氨酸、甘油-3-磷酸、甘氨膽酸、辛二酸、胸腺嘧啶、谷氨酸、黃苷、4-乙酰胺基丁酸、正乙酰酪氨酸和胸腺嘧啶、哌可酸、脂肪酸(包括但不限于肉豆蘧酸、棕櫚酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸、油酸)或聚胺(包括但不限于腐胺、牙精胺、精胺))的多重或組測定，檢測包括單獨(dú)檢測上述標(biāo)志物，或與本領(lǐng)域已知的其他癌癥標(biāo)志物結(jié)合檢測。例如，在某些實(shí)施方案中，提供組或結(jié)合測定在單獨(dú)測定中檢測2種或多種、3種或多種、4種或多種、5種或多種、6種或多種、7種或多種、8種或多種、9種或多種、10種或多種、15種或多種或20種或多種的標(biāo)志物。在某些實(shí)施方案中，測定是自動(dòng)化或高流通量的。
在某些實(shí)施方案中，組包含肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸。實(shí)驗(yàn)在本發(fā)明實(shí)施例的研究過程中施行，確定肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的組顯示比任何單個(gè)標(biāo)志物更高的曲線下面積，因此在檢測前列腺癌癥中更具敏感性。在某些實(shí)施方案中，檢測前列腺癌的組進(jìn)一步包含一種或多種乙酰氨基葡糖、犬尿胺酸、尿嘧啶、高半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、牙精胺、精胺、2-氨基己二酸、亮氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、馬來酸鹽、組氨酸、瓜氨酸、腺苷或肌苷。在某些實(shí)施方案中，其他癌癥標(biāo)志物包括在多重或組測定中。標(biāo)志物選自其單獨(dú)的或與本文所述的代謝標(biāo)志物結(jié)合的預(yù)測值。典型的前列腺癌標(biāo)志物包括但不限于AMACR/P504S (美國專利號(hào) 6，262，245) ；PCA3 (美國專利號(hào) 7，008，765) ；PCGEM1 (美國專利號(hào) 6，828，429) ;prostein/P501S、P503S、P504S、P509S、P510S、前列腺 /P703P、P710P(美國公開號(hào)20030185830);和那些在美國專利號(hào)5，854，206和6，034，218以及美國公開號(hào)20030175736中公開的信息，它們的全部內(nèi)容通過引用納入本文。也考慮到到其他癌癥、疾病、感染和代謝狀況的標(biāo)志物，將其包括在多重或組形式中。治療方法·在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療方法(例如，靶定本文所述癌癥特異性代謝物)。在某些實(shí)施方案中，該治療方法靶定本文所述癌癥特異性代謝物的酶或通路的組成部分。例如，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靶定本發(fā)明的癌癥特異性代謝物的化合物?；衔锟梢酝ㄟ^，例如干擾癌癥特異性代謝物或其前體或代謝物的合成(例如，通過阻礙代謝物合成中涉及的酶轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)譯、通過鈍化代謝物合成中涉及的酶(例如，通過轉(zhuǎn)譯后修飾或與不可逆抑制劑結(jié)合)或除此之外通過抑制代謝物合成中涉及的酶活性)、通過結(jié)合抑制癌癥特異性代謝物的功能、通過結(jié)合到靶癌癥特異性代謝物(例如，競爭性或非競爭性抑制劑)或通過增加代謝物的斷裂或廓清率來降低癌癥特異性代謝物的水平?；衔锟梢酝ㄟ^例如，抑制癌癥特異性代謝物的斷裂或廓清率(例如，通過抑制代謝物斷裂中涉及的酶)，通過增加癌癥特異性代謝物的前體水平或通過增加代謝物對(duì)其目標(biāo)的親和力來提高癌癥特異性代謝物的水平。典型的治療靶標(biāo)包括但不限于甘氨酸-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(GNMT)和肌氨酸。代謝途徑典型的癌癥特異性代謝物的代謝途徑描述如下。本發(fā)明考慮到其他代謝物用于本發(fā)明的組合物和方法，并在如以下實(shí)驗(yàn)部分中描述。肌氨酸代謝例如，肝內(nèi)膽堿代謝中涉及肌氨酸。在哺乳動(dòng)物的肝內(nèi)膽堿轉(zhuǎn)化成甘氨酸的氧化降解反應(yīng)在線粒體中發(fā)生，其中其通過特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入。此代謝途徑中的最后兩步由二甲基甘氨酸脫氫酶(Me2GlyDH)催化，該酶將二甲基甘氨酸轉(zhuǎn)化成肌氨酸和肌氨酸脫氫酶(SarDH)，其將肌氨酸(正甲基甘氨酸)轉(zhuǎn)化成甘氨酸。兩種酶位于線粒體基質(zhì)中。因此，在某些實(shí)施方案中，治療組合物靶定Me2GlyDH和/或SarDH。通過使用本文所述的藥物篩選方法鑒定典型的化合物。羥基乙酸代謝膽固醇利用的最終產(chǎn)物是在肝內(nèi)合成的膽汁酸。膽汁酸的合成是排泄多余膽固醇的主要機(jī)制。然而，膽固醇以膽汁酸形式排泄不足以補(bǔ)償膽固醇的過量攝入。在人類膽內(nèi)最豐富的膽汁酸是鵝膽酸(45% )和膽酸(31% )。在膽汁酸分泌到毛細(xì)膽管中之前，其羧基通過酰胺鍵與甘氨酸或?；撬峁曹?。這種共軛反應(yīng)分別得到甘氨膽酸和?；悄懰?。毛細(xì)膽管與膽小管結(jié)合，然后形成膽管。膽汁酸從肝中通過這些管道運(yùn)載到膽囊中，在其中儲(chǔ)藏膽汁酸以備后用。膽汁酸的最終歸宿是分泌到腸中，其中它們輔助對(duì)飲食中脂肪乳化。在腸道中，移除甘氨酸和?；撬釟?jiān)⒛懼崤判?僅有的很小百分比)或通過腸道再吸收返回到肝中。把這個(gè)過程稱為腸肝循環(huán)。辛二酸代謝辛二酸，也稱為氨基辛二酸，是具有分子SC6H12(COOH)2的二羧酸。二羧酸的過氧化物酶代謝導(dǎo)致排泄到尿液中的中鏈二羧酸己二酸、辛二酸和癸二酸的產(chǎn)生。黃苷代謝在嘌呤核苷代謝中涉及黃苷。特別地，黃苷是肌苷轉(zhuǎn)化成鳥苷的中間產(chǎn)物。黃苷 酸能夠用于嘌呤代謝中肌苷酸脫氫酶活性的定量測量，推薦使用以確保對(duì)罹患急性淋巴細(xì)胞白血病的(ALL)的兒童施行最佳的硫唑嘌呤治療。聚胺代謝聚胺具有兩個(gè)或多個(gè)伯氨基，而且是真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中的基本分子。盡管已知聚胺通過高調(diào)節(jié)通路在細(xì)胞中合成，它們的實(shí)際功能并不完全清楚。作為陽離子，它們以定期間隔的時(shí)間間隔與DNA結(jié)合。如果抑制細(xì)胞聚胺合成，細(xì)胞生長將停止或嚴(yán)重延緩。外原性聚胺的供應(yīng)恢復(fù)了這些細(xì)胞的生長。大多數(shù)真核細(xì)胞在其細(xì)胞膜上具有聚胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)，能夠促進(jìn)外原性聚胺的內(nèi)在化。這種系統(tǒng)在快速增殖細(xì)胞中具有高活性，并且是某些化學(xué)療法(例如，DMFO, MGBG, BCNU及其類似物)的目標(biāo)。聚胺還是多種離子通道的重要調(diào)制器，包括NMDA受體和AMPA受體。它們阻礙內(nèi)向整流鉀通道，從而保存細(xì)胞能量(跨細(xì)胞膜的K+離子梯度)。聚胺的實(shí)例包括但不限于腐胺、尸胺、精胺和牙精胺。腐胺通過從精氨酸起始的兩種不同通路合成。在一個(gè)通路中，精氨酸通過酶精氨酸脫羧酶(ADC)催化的反應(yīng)轉(zhuǎn)化成胍丁胺；然后胍丁胺通過胍丁胺亞胺羥化酶(AIH)轉(zhuǎn)化成氨甲酰腐胺。最終，氨甲酰腐胺轉(zhuǎn)化成腐胺。在第二個(gè)通路中，精氨酸轉(zhuǎn)化成鳥氨酸，然后鳥氨酸通過鳥氨酸脫羧酶(ODC)轉(zhuǎn)化成腐胺。使用賴氨酸脫羧酶(LDC)在一步反應(yīng)中從賴氨酸中合成尸胺。使用來自脫羧S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的氨丙基基團(tuán)從腐胺合成牙精胺。通過牙精胺合酶催化該反應(yīng)。在酶精胺合酶存在下使用SAM從牙精胺反應(yīng)中合成精胺。脂肪酸代謝脂肪酸包含通常具有無支鏈的脂肪族尾狀物(鏈)的飽和或不飽和的羧酸。脂肪酸的實(shí)例包括但不限于肉豆蘧酸、棕櫚酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸(也稱為正十二烷酸)和油酸。肉豆蘧酸，也稱為十四酸或14:0，是分子式為CH3(CH2)12COOH的常見飽和脂肪酸。肉豆蘧酸鹽是肉豆蘧酸的鹽或酯。肉豆蘧酸以豆蘧核仁(肉豆蘧)為名。肉豆蘧酯是75%三肉豆蘧酸甘油酯，肉豆蘧酸的甘油三酯。除豆蘧核仁之外，肉豆蘧酸也在棕櫚油、椰子油、乳脂和鯨油，即來自抹香鯨油脂的結(jié)晶分?jǐn)?shù)。肉豆蘧酸還以協(xié)同轉(zhuǎn)譯的方式普遍加入到倒數(shù)第二個(gè)氮末端，受體相關(guān)激酶中的甘氨酸中以賦予酶的膜定位。肉豆蘧酸具有充分的高疏水性，能夠納入真核細(xì)胞的血漿膜雙層磷脂的脂肪酰基核心中。肉豆蘧酸以這種方式充當(dāng)生物膜中的脂質(zhì)錨發(fā)揮作用。棕櫚酸，IUPAC命名中的CH3 (CH2)14COOH或十六酸，是在動(dòng)植物中最常見的飽和脂肪酸之一，也是來自棕櫚樹油脂(棕櫚油和棕櫚仁油)的主要成分。棕櫚一詞源自法語"棕櫚(palmitique)"，即棕櫚樹的髓。棕櫚酸是脂肪生成(脂肪酸合成)過程中產(chǎn)生的第一種脂肪酸，從中能夠產(chǎn)生較長的脂肪酸。棕櫚酸鹽在乙酰輔酶A羧化酶(ACC)上陰性反饋，該ACC負(fù)責(zé)將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化成丙二酰輔酶A，將其加入到生長?；湉亩璧K棕櫚酸鹽的進(jìn)一步生成?；ㄉ南┧?也稱為AA或ARA)是ω-6脂肪酸20:4 (ω-6)。其對(duì)應(yīng)于花生油中的飽和花生酸(落花生屬-花生)。花生四烯酸是具有20個(gè)碳鏈和4個(gè)順式雙鍵的羧酸；第一個(gè)雙鍵位于ω端的第6個(gè)碳上。“花生四烯酸”偶爾用于指定任何一種二十碳四烯酸。然而，術(shù)語普遍限于所有-順式5、8、11、14_ 二十碳四烯酸。花生四烯酸通過酶磷脂酶Α2 (PLA2)從磷脂分子中釋放，其使脂肪酸斷裂，但還能夠通過DAG脂肪酶從DAG中生成。為了發(fā)信號(hào) 的目的而生成的花生四烯酸好像是通過磷脂酰膽堿特異性胞漿型磷脂酶Α2 (cPLA2,85kDa)的作用獲得，而炎性的花生四烯酸通過低分子量分泌的PLA2 (SPLA2，14-18kDa)的作用生成?；ㄉ南┧嵩陬惗樗岙a(chǎn)生過程中是前體1)酶環(huán)加氧酶和過氧化物酶導(dǎo)致前列腺素H2的產(chǎn)生，其反過來用于產(chǎn)生前列腺素、環(huán)前列腺素和凝血烷；2)酶5-脂氧合酶導(dǎo)致5-HPETE的產(chǎn)生，其反過來用于產(chǎn)生白細(xì)胞三烯；3)花生四烯酸還用于大麻素的生物合成；和4)某些花生四烯酸通過表氧化酶轉(zhuǎn)化成羥基二十碳四烯酸(HETEs)和環(huán)氧二十碳三酸(EETs)。這些衍生物的產(chǎn)生及其在體內(nèi)的作用統(tǒng)稱為花生四烯酸級(jí)聯(lián)。硬脂酸或18:0是飽和脂肪酸。其是具有化學(xué)式C18H36O2或CH3(CH2) 16C00H的蠟狀固體。硬脂酸經(jīng)歷飽和羧酸的典型反應(yīng)、向硬脂醇的顯著還原和與一系列乙醇產(chǎn)生的酯化反應(yīng)。在人類體內(nèi)標(biāo)記的同位素(Emken等(1994) Am. J. Clin. Nutr. 60 1023S-1328S)表明氧化性去飽和成油酸的膳食硬脂酸部分比類似轉(zhuǎn)化成十六烯酸的棕櫚酸部分高2. 4倍。而且，硬脂酸不大可能納入膽固醇酯中。油酸是在多種動(dòng)植物源中出現(xiàn)的單不飽和ω-9脂肪酸，而且是人類脂肪組織中具有最高豐度的脂肪酸。其具有分子式CH3(CH2)7CH = CH(CH2)7COOH)。油酸的反式異構(gòu)體稱為反油酸。小分子治療在某些實(shí)施方案中使用小分子治療。在某些實(shí)施方案中，小分子治療靶定癌癥特異性代謝物。在某些實(shí)施方案中使用如本發(fā)明的藥物篩選方法來鑒定小分子治療?；诤怂岬闹委熢谄渌膶?shí)施方案中使用基于核酸的治療。典型的基于核酸的治療包括但不限于反義RNA、siRNA和miRNA。在某些實(shí)施方案中，基于核酸的治療靶定癌癥特異性代謝物(如上所述)的代謝途徑中的酶表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，基于核酸的治療是反義的。將SiRNA作為基因特異性治療劑使用(Tuschl 和 Borkhardt, Molecular Intervent. 2002 ；2(3) :158-67,其內(nèi)容通過引用納入本文)。siRNA轉(zhuǎn)染到動(dòng)物細(xì)胞中結(jié)果得到有力而長久持續(xù)的特異性基因轉(zhuǎn)錄后沉默(Caplen 等，Proc Natl Acad Sci U. S. A. 2001 ；98 :9742-7 ；Elbashir 等 Nature. 2001 ；411 :494-8 ；Elbashir 等 Genes Dev. 2001 ；15 :188-200 ;和 Elbashir 等 EMBO J. 2001 ；20 6877-88，它們的全部內(nèi)容通過引入納入本文)。在例如美國專利號(hào)6，506, 559中描述了使用siRNA施行RNA干擾的方法和組合物，其內(nèi)容通過引用納入本文。在其他的實(shí)施方案中，使用反義化合物操縱癌癥特異性代謝物的代謝途徑中涉及的基因表達(dá)，該反義化合物與一種或多種編碼酶的核酸特異性雜交(參見例如，GeorgSczakiel, Frontiers in Bioscience 5, dl94_201 January I,2000 ;Yuen 等 Frontiersin Bioscience d588_593, June 1,2000 ；Antisense Therapeutics, Second Edition,Phillips, M. Ian, Humana Press, 2004 ;它們的全部內(nèi)容通過引用納入本文)?；蛑委煴景l(fā)明考慮到了用于本文所述的癌癥特異性代謝物的代謝途徑中涉及的酶表達(dá)的任何基因操縱的用途。基因操縱的實(shí)例包括但不限于，基因敲除(例如，使用如重組方式從染色體中移除基因)、具有或不具有導(dǎo)入型啟動(dòng)子的反義結(jié)構(gòu)表達(dá)，諸如此類。可以使用 任何合適的方法實(shí)施核酸結(jié)構(gòu)向體外或體內(nèi)細(xì)胞的遞送。合適的方法是將核酸結(jié)構(gòu)引入到細(xì)胞中以發(fā)生所需事件(例如，反義結(jié)構(gòu)的表達(dá))?；虔煼ㄟ€可以用于遞送siRNA或在體內(nèi)表達(dá)的其他干擾分子(例如，根據(jù)導(dǎo)入型啟動(dòng)子的刺激)。通過任何方法完成運(yùn)載基因信息導(dǎo)入到細(xì)胞中的分子中，這些方法包括但不限于裸DNA結(jié)構(gòu)的定向注射、使用所述結(jié)構(gòu)裝載的金顆粒轟擊和大分子使用例如脂質(zhì)體、生物聚合物等等調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)移。優(yōu)選的方法使用來源于細(xì)菌的基因遞送負(fù)載體，這種細(xì)菌包括但不限于腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、牛痘病毒和腺相關(guān)病毒。來源于腺病毒的載體由于具有比逆轉(zhuǎn)錄病毒更高的效率，成為將核酸分子轉(zhuǎn)移到體內(nèi)宿主細(xì)胞的優(yōu)選基因遞送負(fù)載體。已經(jīng)顯示出腺病毒載體能夠非常有效地將體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移到動(dòng)物模型的多種實(shí)體瘤中，而且轉(zhuǎn)移到免疫缺陷小鼠的人類實(shí)體瘤異種移植中。腺病毒載體的實(shí)例和基因轉(zhuǎn)移的方法在PCT公開號(hào) WO 00/12738 和 WO 00/09675 以及美國專利申請(qǐng)?zhí)?6，033，908,6, 019，978,6, 001，557、5，994，132,5, 994，128,5, 994，106,5, 981，225,5, 885，808,5, 872，154,5, 830，730 和5，824，544中描述，它們的全部內(nèi)容通過引用納入本文。載體可以以多種方式施用于受試者。例如，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，使用直接注射的方法向腫瘤或腫瘤相關(guān)組織施用載體。在其他的實(shí)施方案中，通過血液或淋巴循環(huán)進(jìn)行施用(參見例如，PCT公開號(hào)99/02685，它的全部內(nèi)容通過引用納入本文)。腺病毒載體的典型劑量水平優(yōu)選為添加到灌流中的IO8至IO11載體顆粒?？贵w治療在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靶定癌癥特異性代謝物或在其代謝途徑中涉及的酶的抗體?？梢栽诒疚乃_的治療方法中使用任何合適的抗體(例如，單克隆、多克隆和合成的抗體)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于癌癥治療的抗體是人化抗體。人化抗體的方法在本領(lǐng)域眾所周知(參見例如，美國專利號(hào)6，180，370,5, 585，089,6, 054，297和5，565，332 ；每種內(nèi)容通過引用納入本文)。在某些實(shí)施方案中，基于治療的抗體配制成如下所述的藥物組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，施用本發(fā)明的抗體組合物會(huì)得到可預(yù)見地降低癌癥的效果(例如，減少或根除腫瘤)。
藥物組合物本發(fā)明進(jìn)一步提供藥物組合物(例如，包含調(diào)節(jié)癌癥特異性代謝物的水平或活性的藥劑。本發(fā)明的某些實(shí)施方案中的藥物組合物可以以很多方式施用，其取決于是否需要局部或全身治療和治療部位。施用可以是局部的(包括眼的和包括鞘內(nèi)的以及直腸遞送到粘膜)、肺的(例如，通過粉末或氣溶膠吸入或吹入，包括通過噴霧劑；通過氣管內(nèi)的、鼻內(nèi)的、表皮的和經(jīng)皮的)、口服或腸胃外的方式。腸胃外施用包括靜脈、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌肉注射或注入；或顱內(nèi)的，例如，鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用。局部施用的藥物組合物和制劑可以包括經(jīng)皮貼劑、軟膏、洗劑、膏狀物、凝膠、滴齊IJ、栓劑、噴霧、液體和粉末。常規(guī)藥物載體、水性、粉末或油性基、增稠劑等等是必要或理想的。
口服施用的組合物和制劑包括粉末或顆粒、在水或非水介質(zhì)中的懸浮液或溶液、膠囊、小袋或片劑。增稠劑、矯臭劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑是理想的。腸胃外、鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用的組合物和制劑可以包括無菌水溶液，其還可以包含緩沖液、稀釋劑和其他合適的添加劑，例如但不限于穿透增強(qiáng)劑、載體化合物和其他藥理上接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于溶液、乳劑和含有脂質(zhì)體的制劑。這些組合物可以從多種成分中生成，這些成分包括但不限于預(yù)制液體、自乳化固體和自乳化半固體?？梢砸詥挝粍┝啃问奖阋舜嬖诘谋景l(fā)明的藥物制劑可以根據(jù)工業(yè)制藥領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)技術(shù)來制備。這種技術(shù)包括使用藥物載體或賦形劑建立活性成分締合的步驟。一般地，通過使用液體載體或細(xì)分的固體載體或兩者都有來統(tǒng)一而密切地建立活性成分的締合，然后如有必要，使產(chǎn)物成型來制備制劑。本發(fā)明的組合物可以配制成任何可能的劑量形式，例如但不限于片劑、膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。本發(fā)明的組合物還可以配制成水性、非水性或混合介質(zhì)中的懸浮液。水性懸浮液可以進(jìn)一步包含增加懸浮液粘性的物質(zhì)，包括例如，羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。懸浮液還可以包含穩(wěn)定劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物可以配制成并用作泡沫。藥物泡沫包括制劑，例如但不限于乳劑、微型乳劑、膏狀物、凝膠劑和脂質(zhì)體。雖然這些制劑的性質(zhì)基本相似，但它們在成分和最終產(chǎn)物的稠度方面不同。在細(xì)胞水平上增強(qiáng)寡核苷酸攝取的試劑還可以加入到本發(fā)明的藥物和其他組合物中。例如，陽離子脂質(zhì)體，諸如脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(美國專利號(hào)5，705，188)、陽離子甘油衍生物和聚陽離子分子，諸如聚賴氨酸(W097/30731)，也增強(qiáng)細(xì)胞的寡核苷酸的攝取。發(fā)明的組合物可以另外含有在藥物組合物中常見的其他輔助成分。因此，例如，組合物可以含有其他的、配伍的、具有藥理活性的材料，例如，止癢藥、止血?jiǎng)?、局部麻醉劑或消炎劑，或者可以含有能夠?qū)嶋H配制成本發(fā)明組合物的多種劑量形式的其他材料，諸如染色劑、矯臭劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑、和穩(wěn)定劑。然而，當(dāng)加入這些材料時(shí)，它們不應(yīng)過度干擾本發(fā)明組合物成分的生物活性。如有需要，制劑可以進(jìn)行無菌處理，并與輔助試劑混合，這些輔助試劑諸如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、用于影響滲透壓的鹽、緩沖液、著色劑、調(diào)味劑和/或芳香物質(zhì)等不會(huì)與制劑的核酸相互作用產(chǎn)生有害物質(zhì)的試劑。
本發(fā)明的指定實(shí)施方案提供了藥物組合物，含有(a) —種或多種核酸化合物和(b) 一種或多種以不同機(jī)制發(fā)揮功能的其他化療劑。這種化療劑的實(shí)例包括但不限于抗癌藥，諸如柔紅霉素、放線菌素D、阿霉素、博來霉素、絲裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、環(huán)磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5_氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟去氧尿苷(5-FUdR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙素、長春新堿、長春花堿、表鬼白毒、表鬼白毒噻吩糖苷、順氯氨鉬和已烯雌酚(DES)?？寡姿幇ǖ幌抻诜穷惞檀伎寡姿幒推べ|(zhì)類固醇，而且抗病毒藥物包括但不限于病毒唑、阿糖腺苷、無環(huán)鳥苷和9-(1，3_ 二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤，還可以與本發(fā)明的組合物結(jié)合。其他非反義化療劑也在本發(fā)明范圍內(nèi)。兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合的化合物可以同時(shí)或順序使用。定量取決于待治療病狀的嚴(yán)重程度和應(yīng)答性，療程持續(xù)幾天至幾個(gè)月，或直到出現(xiàn)治療效果或病狀減輕的情況。能夠通過測量患者體內(nèi)的藥物累積量來計(jì)算最佳定量安排。施用醫(yī)生能夠輕易確定最佳的劑量、定量方法和重復(fù)率。最佳劑量可以隨單個(gè)寡核苷酸的相對(duì)效率而變化，而且一般可以基于在動(dòng)物模型的體外或體內(nèi)有效用的EC5tl或基于本文所述的實(shí)例來估計(jì)。一般地，劑量是每公斤體重的O. 01 μ g至100g，而且可以每天、每周、 每月以及每年給藥一次或多次。治療醫(yī)生能夠基于測量的停留時(shí)間和體液或組織中的藥物濃度來估計(jì)定量的重復(fù)率。成功治療后，理想的情況是使受試者接受維持治療以避免病狀復(fù)發(fā)，其中以每公斤體重的O. 01 μ g至IOOg維持劑量施用藥物組合物，每天一次或多次至每20年一次。藥物篩選應(yīng)用在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供藥物篩選測定(例如，針對(duì)抗癌藥進(jìn)行篩選)。本發(fā)明的篩選方法使用本文所述的癌癥特異性代謝物。如上所述，在某些實(shí)施方案中，測試化合物是小分子、核酸或抗體。在某些實(shí)施方案中，測試化合物直接靶定癌癥特異性代謝物。在其他的實(shí)施方案中，它們靶定癌癥特異性代謝物的代謝途徑中涉及的酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物篩選方法是高流通量藥物篩選方法。高流通量篩選的方法在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知，而且包括但不限于那些在美國6468736、W006009903和5972639文獻(xiàn)中所描述的方法，它們的全部內(nèi)容通過引用納入本文。通過使用本領(lǐng)域已知的任何一種組合庫方法的許多途徑得到本發(fā)明的某些實(shí)施方案的測試化合物，這種組合庫包括生物庫；類肽庫(具有肽的功能，但具有新穎的非肽主鏈的分子庫，其對(duì)酶降解耐受但仍然保持生物活性；參見例如，Zuckennann等J. Med.Chem. 37 =2678-85[1994]);空間可編址的并行固態(tài)相或液態(tài)相庫；需要退褶合的合成庫方法；“一珠一化合物”庫方法；和使用親和性色譜法選擇的合成庫方法。生物庫和類肽庫途徑優(yōu)選地用于肽庫，而其他四種途徑可用于肽、非肽寡聚體或化合物的小分子庫(Lam(1997)Anticancer Drug Des. 12 :145)。分子庫合成方法的實(shí)例可以在本領(lǐng)域中，例如在=DeWitt等Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 90 :6909 [1993] ；Erb 等 Proc. Nad. Acad. Sci. USA 91 :11422 [1994]；Zuckermann 等 J. Med. Chem. 37 2678[1994] ；Cho 等 Science 261 1303[1993] ；Carre11等 Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33. 2059 [1994] ；Carell 等 Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33 2061 [1994];和 Gallop 等 J. Med. Chem. 37 :1233 [1994]發(fā)現(xiàn)。化合物庫可以存在于溶液(例如，Houghten,Biotechniques 13 :412_421 [1992])或珠(Lam, Nature 354 :82-84[1991])、片(Fodor, Nature 364 :555-556[1993])、細(xì)菌或孢子(美國專利號(hào)5，223，409，其內(nèi)容通過引用納入本文)、質(zhì)粒(Cull等Proc.Nad. Acad. Sci. USA 89 18651869[1992])或噬菌體(Scott 和 Smith，Science 249 386-390 [1990] ；Devlin Science 249 :404-406 [1990] ；Cwirla 等 Proc. Natl. Acad.Sci. 87 :6378-6382[1990] ;Felici，J. Mol. Biol. 222 :301 [1991])中。在某些實(shí)施方案中，本文所述的標(biāo)志物用于產(chǎn)生鑒別癌癥治療劑的模型系統(tǒng)。例如，癌癥特異性生物標(biāo)志物的代謝物(例如，活化細(xì)胞增殖的肌氨酸)能夠加入到細(xì)胞系中增強(qiáng)細(xì)胞系的癌癥侵入性。細(xì)胞系會(huì)具有改善的用于抗癌劑篩選的應(yīng)答(例如，‘讀出’)動(dòng)態(tài)范圍。當(dāng)描述體外實(shí)例時(shí)，模型測定系統(tǒng)可以是在體外、體內(nèi)或來自體內(nèi)的。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物本發(fā)明考慮到包含外源基因(例如，從改變的癌癥特異性代謝物水平得到的)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生成。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與野生型動(dòng)物相比，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物顯示出改變的表 型(例如，代謝物的增加或減少)。分析這種表型的存在或缺失的方法包括但不限于那些在本文中公開的內(nèi)容。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還顯示出增加或減少的腫瘤生長或癌癥跡象的發(fā)展。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物用于藥物(例如，癌癥治療藥物)篩選。在某些實(shí)施方案中，將測試化合物(例如，疑似用于治療癌癥的藥物)和對(duì)照化合物(例如，安慰劑)施用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物，并評(píng)估它們的效果。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能夠通過多種方法生成。在某些實(shí)施方案中，將不同發(fā)育階段的胚胎細(xì)胞用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因。根據(jù)胚胎細(xì)胞的發(fā)育階段使用不同方法。受精卵是微量注射的最佳靶。在小鼠體內(nèi)，雄性核的直徑達(dá)到大概20微米的尺寸，允許1-2皮升(pi) DNA溶液的可重復(fù)注射。將受精卵做為基因轉(zhuǎn)移靶使用的主要優(yōu)勢在于，在大多數(shù)情況下，注射的DNA在第一次裂解前會(huì)納入到宿主基因組內(nèi)(Brinster等Proc. Natl. Acad. Sci.USA82 :4438-4442[1985])。結(jié)果，轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物的所有細(xì)胞將攜帶納入的轉(zhuǎn)基因。一般地，這還會(huì)通過轉(zhuǎn)基因的有效傳輸反射到創(chuàng)立者的后代中，因?yàn)?0%的生殖細(xì)胞將存有轉(zhuǎn)基因。美國專利號(hào)4，873，191描述了微量注射受精卵的方法。該專利公開的全部內(nèi)容納入本文。在其他的實(shí)施方案中，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染將轉(zhuǎn)基因?qū)肴绶侨祟悇?dòng)物中。在某些實(shí)施方案中，通過將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體注射到卵母細(xì)胞的卵周隙內(nèi)來使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染卵母細(xì)胞(美國專利號(hào)6，080，912，其內(nèi)容通過引用納入本文)。在其他的實(shí)施方案中，發(fā)育中的非人類胚胎能夠在體外培養(yǎng)成胚泡階段。在此時(shí)期中，卵裂球成為逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的目標(biāo)(Janenich,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73 :1260 [1976])。通過酶處理得到卵裂球的有效感染以移除透明帶(Hogan 等 in Manipulating the Mouse Embryo, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. [1986])。用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的病毒載體系統(tǒng)是典型的攜帶轉(zhuǎn)基因的復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒(Jahner等Proc. Natl. Acad Sci.USA 82 :6927[1985])。通過在產(chǎn)生病毒細(xì)胞的單層上培養(yǎng)卵裂球輕易且有效地獲得轉(zhuǎn)染(Stewart，等EMBO J.，6 :383[1987])?？蛇x地，在后期施行感染。病毒或產(chǎn)生病毒的細(xì)胞能夠注射到胚泡腔內(nèi)(Jahner等Nature 298 :623 [1982])。大多數(shù)創(chuàng)立者會(huì)成為轉(zhuǎn)基因的嵌合體，因?yàn)榧{入只在形成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞子集內(nèi)產(chǎn)生。此外，創(chuàng)立者可以在基因組的不同位置含有轉(zhuǎn)基因的多種逆轉(zhuǎn)錄病毒嵌入，其一般會(huì)在后代中分離。另外，還可能通過妊娠中期胚胎的子宮內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染將轉(zhuǎn)基因?qū)肴敕N系中，盡管這是低效率的(Jahner等，如上所述[1982])。本領(lǐng)域已知的使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的其他方法包含逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子或絲裂霉素C處理細(xì)胞(產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)入受精卵或早期胚胎)的微量注射(PCT 國際申請(qǐng) W090/08832[1990]，和 Haskell 和 Bowen，Mol. Reprod.Dev. ,40 :386[1995])。在其他的實(shí)施方案中，將轉(zhuǎn)基因?qū)肴肱咛ジ杉?xì)胞內(nèi)，并使用轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞形成胚胎。通過在適當(dāng)?shù)臈l件下體外培養(yǎng)植入前胚胎獲得ES細(xì)胞(Evans等Nature 292 154 [1981] ；Bradley 等 Nature 309 :255 [1984] ；Gossler 等 Proc. Acad. Sci. USA 83:9065[1986];和Robertson等Nature 322 :445[1986])。通過本領(lǐng)域已知的多種方法進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)染使得轉(zhuǎn)基因能夠有效導(dǎo)入ES細(xì)胞中，這些方法包括磷酸鈣共同沉淀、原生質(zhì)體或原生質(zhì)球融合、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染和DEAE-葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。還可以通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)或通過微量注射將轉(zhuǎn)基因?qū)隕S細(xì)胞中。這種轉(zhuǎn)染的ES細(xì)胞在其導(dǎo)入到胚泡階段胚胎的囊胚腔內(nèi)以后能夠殖民胚胎，并有助于得到的嵌合體動(dòng)物的種系(參考參見Jaenisch, Science240 :1468 [1988])。在將轉(zhuǎn)染的ES細(xì)胞導(dǎo)入到囊胚腔之前，轉(zhuǎn)染的ES細(xì)胞可以在多種選擇協(xié)議下補(bǔ)養(yǎng)ES細(xì)胞，假定轉(zhuǎn)基因提供了這種選擇的方式，這種ES細(xì)胞已經(jīng)合并了轉(zhuǎn)基因。 可選地，可以使用聚合酶鏈反應(yīng)篩選已經(jīng)合并轉(zhuǎn)基因的ES細(xì)胞。這種技術(shù)消除了在轉(zhuǎn)染的ES細(xì)胞轉(zhuǎn)移入囊胚腔前在適當(dāng)?shù)倪x擇條件下生長的需求。在還其他的實(shí)施方案中，使用同源重組敲除基因功能或產(chǎn)生缺失突變體(例如，截?cái)嗤蛔凅w)。同源重組的方法在美國專利號(hào)5，614，396中描述，其內(nèi)容通過引用納入本文。
具體實(shí)施例方式提供以下實(shí)施例以說明并進(jìn)一步闡述指定優(yōu)選的實(shí)施方案和本發(fā)明的方面，并不旨在限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I尿液中發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物一般方法對(duì)前列腺癌的代謝特征的鑒定分析每個(gè)樣本以確定幾百種代謝物的濃度。實(shí)用分析技術(shù)諸如GC_MS(氣相色譜-質(zhì)譜測定法)和UHPLC-MS (超高效液相色譜-質(zhì)譜測定法)來分析代謝物。同時(shí)并聯(lián)分析多種等份并在適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量管理(QC)后，重組從每個(gè)分析中得到的信息。根據(jù)最終歸結(jié)為幾百種化學(xué)物種的幾千種特性給予每個(gè)樣本特征。使用的技術(shù)能夠鑒定新的化學(xué)上未命名的化合物。統(tǒng)計(jì)分析使用t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)以鑒定分子(已知命名的代謝物或未命名的代謝物)，其以不同水平存在于可限定的群體或亞群體(例如，與對(duì)照生物學(xué)樣本相比，前列腺癌生物學(xué)樣本的生物標(biāo)志物)中，用于區(qū)別可限定群體(例如，前列腺癌和對(duì)照，低級(jí)前列腺癌和高級(jí)前列腺癌)。也鑒定在可限定群體或亞群體中的其他分子(已知命名的代謝物或未命名的代謝物)。在某些分析中，根據(jù)樣本中的肌酐水平標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，而在其他分析中未標(biāo)準(zhǔn)化樣本。兩種分析的結(jié)果都包括在內(nèi)。生物標(biāo)志物的鑒定在分析(例如GC-MS、UHPLC-MS、MS_MS)中鑒定的不同峰值包括那些鑒定為統(tǒng)計(jì)性顯著的峰值進(jìn)行以化學(xué)鑒定過程為基礎(chǔ)的質(zhì)譜測定法。通過(I)分析來自不同組人類受試者的尿液樣本以確定樣本中代謝物的水平，然后(2)統(tǒng)計(jì)性分析結(jié)果以確定在兩組中差別存在的那些代謝物來發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物。區(qū)分癌癥和非癌癥的生物標(biāo)志物用于分析的尿液樣本來自51個(gè)具有前列腺癌陰性活檢的對(duì)照個(gè)體和59個(gè)罹患前 列腺癌的個(gè)體。在確定代謝物的水平后，使用Wilcoxon檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)以確定在兩個(gè)群體(例如，前列腺癌vs.對(duì)照)中代謝物平均水平的不同。如下表I所列出的，發(fā)現(xiàn)了從罹患前列腺癌的受試者和具有前列腺活檢(例如，未診斷出前列腺癌)的受試者中取得的血漿樣本中差別存在的生物標(biāo)志物。針對(duì)每個(gè)列出的生物標(biāo)志物，表I包括在與生物標(biāo)志物相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析中確定的P值、用于追蹤化學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)中的化合物的化合物ID，其用于鑒別化合物(GC是指GC/MS，而且LC是指UHPLC/MS/MS2)。以O(shè). 000列出的P值在p < O. 0001處是顯著的。LC陽和LC陰是指使用緩沖液和分別檢測陽性離子或陰性離子的優(yōu)化的參數(shù)的UHPLC離析。表I.用于區(qū)別癌癥和非癌癥的生物標(biāo)志物。
權(quán)利要求
1.一種診斷前列腺癌的方法，包括 a)檢測受試者的尿液樣本中肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的水平；和 b)當(dāng)肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的水平比非癌癥受試者中的水平更高時(shí)，診斷前列腺癌。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括檢測一種或多種代謝物水平的步驟，所述代謝物選自由乙酰氨基葡糖、犬尿胺酸、尿嘧啶、高半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、牙精胺、精胺、2-氨基己二酸、亮氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、馬來酸鹽、組氨酸、瓜氨酸、腺苷和肌苷組成的組中。
3.—種診斷乳腺癌的方法，包括 a)檢測受試者樣本中一種或多種癌癥特異性代謝物的存在或缺失，所述癌癥特異性代謝物選自由哌可酸、絲氨酸、聚胺和脂肪酸組成的組；和 b)基于所述一種或多種癌癥特異性代謝物的存在或缺失診斷乳腺癌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述聚胺選自由腐胺、牙精胺和精胺組成的組中。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述脂肪酸選自由肉豆蘧酸、棕櫚酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸和油酸組成的組中。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述樣本選自由組織樣本、血液樣本、血清樣本和尿液樣本組成的組中。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述組織樣本是活檢樣本。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述一種或多種癌癥特異性代謝物存在于癌癥樣本中，但不存在于非癌癥樣本中。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述一種或多種癌癥特異性代謝物不存于癌癥樣本中，但存在于非癌癥樣本中。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，包括同時(shí)檢測一種以上所述癌癥特異性代謝物的存在或缺失。
11.一種斷前列腺癌的方法，包括 a)檢測受試者尿液樣本中一種或多種癌癥特異性代謝物的存在或缺失，所述癌癥特異性代謝物選自由哌可酸、絲氨酸、聚胺和脂肪酸組成的組；和 b)基于在所述尿液樣本中的所述癌癥特異性代謝物的存在或缺失診斷前列腺癌。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述聚胺選自由腐胺、牙精胺和精胺組成的組。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述脂肪酸選自由肉豆蘧酸、棕櫚酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸和油酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述尿液樣本是尿沉渣樣本。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述一種或多種癌癥特異性代謝物存在于癌癥樣本中，但不存在于非癌癥樣本。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述一種或多種癌癥特異性代謝物不存在于癌癥樣本中，但存在于非癌癥樣本中。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，包括一種以上所述癌癥特異性代謝物的存在或缺失的同 時(shí)檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及癌癥標(biāo)志物。特別地，本發(fā)明提供在癌癥(例如，前列腺癌或乳腺癌)中差別存在的代謝物和代謝物組。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102893157SQ201080064533
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者A.M.錢奈延, T.拉詹迪蘭 申請(qǐng)人:密執(zhí)安大學(xué)評(píng)議會(huì)