專利名稱：免疫鑒定腦脊液的裝置和方法
免疫鑒定腦脊液的裝置和方法與相關(guān)申請的交叉引用本申請是2009年8月7日提交的美國臨時(shí)申請No. 61/232，033 (其通過整體引用并入本文)的正式申請。公開領(lǐng)域本公開內(nèi)容涉及樣品中是否存在腦脊液(cerebrospinal fluid, CSF)的檢測，其通過檢測與在其他體液中的水平相比在CSF中富集的一種或更多種蛋白質(zhì)來進(jìn)行。本文描述了用于檢測來自跨種族、年齡、性別、健康狀態(tài)和遺傳變異的廣泛人群的混合體液樣品中是否存在腦脊液的裝置和方法。背景腦脊液(CSF)或腦脊髓液(liquor cerebrospinalis)存在于蛛網(wǎng)膜下腔以及圍繞并穿過中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的腔室中。腦和脊髓浸泡于CSF中，CSF向神經(jīng)元和膠質(zhì)提供水分、營養(yǎng)、代謝廢物的去除和靜液沖擊的緩沖。CSF通過擴(kuò)散、胞飲和主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的組合過程通過側(cè)腦室和第四腦室的脈絡(luò)叢從動(dòng)脈血中產(chǎn)生。該流體還包含產(chǎn)生自神經(jīng)元和膠質(zhì)的成分。在通過腦室系統(tǒng)擴(kuò)散至蛛網(wǎng)膜下腔后，大部分CSF經(jīng)硬腦膜靜脈叢被蛛網(wǎng)膜顆粒重吸收進(jìn)入血流。每天產(chǎn)生約500ml的腦脊液；成人的總體積為140-150ml，總CSF每6_8小時(shí)更新。在整個(gè)CNS中CSF與硬腦膜連接。大部分流體在吻端CNS產(chǎn)生，而且大部分最終在尾端脊髓排出，形成吻端至尾端的凈流體流。CSF是等滲混合物，大部分成分為鹽、葡萄糖、 蛋白質(zhì)和水。來自腰區(qū)(lumbar region)的CSF含有15至45mg/dl蛋白質(zhì)(0.3-1%血清蛋白質(zhì)濃度)和50-80mg/dl葡萄糖(60%血液葡萄糖)。腦池和腦室CSF中的蛋白質(zhì)濃度較低。CSF中的蛋白質(zhì)類型可以分為兩類構(gòu)成健康個(gè)體CSF的主要成分的血液來源蛋白，以及腦來源蛋白。CSF中約20 %的蛋白質(zhì)來源于腦實(shí)質(zhì)，但其中只有一部分是腦特異的。盡管事實(shí)上大部分腦脊液蛋白質(zhì)也存在于血清中，但是多種蛋白質(zhì)來源是CSF特有的從神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞釋放的蛋白質(zhì)，例如tau蛋白、S-100和神經(jīng)元特異性烯醇酶 (neuron-specific enolase, NSE)。從軟腦膜(1印tomeniges)釋放的蛋白質(zhì)，例如β -微量蛋白(β -trace protein) 和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C(cyStatin C)。在脈絡(luò)叢中進(jìn)行合成期間被糖基化或磷酸化差異性修飾的蛋白質(zhì)，例如運(yùn)甲狀腺素蛋白(transthyretin，TTR)、血管緊張肽II和胰島素樣生長因子II。CSF和血漿的蛋白質(zhì)譜有很大的重合，有相當(dāng)數(shù)目的蛋白質(zhì)是CSF特有的，或者在 CNS中通過磷酸化或糖基化獨(dú)特地修飾。設(shè)計(jì)側(cè)向流測試(Lateral Flow Test)(或者也稱為側(cè)向流免疫色譜測定或試條測試)來快速檢測異質(zhì)基質(zhì)中是否存在給定分析物。目前市場上有多種側(cè)向流測試用于家用測試、即時(shí)測試(point of care testing)或?qū)嶒?yàn)室使用，例如懷孕測試(例如FirstResponse ，ClearBlue )、HIV 測試(例如 OraQuick ADVANCE ，Clearview Complete)或衣原體測試(例如 Clearview Chlamydia，inSTIcheck Chlamydia)。需要與HIV 測試(如 OraQuick ADVANCE 或 Clearview Complete)類似的適于檢測CSF的測試它是即時(shí)測試；該測試僅是定性的；操作者使用該測試僅需最低程度的訓(xùn)練；該測試在試片上有內(nèi)部對照以確認(rèn)準(zhǔn)確取樣。概述在一個(gè)實(shí)施方案中，用于檢測樣品中是否存在腦脊液的裝置包含樣品施加區(qū)，樣品標(biāo)記區(qū)，其包含針對CSF富集蛋白(CSF-enriched protein)的第一抗體，其中所述第一抗體與流動(dòng)顆粒綴合；樣品檢測區(qū)，其包含針對所述CSF富集蛋白的第二抗體，其中將所述第二抗體固定到所述樣品檢測區(qū)，其中在第二區(qū)存在可檢測條帶指示所述樣品中存在腦脊液。在另一實(shí)施方案中，檢測樣品中是否存在CSF的方法包括將所述樣品與對CSF富集蛋白特異的結(jié)合伴侶(binding partner)接觸，以及檢測結(jié)合伴侶-CSF富集蛋白復(fù)合物是否存在，其中可檢測復(fù)合物的存在指示所述樣品中存在CSF。在上述實(shí)施方案中，所述CSF抗原是神經(jīng)細(xì)胞粘附分子樣蛋白同工型1(SEQ ID NO :1 ；登錄號(hào)gi :62088238)；鏈A，與牛胰胰蛋白酶抑制劑(Bpti)復(fù)合的人中胰蛋白酶(Mesotrypsin) (SEQ ID NO :2 ；登錄號(hào) gi 162330095) ；CNTN2 接觸蛋白 _2 前體(SEQ ID NO :3 ；登錄號(hào) gi I 4827022) ；CNTNl 接觸蛋白 _1 的同工型 2 (SEQ ID NO 4 ；登錄號(hào)gi:28373119)；與SPARC樣蛋白1高度相似的cDNA(未命名的蛋白質(zhì)產(chǎn)物) (SEQ ID NO :5 ；登錄號(hào)gi 1194388050) ；NRCAM蛋白(神經(jīng)元細(xì)胞粘附分子)[人(Homo sapiens)]可能的稍長片段( 96kDa)(登錄號(hào)SEQ ID NO :6 ;gi | 68534652 和 SEQ ID NO 7 ；gi 1109731501) ；NCAM2神經(jīng)細(xì)胞粘附分子2，同工型CRA_a(SEQ ID N0:8;登錄號(hào) gi 1119630409) ；SERPINA3絲氨酸蛋白酶抑制因子肽酶抑制因子，進(jìn)化枝A，成員3前體/ α 1-抗胰凝乳蛋白酶的同工型1/生長抑制蛋白25[人]或α 1_抗胰凝乳蛋白酶前體的稍長片段(SEQ ID NO :9;登錄號(hào)gi I 46981961) ；AGT血管緊張肽原(SEQ ID NO 10 ；登錄號(hào)gi 1553181)；血管緊張肽原前體(絲氨酸蛋白酶抑制因子(Serpin)AS) (SEQ ID NO=Il ； 登錄號(hào)gi|4557^7)；未命名的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，也稱為免疫球蛋白超家族，成員4B;在人中也稱為細(xì)胞粘附分子 3 (SEQ ID NO 12 ；登錄號(hào) gi 1187608363) ；cDNA FLJ59893, dickkopf 同源物3前體(SEQ ID NO 13 ；登錄號(hào)gi | 40548389) ；SERPINF1絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制因子，進(jìn)化枝F( α-2抗纖溶酶(antiplasmin)，色素上皮衍生因子，Pedf)，成員1 同工型4因子(SEQ ID NO :14;登錄號(hào)gi 115988024)；與GC維生素D結(jié)合蛋白相似的人蛋白質(zhì)，預(yù)測為維生素D結(jié)合蛋白[黑猩猩(Pan troglodytes)] (SEQ ID NO :15 ；登錄號(hào) 181482) ；CD14 人單核細(xì)胞抗原 CD14(CD14) (SEQ ID NO :16 ；登錄號(hào) gi 1117646212) ；CADM3 人細(xì)胞粘附分子3(CADM3)，轉(zhuǎn)錄變體1(SEQ ID NO 17 ；登錄號(hào)gi | 90080503 ； SEQ ID N0: 18 ;gi 1187608363(人)；神經(jīng)細(xì)胞粘附分子變體(SEQ ID NO :19 ；登錄號(hào) gi :62088238)； 與CLU cDNA FLJ57622相似的未命名蛋白質(zhì)，與簇蛋白高度相似(SEQ ID NO :20 ；登錄號(hào)gi 1189054091)；與簇蛋白高度相似的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO :21 ；登錄號(hào)gi 1193787502)； LMAN2囊泡整合膜蛋白(Vesicular integral-membrane protein) VIP36 (SEQ ID NO :22 ；登錄號(hào)gi 11578；34800)；簇蛋白同工型1 [人](SEQ ID NO :23 ；登錄號(hào)NM_001831. 2)；超氧化物歧化酶3，細(xì)胞外前體(SEQ ID NO :24;登錄號(hào)gi 1118582275)；纖維蛋白α C端片段(SEQ ID NO 25 ；登錄號(hào)gi I 223057)；鏈A，人激肽釋放酶6 (Hk6)活化形式或KLK6激肽釋放酶6 的同工型1(SEQ ID NO :26;登錄號(hào)gi I 21465970) ；APCS血清淀粉樣P成分/鏈A或五聚體人血清淀粉樣P成分(SEQ ID NO 27 ；登錄號(hào)gi | 576259) ；FAM3C蛋白FAM3C/序列相似家族3，成員C前體[人]note="預(yù)測的成骨細(xì)胞蛋白；白介素樣EMT誘導(dǎo)因子(SEQ ID NO 28 ；登錄號(hào)gi I 556^272)；與未命名蛋白質(zhì)產(chǎn)物[食蟹猴(Macaca fascicularis)]相似的蛋白質(zhì)，也稱為免疫球蛋白超家族，成員4B，在人中也稱為細(xì)胞粘附分子3(SEQ ID NO 29 ；登錄號(hào)gi 1187608363)；上述CSF抗原的CSF富集磷酸化或去磷酸化形式；或者兩種或更多種上述CSF抗原的組合。在另一實(shí)施方案中，在體液、組織或微生物中檢測反應(yīng)物(reactant)的方法包括將所述體液、組織或微生物與兩種或更多種抗體接觸，其中每種抗體與所述反應(yīng)物中的抗原特異地反應(yīng)，其中與單種抗體的反應(yīng)不指示所述反應(yīng)物的陽性測試，以及其中與所述兩種或更多種抗體的反應(yīng)指示所述反應(yīng)物的陽性測試。附圖簡述

圖1是側(cè)向流測定。通過滴管或通過直接浸蘸來將分析物添加到試片的左端。液體(約75 μ 1)被吸過試片到達(dá)右端。綴合物墊包含與可視顆粒(即金或膠乳微球)結(jié)合的可溶IgG。如果分析物溶液含有分析物，抗體綴合并且復(fù)合物沿試片遷移?；旌衔锸紫冉佑|測試試片，其包含針對所述分析物的固定化抗體。然后分析物、可溶第一和可視標(biāo)簽與測試線結(jié)合。如果不存在分析物，可溶成分流過測試線。無論是否存在分析物，與指示劑結(jié)合的過量可溶IgG與結(jié)合至固定化抗球蛋白IgG相結(jié)合，所述抗球蛋白IgG與對照試片結(jié)合。圖2顯示CSF檢測的多抗原方法的優(yōu)勢。上圖顯示多種測試條件的單抗原測定結(jié)果，下圖顯示多抗原測定的結(jié)果。沿X軸的柱表示不同的測定條件，Y軸表示測定顯示的免疫反應(yīng)性程度。上方陰影區(qū)表示在側(cè)向流測定的測試線上有陽性比色反應(yīng)。免疫反應(yīng)性進(jìn)入陰影區(qū)的測定產(chǎn)生陽性測試結(jié)果。柱1 上圖的CSF柱表明單個(gè)抗原的免疫反應(yīng)性足以產(chǎn)生陽性測試結(jié)果?；蛘咴诙嗫乖瓐D(下方)中，每個(gè)產(chǎn)生部分信號(hào)的抗原組合累積產(chǎn)生陽性測定結(jié)果。柱2 被血液污染的CSF產(chǎn)生類似的陽性反應(yīng)，具有較小但疊加的血液免疫反應(yīng)性(上方粗邊柱)。柱3:異常CSF/血液樣品，其中抗原1免疫反應(yīng)性弱。在單個(gè)抗原測定中，測定產(chǎn)生假陰性，但由于其他5種抗原的免疫反應(yīng)性未減弱，多抗原測定仍高于測定閾值。柱4 不具抗原1的免疫反應(yīng)性的CSF/血液。與柱3的結(jié)果相同。柱5 無CSF但血液中含有交叉反應(yīng)性抗原。在這種情況下，單個(gè)抗原測定產(chǎn)生加陽性，但是由于單個(gè)抗原的免疫反應(yīng)性不足以在多抗原測定中產(chǎn)生陽性信號(hào)，測定產(chǎn)生正確的陰性結(jié)果。柱6 無CSF 但抗原1的血液水平病理性升高。單抗原測定產(chǎn)生與升高的血液水平反應(yīng)的假陽性。多抗原測定與血液中的病原性抗原1水平反應(yīng)，但未達(dá)到假陽性的閾值。該測定用5種抗原/ 抗體1/抗體2的混合進(jìn)行，但另一些實(shí)施方案可以包含2至多達(dá)10種的抗原/抗體1/抗體2混合。圖3 =CSF和血液蛋白質(zhì)的二維凝膠電泳。單個(gè)試驗(yàn)的實(shí)例，其中對100 μ g的Cy標(biāo)簽化CSF蛋白(A)與100 μ g的Cy3標(biāo)簽化血液蛋白(B)進(jìn)行二維分離。A和B是使用不同激發(fā)和發(fā)射條件的同一凝膠的灰度圖。pH范圍為4-8。C)是兩通道的RGB合并，其中黃色點(diǎn)表示顯著重疊。D)是CSF或血液中富集>5倍的點(diǎn)的自動(dòng)提取。所有樣品均2次耗盡 (depleted)主要血清/CSF蛋白(參見方法部分)。圖4 一些圖3凝膠所示的CSF富集點(diǎn)的液相色譜-質(zhì)譜分析。圖5 =CSF富集蛋白FLJ55和dickkopf同源物3前體(DKK3)。A)FLJ55的免疫印跡。針對FLJ55的重組片段產(chǎn)生的親和純化多克隆兔抗人抗體在CSF樣品但不在血清樣品中在正確的分子量處產(chǎn)生免疫反應(yīng)性。B)針對DKK3的重組片段產(chǎn)生的親和純化多克隆兔抗人抗體也在CSF樣品但不在血清樣品中在正確的分子量處產(chǎn)生免疫反應(yīng)性。在兩種情況下，過量的血清蛋白以高于血清的水平上樣。C) 4個(gè)獨(dú)立的CSF樣品表明DKK2與不同的親和純化抗體的免疫反應(yīng)性(左)。5個(gè)血液樣品未能產(chǎn)生免疫反應(yīng)性。泳道5的血液有高的非特異性背景。圖6 :CSF中高度富集的血管緊張肽原的磷酸化形式。Cy3血液(綠色)和 Cy5CSF (紅色)的RGB合并。我們鑒定出幾種在血液中不存在的不重疊的新磷酸化形式(右邊4個(gè)紅色點(diǎn))。在CSF和血液中存在至少3個(gè)其他組合(左邊3個(gè)點(diǎn))。圖7 :CSF特異性翻譯后修飾。去除所有經(jīng)提取蛋白質(zhì)的二級(jí)修飾之前(上圖)和之后(中圖)，CSF 2D凝膠蛋白質(zhì)分布圖譜的變化。下圖的紅點(diǎn)指示去除翻譯后修飾后，特定蛋白質(zhì)信號(hào)的降低。圖8 產(chǎn)生CSF檢測測試試片的實(shí)驗(yàn)流程圖。圖9 磷酸化的CSF蛋白。進(jìn)行單個(gè)DIGE凝膠電泳，其中兩個(gè)樣品為耗盡血清蛋白的CSF。A)在堿性磷酸酶中孵育了 1小時(shí)的CSF樣品的Cy3標(biāo)記蛋白質(zhì)。B)耗盡了血清蛋白的CSF的等同樣品，其未用堿性磷酸酶處理。C)計(jì)算機(jī)生成的兩個(gè)凝膠(A相比于B) 點(diǎn)體積之間的差異(藍(lán)邊)。所有藍(lán)點(diǎn)代表磷酸化的CSF蛋白。詳述本文描述了與在其他體液中相比在CSF中富集的蛋白質(zhì)，以及通過檢測這些蛋白質(zhì)來檢測樣品中是否存在腦脊液(CSF)的方法。本文還描述了在跨種族、年齡、性別、健康狀態(tài)和遺傳變異的廣泛人群的混合體液樣品中檢測是否存在CSF的裝置和方法。用特異性蛋白結(jié)合伴侶(如抗體、配體、受體等)檢測CSF富集蛋白。結(jié)合伴侶可以是天然或合成的結(jié)合伴侶?？梢灾苯踊蜷g接地檢測結(jié)合，例如用連接至結(jié)合伴侶的熒光標(biāo)記。盡管所包含的幾個(gè)實(shí)施方案使用抗體作為結(jié)合伴侶，應(yīng)理解可以使用其他結(jié)合伴侶替代抗體。在一些實(shí)施方案中，對CSF富集蛋白的水平進(jìn)行定量。該定量對鑒定腦損傷尤其有用?？梢允褂镁哂锌蓹z測標(biāo)記之結(jié)合伴侶進(jìn)行定量?！翱蓹z測部分”或“標(biāo)記”是指可通過光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)方式檢測的組合物。可用的標(biāo)記包括32P、35S、 熒光染料、電子致密試劑、酶(例如ELISA中通常使用的)、生物素-鏈霉親和素、地高辛 (dioxigenin)、可獲得抗血清或單克隆抗體的半抗原和蛋白質(zhì)。可檢測部分通常產(chǎn)生可測量的信號(hào)，如可用來對樣品中結(jié)合的可檢測部分的量進(jìn)行定量的放射活性、生色或熒光信號(hào)。可檢測部分可以共價(jià)地或通過離子、范德華相互作用或氫鍵摻入或連接至結(jié)合伴侶?？蓹z測部分可以被直接或間接地檢測。間接檢測可以包括將直接或間接第二可檢測部分與所述可檢測部分結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，使用側(cè)向流測定使用如對目的CSF蛋白特異的抗體進(jìn)行CSF 檢測。側(cè)向流測定可以是單抗原測定或多抗原測定。在一個(gè)實(shí)施方案中，多抗原測試使用所有抗原一起提供單個(gè)易讀結(jié)果(即試片測定中的單個(gè)條帶)。在另一實(shí)施方案中，多抗原測定對幾種抗原的每個(gè)進(jìn)行定性或定量測試，以給出所存在抗原的更復(fù)雜圖譜。該圖譜可用于測定頭部損傷的嚴(yán)重性，即當(dāng)某些CSF特異蛋白質(zhì)存在時(shí)頭部損傷嚴(yán)重性低，當(dāng)另一些CSF特異性蛋白質(zhì)存在時(shí)嚴(yán)重性高，或者每種蛋白質(zhì)的水平均給出損傷程度。單抗原測定盡管許多臨床測定已成功地使用了側(cè)向流技術(shù)，本文所述的獨(dú)特和創(chuàng)新方法對該技術(shù)有如下擴(kuò)展i)結(jié)合單種或多種CSF富集蛋白，從而增加測試的敏感性和特異性，和/ 或ii)檢測CSF特異性翻譯后修飾(例如磷酸化)。本文所用CSF富集蛋白或者CSF抗原或多肽是對CSF特異或者與其他體液相比在 CSF中大量富集的抗原或多肽。表1給出了已知在CSF中濃度高的幾種蛋白質(zhì)。這些不是本申請鑒定出的蛋白質(zhì)，盡管在一些實(shí)施方案中，它們可以在多抗原測定中與本文鑒定的一種或更多種本文鑒定的蛋白質(zhì)在測定中組合。表 權(quán)利要求
1.用于檢測樣品中是否存在腦脊液的裝置，其包含樣品施加區(qū)，樣品標(biāo)記區(qū)，其包含針對CSF富集蛋白的第一抗體，其中所述第一抗體與流動(dòng)顆粒綴合；樣品檢測區(qū)，其包含針對所述CSF富集蛋白的第二抗體，其中將所述第二抗體固定到所述樣品檢測區(qū)，其中在第二區(qū)存在可檢測條帶指示所述樣品中存在腦脊液。其中所述CSF富集蛋白是神經(jīng)細(xì)胞粘附分子樣蛋白同工型1 (SEQ ID N0:1;登錄號(hào) gi :62088238)；鏈A，與牛胰胰蛋白酶抑制劑(Bpti)復(fù)合的人中胰蛋白酶(SEQ ID NO 2 ；登錄號(hào) gi :162330095) ；CNTN2 接觸蛋白-2 前體(SEQ ID NO :3 ；登錄號(hào) gi | 4827022)； CNTm接觸蛋白-1的同工型2 (SEQ ID NO :4 ；登錄號(hào)gi 28373119)；與SPARC樣蛋白1高度相似的cDNA(未命名的蛋白質(zhì)產(chǎn)物)(SEQ ID NO :5 ；登錄號(hào):gi 1194388050) ；NRCAM蛋白 (神經(jīng)元細(xì)胞粘附分子)[人(Homo sapiens)]可能的稍長片段( 96kDa)(登錄號(hào)SEQ ID NO 6 ；gi |68534652 和 SEQ ID NO 7 ；gi 1109731501) ；NCAM2 神經(jīng)細(xì)胞粘附分子 2，同工型CRA_a(SEQ ID NO 8 ；登錄號(hào)gi 1119630409) ；SERPINA3絲氨酸蛋白酶抑制因子肽酶抑制因子，進(jìn)化枝A，成員3前體/α 1-抗胰凝乳蛋白酶的同工型1/生長抑制蛋白25[人] 或α 1-抗胰凝乳蛋白酶前體的稍長片段(SEQ ID NO 9 ；登錄號(hào)gi|46981961) ；AGT血管緊張肽原(SEQ ID N0:10;登錄號(hào)gi|553181)；血管緊張肽原前體(絲氨酸蛋白酶抑制因子A8)(SEQ ID N0:11 ；登錄號(hào)gi|4557^7)；未命名的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，也稱為免疫球蛋白超家族，成員4B ；在人中也稱為細(xì)胞粘附分子3 (SEQ ID NO 12 ；登錄號(hào)gi 1187608363) ；cDNA FLJ59893, dickkopf 同源物 3 前體(SEQ ID NO 13 ；登錄號(hào) gi | 40548389) ；SERPINF1 絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制因子，進(jìn)化枝F(a_2抗纖溶酶，色素上皮衍生因子，Pedf)，成員1同工型4因子(SEQ ID NO 14 ；登錄號(hào)gi 115988024)；與GC維生素D結(jié)合蛋白相似的人蛋白質(zhì)，預(yù)測為維生素D結(jié)合蛋白[黑猩猩(Pan troglodytes)] (SEQ ID NO :15 ；登錄號(hào) 181482) ；CD14 人單核細(xì)胞抗原 CD14(CD14) (SEQ ID NO :16 ；登錄號(hào) gi 1117646212) ；CADM3 人細(xì)胞粘附分子3(CADM3)，轉(zhuǎn)錄變體1 (SEQ ID NO 17 ；登錄號(hào)gi | 90080503 ；SEQ ID NO 18 ;gi 1187608363(人)；神經(jīng)細(xì)胞粘附分子變體(SEQ ID NO :19 ；登錄號(hào) gi :62088238)； 與CLU cDNA FLJ57622相似的未命名蛋白質(zhì)，與簇蛋白高度相似(SEQ ID NO :20 ；登錄號(hào)gi 1189054091)；與簇蛋白高度相似的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO :21 ；登錄號(hào)gi 1193787502)； LMAN2囊泡整合膜蛋白VIP36(SEQ ID NO :22 ；登錄號(hào)gi 1157834800)；簇蛋白同工型1 [人] (SEQ ID NO :23 ；登錄號(hào)NM_001831. 2)；超氧化物歧化酶3，細(xì)胞外前體(SEQ ID NO :24 ； 登錄號(hào)gi 1118582275)；纖維蛋白α C端片段(SEQ ID NO :25 ；登錄號(hào)gi | 223057)；鏈A， 人激肽釋放酶6 (Hk6)活化形式或KLK6激肽釋放酶6的同工型1 (SEQ ID NO 26 ；登錄號(hào) gi I 21465970) ；APCS血清淀粉樣P成分/鏈A或五聚體人血清淀粉樣P成分(SEQ ID N0 27 ；登錄號(hào)gi I 576259) ；FAM3C蛋白FAM3C/序列相似家族3，成員C前體[人]note =“預(yù)測的成骨細(xì)胞蛋白；白介素樣EMT誘導(dǎo)因子(SEQ ID N0:28 ；登錄號(hào)gi | 556^272)；與未命名蛋白質(zhì)產(chǎn)物[食蟹猴(Macaca fascicularis)]相似的蛋白質(zhì)，也稱為免疫球蛋白超家族，成員4B，在人中也稱為細(xì)胞粘附分子3(SEQ ID NO :29 ；登錄號(hào)gi 1187608363)；上述CSF 抗原的CSF富集磷酸化或去磷酸化形式；或者兩種或更多種上述CSF抗原的組合。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述裝置包含2至10種不同的抗體，它們每種與不同的CSF 富集蛋白特異地結(jié)合。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述裝置提供單個(gè)的組合結(jié)果，或者所述裝置對每種抗體提供單獨(dú)的結(jié)果。
4.權(quán)利要求2的方法，其中使用低于閾值水平的每種抗體。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述裝置包含4至10種不同的抗體，它們每種與不同的CSF 富集蛋白特異地結(jié)合，而且其中陽性測試不需要與所有抗體結(jié)合。
6.權(quán)利要求1的方法，其還包括對所述樣品中CSF富集蛋白的水平進(jìn)行定量。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述針對CSF富集蛋白的第一抗體與所述CSF富集蛋白中的翻譯后修飾結(jié)合。
8.檢測樣品中是否存在CSF的方法，其包括將所述樣品與對CSF富集蛋白特異的結(jié)合伴侶接觸，以及檢測結(jié)合伴侶-CSF富集蛋白復(fù)合物是否存在，其中可檢測復(fù)合物的存在指示所述樣品中存在CSF;其中所述CSF富集蛋白是神經(jīng)細(xì)胞粘附分子樣蛋白同工型1(SEQ ID N0:1;登錄號(hào) gi :62088238)；鏈A，與牛胰胰蛋白酶抑制劑(Bpti)復(fù)合的人中胰蛋白酶(SEQ ID NO 2 ；登錄號(hào) gi :162330095) ；CNTN2 接觸蛋白-2 前體(SEQ ID NO :3 ；登錄號(hào) gi | 4827022)； CNTm接觸蛋白-1的同工型2 (SEQ ID NO :4 ；登錄號(hào)gi 28373119)；與SPARC樣蛋白1高度相似的cDNA(未命名的蛋白質(zhì)產(chǎn)物)(SEQ ID NO :5 ；登錄號(hào):gi 1194388050) ；NRCAM蛋白 (神經(jīng)元細(xì)胞粘附分子)[人(Homo sapiens)]可能的稍長片段( 96kDa)(登錄號(hào)SEQ ID NO 6 ；gi |68534652 和 SEQ ID NO 7 ；gi 1109731501) ；NCAM2 神經(jīng)細(xì)胞粘附分子 2，同工型CRA_a(SEQ ID NO :8 ；登錄號(hào)gi 1119630409) ；SERPINA3絲氨酸蛋白酶抑制因子肽酶抑制因子，進(jìn)化枝A，成員3前體/α 1-抗胰凝乳蛋白酶的同工型1/生長抑制蛋白25[人] 或α 1-抗胰凝乳蛋白酶前體的稍長片段(SEQ ID NO :9 ；登錄號(hào)gi | 46981961) ；AGT血管緊張肽原(SEQ ID N0:10;登錄號(hào)gi|553181)；血管緊張肽原前體(絲氨酸蛋白酶抑制因子A8)(SEQ ID N0:11 ；登錄號(hào)gi|4557^7)；未命名的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，也稱為免疫球蛋白超家族，成員4B ；在人中也稱為細(xì)胞粘附分子3 (SEQ ID NO 12 ；登錄號(hào)gi 1187608363) ；cDNA FLJ59893, dickkopf 同源物 3 前體(SEQ ID NO 13 ；登錄號(hào) gi | 40548389) ；SERPINF1 絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制因子，進(jìn)化枝F(a_2抗纖溶酶，色素上皮衍生因子，Pedf)，成員1同工型4因子(SEQ ID NO 14 ；登錄號(hào)gi 115988024)；與GC維生素D結(jié)合蛋白相似的人蛋白質(zhì)，預(yù)測為維生素D結(jié)合蛋白[黑猩猩(Pan troglodytes)] (SEQ ID N0:15;登錄號(hào) 181482) ；CD14 人單核細(xì)胞抗原 CD14(CD14) (SEQ ID NO :16 ；登錄號(hào) gi 1117646212) ；CADM3 人細(xì)胞粘附分子3(CADM3)，轉(zhuǎn)錄變體1 (SEQ ID NO 17 ；登錄號(hào)gi | 90080503 ； SEQ ID NO 18 ;gi 1187608363(人)；神經(jīng)細(xì)胞粘附分子變體(SEQ ID NO 19 ；登錄號(hào) gi 62088238)； 與CLU cDNA FLJ57622相似的未命名蛋白質(zhì)，與簇蛋白高度相似(SEQ ID NO :20 ；登錄號(hào)gi 1189054091)；與簇蛋白高度相似的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO :21 ；登錄號(hào)gi 1193787502)； LMAN2囊泡整合膜蛋白VIP36(SEQ ID NO :22 ；登錄號(hào)gi 1157834800)；簇蛋白同工型1 [人] (SEQ ID NO :23 ；登錄號(hào)NM_001831. 2)；超氧化物歧化酶3，細(xì)胞外前體(SEQ ID NO :24 ； 登錄號(hào)gi 1118582275)；纖維蛋白aC端片段(SEQ ID NO :25 ；登錄號(hào)gi | 223057)；鏈A，人激肽釋放酶6 (Hk6)活化形式或KLK6激肽釋放酶6的同工型1 (SEQ ID NO 26 ；登錄號(hào) gi I 21465970) ；APCS血清淀粉樣P成分/鏈A或五聚體人血清淀粉樣P成分(SEQ ID NO 27 ；登錄號(hào)gi I 576259) ；FAM3C蛋白FAM3C/序列相似家族3，成員C前體[AJnote =“預(yù)測的成骨細(xì)胞蛋白；白介素樣EMT誘導(dǎo)因子(SEQ ID N0:28 ；登錄號(hào)gi | 556^272)；與未命名蛋白質(zhì)產(chǎn)物[食蟹猴(Macaca fascicularis)]相似的蛋白質(zhì)，也稱為免疫球蛋白超家族，成員4B，在人中也稱為細(xì)胞粘附分子3 (SEQ ID NO :29 ；登錄號(hào)gi 1187608363)；上述CSF 抗原的CSF富集磷酸化或去磷酸化形式；或者兩種或更多種上述CSF抗原的組合。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述結(jié)合伴侶包含可檢測標(biāo)記。
10.權(quán)利要求9的方法，其還包括對所述樣品中結(jié)合伴侶-CSF富集蛋白復(fù)合物進(jìn)行定量。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述結(jié)合伴侶是抗體，而且檢測包括差異性抗體結(jié)合。
12.權(quán)利要求8的方法，其中所述結(jié)合伴侶是抗體而且檢測包括原位免疫測定。
13.權(quán)利要求8的方法，其中所述樣品是組織、血液、血清、血漿、尿液、鼻和耳流出物、 唾液、汗液或淚液。
14.權(quán)利要求8的方法，其中所述樣品來自懷疑有腦損傷的個(gè)體。
15.權(quán)利要求8的方法，其包括將所述樣品與2至10種不同抗體接觸，每種所述抗體與不同的CSF富集蛋白特異地結(jié)合。
16.權(quán)利要求15的方法，其中使用低于閾值水平的每種抗體。
17.權(quán)利要求8的方法，其中所述結(jié)合伴侶是抗體，而且所述測定包括將所述樣品與4 至10種不同抗體接觸，每種所述抗體與不同的CSF富集蛋白特異地結(jié)合，而且其中陽性測試不需要與所有抗體結(jié)合。
18.權(quán)利要求8的方法，其中所述結(jié)合伴侶是與所述CSF富集蛋白中的翻譯后修飾相結(jié)合的抗體。
19.檢測體液、組織或微生物中的反應(yīng)物的方法，其包括將所述體液、組織或微生物與兩種或更多種抗體接觸，其中每種抗體與所述反應(yīng)物中的抗原特異地反應(yīng)，其中與單種抗體的反應(yīng)不指示所述反應(yīng)物的陽性測試，以及其中與所述兩種或更多種抗體的反應(yīng)指示所述反應(yīng)物的陽性測試。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述兩種或更多種抗體與CSF富集蛋白結(jié)合，而且所述測試適于指示樣品中CSF的存在。
全文摘要
本公開內(nèi)容涉及樣品中是否存在腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)的檢測，其通過檢測與在其他體液中的水平相比在CSF中富集的一種或更多種抗原來進(jìn)行。裝置和方法適于在來自跨種族、年齡、性別、健康狀態(tài)和遺傳變異的廣泛人群的混合體液樣品中檢測腦脊液是否存在。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102576019SQ201080045270
公開日2012年7月11日 申請日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日
發(fā)明者文森特·皮埃里博內(nèi) 申請人:親和標(biāo)記技術(shù)公司