專利名稱：用于鑒別和計(jì)數(shù)表達(dá)特定標(biāo)志物的顆粒的多頻阻抗方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)療設(shè)備、醫(yī)療診斷及顆粒計(jì)數(shù)的領(lǐng)域，及更特別地涉及一種用于鑒另Ij (discriminating)、鑒定(identifying)和計(jì)數(shù)不同顆粒的方法和裝置，所述顆粒包括細(xì)菌、病毒、非生物顆粒和細(xì)胞。一個(gè)實(shí)例可為例如表達(dá)特定標(biāo)志物的血細(xì)胞，例如用于鑒另IJ、鑒定和計(jì)數(shù)人類血液中的⑶4+ T淋巴細(xì)胞。另一個(gè)實(shí)例可為表達(dá)不同表面標(biāo)志物的細(xì)菌或病毒。另一個(gè)實(shí)例可為帶有表面標(biāo)志物的的固體顆粒，所述標(biāo)志物可以是抗體，或DNA 或肽的片段。
背景技術(shù)：
微流體系統(tǒng)已在研究細(xì)胞功能、細(xì)胞和組織工程學(xué)、疾病診斷、血液樣品制備和藥物發(fā)現(xiàn)中顯示出獨(dú)特的前景。最近微流體用于從全血中分離純的白細(xì)胞群或白細(xì)胞亞群的用途已吸引了許多對(duì)于即時(shí)診斷的興趣。作為實(shí)例，免疫缺陷疾病(主要是HIV)的診斷用血液分析進(jìn)行。測(cè)定血液中輔助性 T淋巴細(xì)胞的濃度對(duì)于檢測(cè)HIV感染的進(jìn)程是很重要的。因此重要的是檢測(cè)⑶4+和⑶8+T 淋巴細(xì)胞的存在和對(duì)其計(jì)數(shù)。根據(jù)WHO的指導(dǎo)方針，血液中CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)少于200細(xì)胞 /μ 確定為AIDS陽性診斷，并且在多數(shù)情況下被用作需要應(yīng)用抗病毒治療的指示。在CD4+ 計(jì)數(shù)降至200細(xì)胞/μ 以下之前開始抗病毒治療，例如從350細(xì)胞/μ 的閾值開始，是被推薦的，并且⑶4+計(jì)數(shù)500細(xì)胞/μ 的閾值被廣泛用于增加患者臨床監(jiān)控的頻率。用以熒光為基礎(chǔ)的流式細(xì)胞術(shù)(FACS)定量⑶4+Τ淋巴細(xì)胞的水平是目前的金標(biāo)準(zhǔn)。以熒光為基礎(chǔ)的流式細(xì)胞術(shù)復(fù)雜并且設(shè)備昂貴，因此尚未進(jìn)入資源匱乏的地區(qū)，如撒哈拉以南非洲。對(duì)便于使用的即時(shí)的CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)存在需求，例如對(duì)用于發(fā)展中世界。阻抗頻譜法(IS)已被廣泛用于測(cè)量細(xì)胞的電介質(zhì)性質(zhì)，提供膜電容、膜電阻、細(xì)胞質(zhì)傳導(dǎo)率和介電常數(shù)的值。其也可被認(rèn)為是“無標(biāo)記”的分析方法。通常細(xì)胞以懸液形式被測(cè)量，并且所述數(shù)據(jù)代表了種群的平均值。單個(gè)細(xì)胞的電性質(zhì)最初的高速測(cè)量由Coulter 于20世紀(jì)50年代進(jìn)行的。顯示的是使用用單一低頻(或DC)電信號(hào)進(jìn)行的電體積測(cè)量法單獨(dú)的血細(xì)胞可被計(jì)數(shù)和鑒別。在20世紀(jì)70年代Hoffman和Britt發(fā)展了用于單個(gè)細(xì)胞的同時(shí)的低和高頻阻抗分析的宏觀系統(tǒng)，使用微型的具有放置于流體通道中的電極的流通池。X. Cheng 等人 在"Cell detection and counting through cell lysate impedance spectroscopy in microfluidic devices，，Lab Chip, 2007，7，746-755 中描述了計(jì)數(shù)細(xì)胞的電方法，所述方法以測(cè)量從微流體通道內(nèi)表面被固定的細(xì)胞釋放的離子引起的周圍介質(zhì)傳導(dǎo)率的變化為基礎(chǔ)。被固定的細(xì)胞用低傳導(dǎo)率、低滲的介質(zhì)裂解，導(dǎo)致的阻抗變化用表面加工(patterned)的電極測(cè)量以檢測(cè)和定量細(xì)胞數(shù)。如上描述的細(xì)胞裂解的方法對(duì)于檢測(cè)20細(xì)胞μΓ1是足夠靈敏的，并提供了簡(jiǎn)單有效的方法在很多應(yīng)用中用于檢測(cè)和列舉在微流體裝置中的細(xì)胞，包括在資源有限的地區(qū)HIV患者的CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)的測(cè)量。
阻抗頻譜法通常在大的細(xì)胞群上進(jìn)行，所述細(xì)胞通常是混合型的。在其他細(xì)胞的懸液中的CD4+細(xì)胞的分析因此不可能使用該方法。CD4+細(xì)胞可被固定在基質(zhì)上并通過顯微鏡計(jì)數(shù)，但其不是很可靠。雖然細(xì)胞分離方法背后的原理可容易地適于臨床應(yīng)用的寬譜，但是檢測(cè)這些分離的細(xì)胞仍舊是需要解決的技術(shù)挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的實(shí)施方案的目的是提供好的用于鑒定和計(jì)數(shù)表達(dá)特定標(biāo)志物的顆粒的方法和裝置，所述顆粒例如細(xì)菌、病毒、非生物顆?；蚣?xì)胞，例如血細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的好的方法和裝置是精確的，因?yàn)殍b定的表達(dá)特定標(biāo)志物的顆粒的數(shù)量可被精確地測(cè)定。另外根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的好的方法和裝置也可被用在資源匱乏的地區(qū)而不在那里受限制。應(yīng)用的其他范圍包括用于普通分析和鑒定表達(dá)不同標(biāo)志物的不同細(xì)胞的PoC裝置。上述目的通過根據(jù)本發(fā)明的方法和裝置來完成。本發(fā)明提供了一種通常的方法和裝置，用于鑒別、鑒定和計(jì)數(shù)表達(dá)特定標(biāo)志物的顆粒，在具體的實(shí)施方案中是血細(xì)胞，所述標(biāo)志物例如是特定的抗原標(biāo)志物。這通過使用阻抗標(biāo)記聯(lián)合復(fù)頻(兩個(gè)或更多頻率)阻抗細(xì)胞計(jì)數(shù)來獲得，任選地用于疾病的診斷。在第一方面，本發(fā)明提供用于鑒定和計(jì)數(shù)表達(dá)特定標(biāo)志物或其他抗體的顆粒的分析方法，所述顆粒例如細(xì)菌、病毒、非生物顆?；蚣?xì)胞，例如血細(xì)胞。僅作為實(shí)例，所述方法可被用于鑒定和計(jì)數(shù)血液中的CD4+T淋巴細(xì)胞，所述方法包括
獲得懸液中的顆粒樣品，例如包含血細(xì)胞的血液，
用阻抗標(biāo)記物標(biāo)記表達(dá)特定標(biāo)志物的顆粒，例如血細(xì)胞，和
使用復(fù)頻系統(tǒng)測(cè)量被標(biāo)記的樣品以鑒別至少表達(dá)特定標(biāo)志物的被標(biāo)記的顆粒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的方法的優(yōu)勢(shì)是允許快速、廉價(jià)并簡(jiǎn)單的分析，例如全血細(xì)胞分析(全血計(jì)數(shù))可在幾分鐘內(nèi)進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的方法可被常規(guī)地用于臨床實(shí)踐。僅有限量的樣品，例如血液，是需要的，因?yàn)樗龇治鲈趩为?dú)的顆粒(或單獨(dú)的顆粒 /標(biāo)記物復(fù)合物)上而不是在大量的顆粒群上進(jìn)行。為取得計(jì)數(shù)事物的預(yù)先確定的數(shù)量，特定的樣品量，例如血液，必須被使用。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的方法不改變樣品滴中顆粒的數(shù)量，例如血液滴中的細(xì)胞數(shù)。但是，本領(lǐng)域系統(tǒng)的情況使用在細(xì)1管中的靜脈穿刺血，因?yàn)槠浔挥糜诖蟮闹行膶?shí)驗(yàn)室，并且所述細(xì)1管是樣品如何被送到實(shí)驗(yàn)室的。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，所述方法可被用于微流體裝置中，所述微流體形式允許整合樣品制備，其又能夠即時(shí)使用，因此允許立即使用樣品無需將其儲(chǔ)存。刺破指尖取的血中包含足夠的細(xì)胞使計(jì)數(shù)有統(tǒng)計(jì)意義的事實(shí)允許使用僅刺破指尖取血而不是細(xì)1管。在根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的分析方法中標(biāo)記表達(dá)特定標(biāo)記物的顆?？稍谖⒘黧w系統(tǒng)中進(jìn)行。在具體的實(shí)施方案中，所述方法可被用于例如微流體系統(tǒng)中的血液細(xì)胞。所述細(xì)胞僅需要被加入到微流體系統(tǒng)中，裂解和標(biāo)記可被順序地完成。在根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的分析方法中，測(cè)量被標(biāo)記的樣品以鑒別至少表達(dá)特定標(biāo)志物的被標(biāo)記的顆粒的步驟可包括使所述被標(biāo)記的樣品分離為包含單個(gè)顆粒的液滴，至少在第一頻率和第二頻率可選地在多于兩個(gè)頻率測(cè)定所述單個(gè)顆粒的阻抗，所述第一頻率低于第二頻率，將在第一較低頻率的阻抗與不透明度關(guān)聯(lián)，所述不透明度被定義為第二較高頻率阻抗與第一較低頻率阻抗的比值，以及從該關(guān)聯(lián)鑒別至少表達(dá)特定標(biāo)志物的被標(biāo)記的顆粒。在根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的分析方法中，標(biāo)記樣品可包括使所述樣品與用針對(duì)所述特定標(biāo)志物的抗體包被的珠子溫育。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的方法可進(jìn)一步包括在測(cè)量被標(biāo)記的樣品之前進(jìn)行裂解步驟。這樣的裂解步驟允許更容易地鑒別表達(dá)特定標(biāo)志物的細(xì)胞。特別有優(yōu)勢(shì)的是裂解步驟可在微流體裝置中進(jìn)行。在所述樣品是血液的情況下，所述裂解步驟可包括紅細(xì)胞裂解步驟。這樣的紅細(xì)胞裂解步驟可包括使所述血液樣品暴露于皂苷的有機(jī)酸溶液。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，測(cè)量所述被標(biāo)記的樣品可在樣品流中進(jìn)行，例如在微流體裝置中。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的方法用于鑒定和計(jì)數(shù)樣品中的顆粒的用途。在第二個(gè)方面的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的方法用于檢測(cè)和計(jì)數(shù)CD4+T淋巴細(xì)胞的用途。這樣的計(jì)數(shù)是有優(yōu)勢(shì)的，因?yàn)槠鋷椭\斷HIV。 在本發(fā)明的實(shí)施方案中單獨(dú)的CD4+細(xì)胞的數(shù)量是從單個(gè)細(xì)胞的阻抗信號(hào)中估計(jì)出的。在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供用于鑒定和計(jì)數(shù)表達(dá)特定標(biāo)志物的顆粒的裝置，所述裝置包含用于包含樣品流的微通道(所述樣品流，例如懸液中的顆粒，包含表達(dá)特定標(biāo)志物的被標(biāo)記的顆粒)；至少一對(duì)電極，電子電路，例如函數(shù)發(fā)生器(function generator)，用于將至少在第一頻率的第一 AC信號(hào)和至少在第二頻率的第二 AC信號(hào)應(yīng)用至所述至少一對(duì)電極，所述第一頻率低于第二頻率；及計(jì)算單元，用于測(cè)定所述電極對(duì)之間存在的顆粒的阻抗，所述計(jì)算單元被配置為適于測(cè)定至少在第一較低頻率和第二較高頻率的所述顆粒的阻抗，適于將在所述第一較低頻率的阻抗與不透明度關(guān)聯(lián)，所述不透明度被定義為所述第二較高頻率阻抗與所述第一較低頻率阻抗的比值，以及適于從該關(guān)聯(lián)鑒別至少表達(dá)特定標(biāo)志物的被標(biāo)記的顆粒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的這樣的裝置與現(xiàn)有技術(shù)不同，現(xiàn)有技術(shù)中表達(dá)特定標(biāo)志物的顆粒，例如血細(xì)胞，是被固定在固定的基質(zhì)上的，因此微通道不包括樣品流。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的裝置可另外包含被配置為適于發(fā)揮參考電極的功能的第二對(duì)電極。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的裝置可另外包含放大器電路，被配置為適于對(duì)在電極對(duì)中的一對(duì)之間存在的顆粒進(jìn)行微分測(cè)量。這樣，提供了微流體單個(gè)細(xì)胞阻抗細(xì)胞計(jì)數(shù)器，能夠進(jìn)行微分計(jì)數(shù)，例如在所述樣品是血液樣品的情況下，對(duì)白細(xì)胞微分計(jì)數(shù)。在根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的裝置中，微通道可被配置為適于接收懸液中的顆粒流并適于將所述懸液中的顆粒流導(dǎo)向所述至少一對(duì)電極之間，以鑒定和計(jì)數(shù)在懸液中的顆粒流中那些表達(dá)特定標(biāo)志物的顆粒。在根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的裝置中，所述低頻測(cè)量能力可被擴(kuò)展以便允許通過修改用于標(biāo)記顆粒的功能化珠子的阻抗性質(zhì)檢測(cè)存在于樣品中的生物顆粒，例如DNA、病毒、 蛋白質(zhì)等。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，微流體裝置可被縮小規(guī)模到允許檢測(cè)生物顆粒，例如 DNA、病毒、蛋白質(zhì)等，與功能化的納米尺度的珠子的結(jié)合。
本發(fā)明的實(shí)施方案的優(yōu)勢(shì)是其可被用于CD4+ T淋巴細(xì)胞的計(jì)數(shù)。本發(fā)明的實(shí)施方案的優(yōu)勢(shì)是其便于操作、快速、精確并且廉價(jià)。本發(fā)明特別并優(yōu)選的方面在所附的獨(dú)立和從屬權(quán)利要求中陳述。從屬權(quán)利要求中的特征可與獨(dú)立權(quán)利要求的特征和其他從屬權(quán)利要求的特征組合，其為恰當(dāng)?shù)牟⒉粌H僅在權(quán)利要求中明確陳述。參考下文中描述的實(shí)施方案，本發(fā)明的以上及其他方面將是顯而易見的并被說明。


圖1為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的微阻抗細(xì)胞計(jì)數(shù)器系統(tǒng)的示意圖，實(shí)現(xiàn)雙頻阻抗測(cè)量。圖2 (a)為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的阻抗檢測(cè)系統(tǒng)的簡(jiǎn)化的示意圖，其顯示了微分檢測(cè)系統(tǒng)。左側(cè)的電極對(duì)說明電極之間沒有細(xì)胞的等效電路模型(ECM)，右側(cè)的電極對(duì)在電極之間有細(xì)胞存在。圖2 (b)說明了聚合體珠子和近似大小的細(xì)胞之間的典型的頻率依賴性阻抗幅度信號(hào)的對(duì)比。圖3提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，顯示對(duì)于(a) 5. 62Mm直徑的乳膠珠子和(b) MACS純化的T 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞群，阻抗幅度(magnitude of the impedance)相對(duì)于頻率。每一個(gè)點(diǎn)包含約1500個(gè)事件并顯示測(cè)量數(shù)據(jù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。虛線顯示PSpice電路模擬，將用于含有細(xì)胞(或珠子)的檢測(cè)區(qū)域的等效電路模型與微分的放大電子技術(shù)結(jié)合。圖4 (a)是散點(diǎn)圖，顯示了對(duì)于T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和5. 62Mm直徑的乳膠珠子群的混合物，不透明度(|z| i 1707 kHz / Z i 503 kHz)相對(duì)于低頻(503 kHz)阻抗幅度的繪圖。圖4 (b)顯示低頻阻抗幅度的柱狀圖。圖4 (C)顯示不透明度的柱狀圖。圖4 (d)說明相同樣品的FACS分析，顯示了細(xì)胞(無珠子)的前和側(cè)散射性質(zhì)。圖5 (a)到(c)是FACS散點(diǎn)圖，顯示了熒光標(biāo)記(抗-CD14-FITC和抗-CD16-AleXa700)的皂苷/甲酸處理的全血的熒光和前光散射性質(zhì)。所有事件在FSC信號(hào)上觸發(fā)， 細(xì)胞群根據(jù)其熒光信號(hào)被鑒定。圖5 (d)到(f)為(相同樣品的)散點(diǎn)圖，顯示熒光和如用微阻抗細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)量的低頻(503 kHz)阻抗幅度性質(zhì)。數(shù)據(jù)顯示兩個(gè)系統(tǒng)都可清晰地分辨(resolve)嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞三個(gè)細(xì)胞群。圖6(a)為散點(diǎn)圖，顯示對(duì)于皂苷/甲酸處理的全血和7. ISMm直徑的乳膠珠子群， 不透明度(|Z @ 1707 kHz / Z @ 503 kHz)相對(duì)于低頻(503 kHz)阻抗幅度。圖6 (b)顯示低頻阻抗幅度的柱狀圖。單獨(dú)群的數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布(灰色曲線)。圖6 (C)顯示了不透明度的柱狀圖。單獨(dú)群的數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布(灰色曲線)。圖6 (d)是相同樣品的FACS分析，顯示了細(xì)胞(無珠子)的前和側(cè)散射性質(zhì)。圖7說明用皂苷/甲酸裂解溶液處理后的白細(xì)胞的典型微分散點(diǎn)圖。圖中的橢圓說明二維高斯概率分布和相應(yīng)的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞群是從這些概率分布中獲得的。在此微分散點(diǎn)圖中的數(shù)據(jù)如圖8中被分析。
圖8說明作為從參考全血分析器中獲得的測(cè)量的函數(shù)的相應(yīng)WBC分布的相關(guān)性。 從根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的阻抗細(xì)胞計(jì)數(shù)器和參考裝置中獲得的結(jié)果間的協(xié)方差因素在圖例中說明。對(duì)一個(gè)樣品，相同的實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，每次準(zhǔn)備新的裂解產(chǎn)物和完全干凈的芯片。圖9顯示⑶4+群如何由于用抗體包被的珠子標(biāo)記來鑒定。淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞在阻抗圖上被清晰地鑒別。圖10和圖11顯示了來自實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的實(shí)例。圖10顯示了標(biāo)記前的淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的圖。圖11顯示了用CD4抗體功能化的珠子標(biāo)記后的血細(xì)胞圖。圖12為裂解的全血和與⑶4珠子溫浴的裂解的全血的FACS散點(diǎn)圖。橢圓顯示了帶有附著的乳膠珠子的CD4+T淋巴細(xì)胞群的位置。圖13顯示了來自裂解的全血樣品的FACS數(shù)據(jù)，所述全血用熒光抗體(抗⑶4和 ⑶14)標(biāo)記并與⑶4珠子溫浴。圖14 為不透明度(|Z i 10007 kHz / Z i 503 kHz)對(duì)低頻幅度(503 kHz)的 IS散點(diǎn)圖，顯示了不同的群。圖15顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的阻抗微細(xì)胞計(jì)數(shù)器的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)。附圖僅為示意而非限制性的。在附圖中，為了說明的目的，一些元件的大小可被夸大或未按照比例繪制。權(quán)利要求中的任何參考標(biāo)記不應(yīng)作限制所述范圍解釋。在不同的附圖中，相同的參考標(biāo)記涉及相同的或類似的元件。
具體實(shí)施方案在一方面，本發(fā)明提供廉價(jià)的簡(jiǎn)單阻抗流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析方法結(jié)合阻抗標(biāo)記的應(yīng)用以鑒定和計(jì)數(shù)表達(dá)特定標(biāo)志物的細(xì)胞，例如血細(xì)胞，例如以鑒定和計(jì)數(shù)人類血液中⑶4+T 淋巴細(xì)胞。下文中將給出鑒定和計(jì)數(shù)血液中CD4+T淋巴細(xì)胞的具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述；但是本發(fā)明不局限于此而包括了通常的顆粒鑒定、鑒別和計(jì)數(shù)，所述顆?？砂?非窮盡的列出)細(xì)菌、病毒、非生物顆粒、細(xì)胞、解離的組織、病毒附著的納米珠子。通常地血液和具體地人類血液，包含血細(xì)胞，其可歸入以下三類中的任意一類用于運(yùn)輸氧氣到身體組織的紅細(xì)胞(red blood cells或erythrocytes)，用于產(chǎn)生抗體以防護(hù)機(jī)體對(duì)抗感染和外源材料的白細(xì)胞(white blood cells或leukocytes)，用于血液凝結(jié)的血小板或凝血細(xì)胞。所述三類血細(xì)胞懸浮在血漿中。血漿中有90%的水，血漿組成約55% 的血液體積并包含多種蛋白(例如白蛋白、纖維蛋白原、球蛋白和其他凝結(jié)蛋白)。存在5種不同且多樣的白細(xì)胞類型嗜中性粒細(xì)胞(40-75%的白細(xì)胞)、嗜酸性粒細(xì)胞(0-7%的白細(xì)胞)、嗜堿性粒細(xì)胞(0-1%的白細(xì)胞)(這三類被歸到粒細(xì)胞名下)、淋巴細(xì)胞(20-45%的白細(xì)胞)和單核細(xì)胞(3-11%的白細(xì)胞)。血液中白細(xì)胞的數(shù)量通常是疾病的指示。通常在一升血液中有4xl09到1. IxlO10白細(xì)胞。淋巴細(xì)胞包括自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、T細(xì)胞和B細(xì)胞。T細(xì)胞和B細(xì)胞的功能是在被稱為抗原呈遞的過程中識(shí)別特異性的“非自身”抗原(細(xì)菌中的抗原)。一旦T細(xì)胞和 B細(xì)胞鑒別了入侵者，其產(chǎn)生特異性的反應(yīng)，被調(diào)整以最大程度地消除特異性病原體們或病原體感染的細(xì)胞。當(dāng)B細(xì)胞中和外源目標(biāo)如細(xì)菌和病毒時(shí)，B細(xì)胞通過產(chǎn)生大量抗體對(duì)病原體產(chǎn)生應(yīng)答。應(yīng)答病原時(shí)一些稱為輔助T細(xì)胞的T細(xì)胞產(chǎn)生引導(dǎo)免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子， 同時(shí)其他稱為細(xì)胞毒性T細(xì)胞的T細(xì)胞產(chǎn)生引起病原體感染的細(xì)胞死亡的毒性顆粒。分化簇，也稱為指定簇，并通?？s寫作⑶，是用于鑒定和研究白細(xì)胞上存在的細(xì)胞表面分子的方法。約有250種不同的CD蛋白質(zhì)。所述CD系統(tǒng)通常用作細(xì)胞標(biāo)志物，允許根據(jù)其表面上存在的什么分子來鑒定細(xì)胞。這些標(biāo)志物通常被用于將細(xì)胞和特定的免疫功能關(guān)聯(lián)。使用不同的方法包括流式細(xì)胞術(shù)，CD分子被用于細(xì)胞分類中。細(xì)胞群通常使用 “ + ”(陽性)或“_”(陰性)符號(hào)來定義以指示某些細(xì)胞部分是否表達(dá)或缺乏⑶分子。兩種通常使用的CD分子是CD4和CD8，其通常分別用作輔助和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的標(biāo)志物。人類免疫缺陷病毒(HIV)結(jié)合輔助T細(xì)胞表面上的CD4和趨化因子受體以獲得進(jìn)入。血液中CD4 和⑶8 T細(xì)胞的數(shù)量通常用于監(jiān)控HIV感染的進(jìn)程。HIV感染導(dǎo)致?lián)碛孝?受體的T細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。因此，醫(yī)療人員參考⑶4的量以決定何時(shí)開始HIV感染患者的治療。CD4測(cè)試測(cè)量在其表面表達(dá)CD4受體的T細(xì)胞的數(shù)量。正常的血液值是大于1X109/L。結(jié)果通常以每微升血液的細(xì)胞數(shù)表達(dá)。當(dāng)⑶4量達(dá)到低值，約200-350細(xì)胞每微升時(shí)，患者通常進(jìn)行治療。流式細(xì)胞術(shù)是用于研究，例如計(jì)數(shù)、分類和檢查顯微顆粒(例如細(xì)胞，懸浮在流體流中)的化學(xué)和/或物理性質(zhì)的技術(shù)。本發(fā)明的實(shí)施方案利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行阻抗頻譜。圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的單細(xì)胞分析系統(tǒng)10的圖表。提供了微流體裝置11，包含微通道12，細(xì)胞13通過其中流動(dòng)，所述細(xì)胞被懸浮在懸浮的流體中。這與現(xiàn)有技術(shù)分析系統(tǒng)不同，現(xiàn)有技術(shù)中細(xì)胞被固定在固定的基質(zhì)上用于計(jì)數(shù)。第一對(duì)微電極14 被制作于通道12中，并且這些與小的信號(hào)AC電壓相連，所述小的信號(hào)AC電壓由函數(shù)發(fā)生器15產(chǎn)生。該施加的電壓和所述測(cè)量的流經(jīng)微電極14之間的微通道12的電流的比值被用于測(cè)定通過微電極14之間的單細(xì)胞13的電阻抗。如圖1和圖2所示，兩對(duì)電極14、16被用于定義兩個(gè)相近位置的檢測(cè)體積，并都與相同的函數(shù)發(fā)生器15相連接，因此接收相同的AC電壓，以便在單獨(dú)的細(xì)胞13上進(jìn)行差異測(cè)量。所述第一對(duì)電極14測(cè)量了來自所述細(xì)胞13的電信號(hào)，同時(shí)所述第二對(duì)電極16作為參考并測(cè)量來自所述含有懸浮流體但無細(xì)胞13存在的微通道12的信號(hào)。所述電信號(hào)可使用定制的電子學(xué)儀器測(cè)量。這種雙重測(cè)量方法顯著降低測(cè)量噪音和漂移，所述噪音和漂移可由懸浮流體的溫度或組成變化引起。在使用中，使用注射泵(未圖釋)，將在懸液中的細(xì)胞13泵抽通過微流體裝置11的微流體通道12，以預(yù)先設(shè)定的速度，例如約每秒100個(gè)細(xì)胞13的速度進(jìn)行。當(dāng)細(xì)胞13通過通道12時(shí)，它們擾亂檢測(cè)體積的電場(chǎng)，因此隨后產(chǎn)生正信號(hào)(當(dāng)細(xì)胞13通過第一對(duì)電極14 時(shí))和負(fù)信號(hào)(當(dāng)細(xì)胞13通過第二對(duì)電極16時(shí));這些信號(hào)被加工以提供阻抗。在測(cè)量的信號(hào)的兩個(gè)峰值(正和負(fù))之間的時(shí)間相當(dāng)于細(xì)胞13在述電極14、16之間的通過時(shí)間。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，高速阻抗分析在兩個(gè)同時(shí)發(fā)生的頻率上進(jìn)行并且從系統(tǒng)10中獲得的數(shù)據(jù)使用在分析裝置18上運(yùn)行的分析軟件分析。分析裝置18可包含計(jì)算單元，用于測(cè)定電極對(duì)之間存在的血細(xì)胞的阻抗，計(jì)算單元被配置為適于測(cè)定在第一頻率和第二頻率的血細(xì)胞的阻抗，適于將在第一頻率的阻抗與不透明度關(guān)聯(lián)，所述不透明度為高頻阻抗與低頻阻抗的比值，以及適于從該關(guān)聯(lián)鑒別至少表達(dá)特定標(biāo)志物的被標(biāo)記的血細(xì)胞。在懸液中的細(xì)胞13的電介質(zhì)性質(zhì)用麥克斯韋混合物理論描述，其特征為異質(zhì)系統(tǒng)的等效復(fù)介電常數(shù)與單獨(dú)顆粒和懸浮介質(zhì)的性質(zhì)之間的關(guān)系。對(duì)于介質(zhì)中的球形顆粒(例如細(xì)胞13)的懸液，混合物的等效復(fù)介電常數(shù)ε mix通過下式給出
權(quán)利要求
1.一種用于鑒定和計(jì)數(shù)表達(dá)特定標(biāo)志物的顆粒的分析方法，所述方法包括 獲得包含顆粒的樣品，用阻抗標(biāo)記物標(biāo)記表達(dá)特定標(biāo)志物的顆粒，使用復(fù)頻系統(tǒng)測(cè)量被標(biāo)記的樣品以鑒別至少表達(dá)特定標(biāo)志物的被標(biāo)記的顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其中標(biāo)記表達(dá)特定標(biāo)志物的顆粒在微流體系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其中測(cè)量被標(biāo)記的樣品以鑒別至少表達(dá)特定標(biāo)志物的被標(biāo)記的顆粒的步驟包括使所述被標(biāo)記的樣品分離為包含單個(gè)顆粒的液滴，測(cè)定至少在第一頻率和第二頻率的所述單個(gè)顆粒的阻抗，所述第一頻率低于第二頻率，將在所述第一頻率的阻抗與不透明度關(guān)聯(lián)，所述不透明度為所述第二頻率阻抗與所述第一頻率阻抗的比值，從該關(guān)聯(lián)鑒別至少表達(dá)特定標(biāo)志物的被標(biāo)記的顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其中標(biāo)記樣品包括使所述樣品與用針對(duì)所述特定標(biāo)志物的抗體包被的珠子溫育。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其另外包括在測(cè)量所述被標(biāo)記的樣品之前進(jìn)行裂解步馬聚ο
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，所述樣品為血液樣品，其中進(jìn)行裂解步驟是進(jìn)行紅細(xì)胞裂解步驟，其包括使所述血液樣品暴露于皂苷的有機(jī)酸溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中測(cè)量所述被標(biāo)記的樣品在樣品流中進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法用于鑒定和計(jì)數(shù)⑶4+T-淋巴細(xì)胞的用途。
9.一種用于鑒定和計(jì)數(shù)表達(dá)特定標(biāo)志物的顆粒的裝置，其包含用于包含樣品流的微通道，所述樣品流包含表達(dá)特定標(biāo)志物的被標(biāo)記的顆粒， 至少一對(duì)電極，電子電路，用于將至少在第一頻率的第一 AC信號(hào)和至少在第二頻率的第二 AC信號(hào)施加至所述至少一對(duì)電極，所述第一頻率低于第二頻率，計(jì)算單元，用于測(cè)定所述電極對(duì)之間存在的顆粒的阻抗，所述計(jì)算單元被配置為適于測(cè)定至少在第一頻率和第二頻率的所述單個(gè)顆粒的阻抗，適于將在所述第一頻率的阻抗與不透明度關(guān)聯(lián)，所述不透明度為所述第二頻率阻抗與所述第一頻率阻抗的比值，以及適于從該關(guān)聯(lián)鑒別至少表達(dá)特定標(biāo)志物的被標(biāo)記的顆粒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的裝置，其另外包含第二對(duì)電極，被配置為適于發(fā)揮參考電極的功能。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的裝置，其另外包含放大電路，被配置為適于對(duì)在電極對(duì)中的一對(duì)之間存在的顆粒進(jìn)行差異測(cè)量。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的裝置，其中所述微通道被配置為適于接收懸液中的顆粒流并將所述懸液中的顆粒流導(dǎo)向所述至少一對(duì)電極之間，以鑒定和計(jì)數(shù)在懸液中的顆粒流中表達(dá)特定標(biāo)志物的顆粒。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品的阻抗標(biāo)記在微流體裝置中進(jìn)行。
全文摘要
提供了一種鑒定和計(jì)數(shù)表達(dá)特定抗原標(biāo)志物的顆粒的分析方法。一個(gè)實(shí)例(但不唯一)是血液中CD4+T淋巴細(xì)胞分析。所述方法包括獲得懸液形式的包含顆粒的樣品，用阻抗標(biāo)記物標(biāo)記表達(dá)特定標(biāo)志物的顆粒，以及使用雙頻系統(tǒng)測(cè)量被標(biāo)記的樣品以鑒別至少表達(dá)特定標(biāo)志物的被標(biāo)記的顆粒。所述方法允許精確計(jì)數(shù)顆粒，例如血流中的CD4+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量。也提供了相應(yīng)的裝置。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102460114SQ201080034516
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月5日
發(fā)明者霍爾姆斯 D., 摩根 H. 申請(qǐng)人:皇家飛利浦電子股份有限公司