專利名稱：用于抗微生物劑抗性測定的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于測定微生物的抗生素抗性狀況的方法和系統(tǒng)。本發(fā)明還提供了用于在單個系統(tǒng)內(nèi)原位測定微生物的抗生素抗性狀況的方法。
背景技術：
血流感染伴有高發(fā)病率和高死亡率，然而目前的診斷方法培養(yǎng)、隨后生化鑒定和抗生素敏感性檢驗，可需要數(shù)天來進行。通常，基于臨床癥狀啟動經(jīng)驗療法，且檢驗結果僅在起始療法失敗時影響臨床決策。陽性血液培養(yǎng)結果之后1小時內(nèi)鑒定血流感染的能力將顯著地提高所提供的診斷信息的臨床相關性。已提出了分子擴增方法來滿足該需求，但對于該方法存在嚴重的挑戰(zhàn)。陽性血液培養(yǎng)物肉湯本身代表具有用于多種快速鑒定(ID)檢驗的可能性的微生物的天然擴增群體。甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus) (MRSA)是可以甚至在健康患者中快速導致感染的危險的社區(qū)獲得性和醫(yī)院獲得性病原體。其也常作為正常菌群存在于大量年老的和患病的患者中，并在健康護理環(huán)境中具有快速交叉感染多個患者的能力?！凹籽跷髁挚剐浴钡臋C制基本上由稱作PBP2a的改變的青霉素結合蛋白2的產(chǎn)生來介導，其保留了功能性酶活性但對于內(nèi)酰胺抗生素具有顯著降低的親和力。萬古霉素抗性腸球菌(enterococci) (VRE)是需要立即鑒定的另一組危險的病原體。以與甲氧西林抗性相似的方式，萬古霉素抗性也是由抗生素對其細胞膜靶標的降低的親和力來介導。目前鑒定MRSA和VRE的方法是勞動強度大的且由于可能導致使用者的氣溶膠暴露的步驟而可能是不安全的。迫切需要快速且安全和可靠的方法以分離血液培養(yǎng)物肉湯中所含的微生物，其適合快速測定抗性。本發(fā)明提供了這樣的方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于測定微生物的抗生素抗性狀況的方法。該方法允許比現(xiàn)有技術更快地測定微生物的抗生素抗性狀況，導致更快的診斷(例如，在患有或懷疑患有敗血癥和/或其他感染的受試者中)和受污染物質(zhì)(例如，食品、供水和藥品)的表征。包括在本發(fā)明方法中的步驟——從獲得樣品至微生物的抗生素抗性狀況的測定，可在非常短的時間范圍中進行以產(chǎn)生臨床相關的可操作的信息，例如，在少于約240分鐘之內(nèi)。此外，本發(fā)明的方法可以完全自動化，從而降低了操作傳染性材料的風險和/或污染樣品的風險。本發(fā)明的第一方面涉及測定微生物的抗生素抗性狀況的方法，包括(a)在可形成微生物/抗性測定親和配體復合物的條件下，將微生物與抗性測定親和配體相接觸；(b)將(a)中形成的微生物/抗性測定親和配體復合物與未結合的抗性測定親和配體相分離；(c)測定微生物/抗性測定親和配體復合物中與微生物結合的抗性測定親和配體的量；和(d)將微生物/抗性測定親和配體復合物中與微生物結合的抗性測定親和配體的量與被同樣的微生物的已知的抗生素敏感性或抗生素抗性菌株或已知的抗生素敏感性或抗生素抗性菌株的群體所結合的抗性測定親和配體的量相比較；其中如果微生物/抗性測定親和配體復合物中的微生物結合的抗性測定親和配體的量與被抗生素敏感性微生物結合的抗性測定親和配體的量不同，或微生物/抗性測定親和配體復合物中的微生物結合的抗性測定親和配體的量與被抗生素敏感性微生物結合的抗性測定親和配體的量相同，那么將該微生物鑒定為抗生素抗性的。在另一方面，本發(fā)明涉及用于測定微生物的抗生素抗性狀況的方法，包括(a)獲得已知含有或可能含有微生物的檢驗樣品；(b)在可形成微生物/抗性測定親和配體復合物的條件下將檢驗樣品中的微生物與抗性測定親和配體相接觸；(c)任選地添加測量細胞新陳代謝或膜完整性的一種或多種熒光染料；(d)任選地選擇性地裂解可能存在于樣品中的任何非微生物細胞以產(chǎn)生裂解的樣
品；(e)將微生物與所述檢驗樣品或所述裂解的樣品中的其他組分相分離，以形成微生物的沉淀物(pellet)；(f)探測該沉淀物以產(chǎn)生微生物的測量結果；(g)通過將該測量結果與針對同種的抗生素抗性和/或抗生素敏感性微生物所取得的或預測的測量結果相比較而在所基于的檢驗樣品中測定微生物的抗生素抗性狀況。在一個實施方案中，分離步驟通過以下來進行將微生物/抗性測定親和配體復合物層疊(layering)在容器(例如，氣密密封的容器)中的密度墊層(density cushion) 上并離心該容器以沉淀該微生物/抗性測定親和配體復合物，同時含有未結合的配體的培養(yǎng)基保留在密度墊層的頂部。在另一個實施方案中，容器在底部和/或側部具有光學窗口從而可對微生物/抗性測定親和配體復合物沉淀物進行分光鏡探測以用于測定步驟?？赏ㄟ^將沉淀物的光譜與已知抗生素抗性狀況的微生物的一個或多個光譜相比較而測定微生物的抗生素抗性狀況。無需進一步操作而直接在沉淀物中和/或氣密密封的容器中測定微生物的抗生素抗性狀況的能力增強了微生物鑒定的安全性。在一個實施方案中，測定步驟通過回收微生物/抗性測定親和配體復合物沉淀物、在適宜的培養(yǎng)基中重懸微生物和諸如利用分光鏡方法探測該重懸的微生物來進行。在另一個實施方案中，方法還包括對重懸的微生物進行進一步的鑒定和/或表征檢驗(例如， 藥物抗性、毒力因子、抗菌譜)。在另一方面，本發(fā)明涉及用于測定微生物的抗生素抗性狀況的系統(tǒng)，包括(a)容器，所述容器包括微生物或含有微生物的樣品、和抗性測定親和配體；(b)密度墊層；和(c)提供測量結果的分光計；其中所述測量結果測定已通過在所述系統(tǒng)內(nèi)原位分離而在所述容器中濃縮的微生物的抗生素抗性狀況。在另一個實施方案中，系統(tǒng)包括用于將微生物與未結合的抗性測定親和配體相分離的離心機。本文的附圖和以下所列的描述中更詳細地解釋了本發(fā)明。附圖簡述

圖1顯示了用B0CILLIN -FL(B0DIPY FL-標記的青霉素)進行的甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌(MSSA)菌株和甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株的代謝標記。圖2顯示了 B0CILLIN -FL與MSSA菌株和MRSA菌株結合的時間過程。圖3顯示了 B0CILLIN -FL與MSSA菌株和MRSA菌株結合的滴定。圖4顯示了 B0CILLIN -FL與不同的MSSA菌株和MRSA菌株的結合。發(fā)明詳述本發(fā)明能夠以不同形式具體實施，并且不應理解為被本文所述實施方案所限制。 相反，提供這些實施方案以使得本公開內(nèi)容將是透徹和完整的，且這些實施方案將完全地將本發(fā)明范圍傳達給本領域技術人員。例如，就一個實施方案闡述的特征可以并入到其他實施方案中，且就一個特定的實施方案闡述的特征可以從該實施方案中刪除。另外，針對本文建議的實施方案的多種變化和添加，從本公開內(nèi)容的角度來說，將對本領域技術人員是明顯的，并不背離本發(fā)明。除非另外定義，本文所用的所有技術術語和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域技術人員通常理解的相同含義。在此用于描述本發(fā)明的術語僅僅是用于描述特定的實施方案的目的，而并非旨在限制本發(fā)明。定義如本文所用，“一”、“一個”或“該”可指一個或多于一個。例如，“一個”細胞可以指一個單獨的細胞或是多個細胞。另如本文所用，“和/或”是指并且涵蓋所列相關事項中的一個或多個的任何和所有可能的組合，以及當二選一說明時的不組合(“或”)。此外，如本文所用的術語“大約”當涉及可測量的數(shù)值時，例如本發(fā)明的化合物或劑的量、劑量、時間、溫度等等，意在涵蓋指定量的士20%、士 10%、士5%、士 1%、士0.5%、 或者甚至士 0. 的變化。如本文所用的，術語“微生物”旨在涵蓋可以在實驗室中繁殖和操作的通常是單細胞的生物，包括但不限于，任何組合的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母、霉菌、 寄生物和柔膜體。本發(fā)明的革蘭氏陰性菌的非限制性例子包括以下的屬的細菌假單胞菌屬(Pseudomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷白氏菌屬(Klebsiella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、變形菌屬(Proteus)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、嗜血桿菌屬 (Haemophilus)、摩根氏菌屬(Morganella)、弧菌屬(Vibrio)、耶爾森菌屬(Yersinia)、 不云力桿菌屬(Acinetobacter)、募養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、短波單胞菌屬 (Brevundimonas)、勞爾氏菌屬(Ralstonia)、無色桿菌屬(Achromobacter)、梭形桿菌屬(Fusobacterium)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、布蘭漢氏球菌屬(Branhamella)、奈瑟菌屬(Neisseria)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、 哈夫尼菌屬(Hafnia)、愛德華菌屬(Edwardsiella)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、莫拉菌屬(Moraxella)、布氏菌屬(Brucella)、巴斯德菌屬(Pasteurella)、普羅威登斯菌屬 (Providencia)和軍團菌屬(Legionella)。本發(fā)明的革蘭氏陽性菌的非限制性例子包括下列屬的細菌腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、葡萄球菌屬 (Staphylococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、李其Jf 特菌屬(Listeria)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus) > 丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、梭菌屬(Clostridium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、 加德納菌屬(Gardnerella)、庫克菌屬(Kocuria)、乳球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、微球菌屬(Micrococcus)、分枝桿菌屬(Mycobacteria)禾口棒狀桿菌屬 (Corynebacteria)。本發(fā)明的酵母和霉菌的非限制性例子包括下列屬的那些念珠菌屬 (Candida)、隱球菌屬(Cryptococcus)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、青霉屬(Penicillium)、 鏈格孢屬(Alternaria)、赤釀母屬(Iihodotorula)、曲霉屬(Aspergillus)、梭霉菌屬 (Fusarium)、酵母屬(Saccharomyces)和毛孢子菌屬(Trichosporon)。本發(fā)明的寄生物的非限制性例子包括下列屬的那些錐蟲屬(Trypanosoma)、巴貝蟲屬(Babesia)、利什曼原蟲屬(Leishmania)、瘧原蟲屬(Plasmodium)、吳策線蟲屬(Wucheria)、布魯格氏絲蟲屬 (Brugia)、盤尾屬(Onchocerca)和耐格里原蟲屬(Naegleria)。本發(fā)明的柔膜體的非限制性例子包括下列屬的那些支原體屬(Mycoplasma)和脲原體屬⑴reaplasma)。如本文所用的，術語“分離”旨在涵蓋已從其原始狀態(tài)或從其生長介質(zhì)或培養(yǎng)介質(zhì)中取出、濃縮或以其他方式分開的微生物的任何樣品。例如，根據(jù)本發(fā)明，微生物可與可能另外干擾表征和/或鑒定的非微生物或非微生物組分分開(例如，作為分離的樣品)。該術語可包括夾在兩個其他層之間的微生物層，例如，離心之后在高密度墊層的頂部收集的微生物，或在固體表面(例如，濾膜)收集的微生物層。該術語還可包括已部分地穿過層(例如，密度墊層)的微生物的集合。這樣，分離的微生物樣品可包括比原始樣品更為濃縮的、 或與原始樣品分開的微生物和/或其組分的任何集合或層，且范圍可以從微生物的緊密堆積的集簇到微生物的彌漫的層。可包括在分離的形式或樣品中的微生物組分包括，但不限于，任何組合的菌毛、鞭毛、纖毛和莢膜。與微生物分離的非微生物組分可包括非微生物細胞(例如，血細胞和/或其他組織細胞)和/或其任何組分。如本文所用的，術語“沉淀物”旨在涵蓋已壓縮成或沉積成微生物的團塊(mass) 的任何微生物樣品。例如，通過離心或本領域中其他已知方法可將來自樣品的微生物壓縮或沉積成管底部的團塊。該術語包括離心后容器的底部和/或側部的微生物(和/或其組分)的集合?？砂ㄔ诔恋砦镏械奈⑸锝M分包括但不限于，任何組合的菌毛、鞭毛、纖毛和莢膜。根據(jù)本發(fā)明，微生物可以從可能另外干擾表征和/或鑒定的非微生物或非微生物組分中沉淀出來(例如，作為基本上純化的微生物沉淀物)。與微生物分離的非微生物組分可包括非微生物細胞(例如，血細胞和/或其他組織細胞)和/或其任何組分。如本文所用的，術語“密度墊層”指整體上具有均一密度的溶液。如本文所用的，術語“抗性測定親和配體”指與抗生素抗性微生物結合的程度(例如，結合的配體的量、結合度、和/或結合的親和力，等等)與同樣的微生物的抗生素敏感性菌株相比不同的任何可檢測化合物或分子。如本文所用的，該術語包括未標記的配體和已與可檢測的標記物軛合的配體。在一些實施方案中，抗性測定親和配體以與抗生素敏感性菌株結合的程度相比較低的程度與抗生素抗性菌株結合。在其他實施方案中，抗性測定親和配體以與抗生素敏感性菌株結合的程度相比較高的程度與抗生素抗性菌株結合。如本文所用的，當術語“結合”用于抗性測定親和配體時，指該配體與微生物的物理締合。該術語包括配體與微生物的實際物理結合，例如，與微生物的結構(例如胞內(nèi)或表面蛋白、核酸、細胞器、細胞膜、細胞壁，等等)的共價或非共價結合。該術語還包括配體與微生物不涉及物理結合的締合，例如，配體捕獲(trapping)到微生物的內(nèi)部。例如，抗性測定親和配體可包括胞內(nèi)酶的酶底物，且當酶作用于配體之后配體被捕獲到細胞內(nèi)部。如本文所用的，術語“同樣的微生物”指與感興趣的微生物同樣的屬和種的微生物。如本文所用的，術語“結合不同的量”、“結合的配體的量的差異”及其變化形式指兩個微生物之間的抗性測定親和配體的結合的量的統(tǒng)計學顯著的差異。結合的“統(tǒng)計學顯著”的差異為至少約 5%，例如，至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、 100 %、150 %、200 %或更多。術語“結合相同的量”和其變化形式指兩個微生物之間的抗性測定親和配體的結合的量的差異小于約ls^uo^j^u^或更少。結合的配體的量可通過本領域中的技術人員已知的任何方法來測定，例如，通過測量配體的固有性質(zhì)或與配體連接的可檢測標記物的性質(zhì)來測定。如本文所用的，術語“不同的結合親和力”、“配體的結合親和力的差異”及其變化形式指兩個微生物之間的抗性測定親和配體的結合親和力的差異為至少約5%，例如，至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%或更多。術語 “相同的結合親和力”和其變化形式指兩個微生物之間的抗性測定親和配體的結合親和力的差異小于約20%，例如，小于約15%、10%、5 ^UW或更少。配體的結合親和力可通過本領域中技術人員已知的任何方法來測定，例如，通過測量配體的固有性質(zhì)或與配體連接的可檢測標記物的性質(zhì)來測定。本發(fā)明提供了用于測定微生物的抗生素抗性狀況的方法。該快速方法允許比現(xiàn)有技術更快地測定微生物的抗生素抗性狀況，導致更快速的診斷(例如，在患有或懷疑患有敗血癥和/或其他感染的受試者中)和受污染材料(例如，食品、供水和藥品)的表征。本發(fā)明的方法中包括的步驟，從獲得樣品至測定微生物的抗生素抗性狀況，可在非常短的時間范圍中進行以獲得臨床相關的可操作信息。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法可在少于約 240 分鐘內(nèi)進行，例如，在少于約 180、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、 5、4、3、2或1分鐘內(nèi)進行。本發(fā)明的方法的極快速性顯示了超越現(xiàn)有方法的改進。本方法可用于測定本文所描述的任何微生物的抗生素抗性狀況。在一個實施方案中，微生物是細菌。在另一個實施方案中，微生物是酵母。在另一個實施方案中，微生物是霉菌。在另一個實施方案中，微生物是寄生物。在另一個實施方案中，微生物是柔膜體。此外，本發(fā)明的方法可以部分地或完全地自動化，從而降低了處理傳染性材料和/或污染樣品的風險。本發(fā)明的第一方面涉及測定微生物的抗生素抗性狀況的方法，包括(a)在可形成微生物/抗性測定親和配體復合物的條件下，將微生物與抗性測定親和配體相接觸；(b)將(a)中形成的微生物/抗性測定親和配體復合物與未結合的抗性測定親和配體相分離；(c)測定微生物/抗性測定親和配體復合物中的與微生物結合的抗性測定親和配體的量；和(d)將微生物/抗性測定親和配體復合物中的與微生物結合的抗性測定親和配體的量與被同樣的微生物的已知的抗生素敏感性或抗生素抗性菌株或已知的抗生素敏感性或抗生素抗性菌株的群體所結合的抗性測定親和配體的量相比較；其中如果微生物/抗性測定親和配體復合物中的微生物結合的抗性測定親和配體的量與抗生素敏感性微生物結合的抗性測定親和配體的量不同，或微生物/抗性測定親和配體復合物中的微生物結合的抗性測定親和配體的量與抗生素抗性微生物結合的抗性測定親和配體的量相同，那么則將微生物鑒定為抗生素抗性的。在另一方面，本發(fā)明涉及用于測定微生物的抗生素抗性狀況的方法，包括(a)獲得已知含有或可能含有微生物的檢驗樣品；(b)在可形成微生物/抗性測定親和配體復合物的條件下將檢驗樣品中的微生物與抗性測定親和配體相接觸；(c)任選地添加一種或多種測量細胞新陳代謝或膜完整性的熒光染料；(d)任選地選擇性地裂解可能存在于樣品中的任何非微生物細胞以產(chǎn)生裂解的樣
P
m ；(e)將微生物與所述檢驗樣品或所述裂解的樣品中的其他組分相分離，以形成微生物的沉淀物；(f)探測該沉淀物以產(chǎn)生微生物的測量結果；(g)通過將該測量結果與針對同種的抗生素抗性和/或抗生素敏感性微生物所取得的或預測的測量結果相比較而在所基于的檢驗樣品中測定微生物的抗生素抗性狀況。本發(fā)明的方法的一個優(yōu)點是快速性，該方法可被快速地進行。另一個優(yōu)點是該方法可對完整的微生物進行?？蛇M行抗生素抗性微生物的鑒定而不需要裂解或以其他方式破壞微生物以，例如，暴露胞內(nèi)組分或分離細胞膜，雖然本文所描述的方法也可利用裂解的或其他非完整的微生物來進行。因此，不要求嚴格條件，諸如極端PH、去污劑、或加熱。此外， 因為微生物不一定被測定方法破壞，它們可保持對于進一步的檢驗或使用的可用性。樣品在本發(fā)明的一些實施方案中，待檢驗抗生素抗性的微生物存在于一個或多個樣品中?？赏ㄟ^本發(fā)明的方法檢驗的樣品包括其中懷疑或可能懷疑微生物存在和/或生長的臨床樣品和非臨床樣品，以及常規(guī)地或偶然地檢驗微生物的存在的材料的樣品。所用的樣品的量由于方法的通用性和/或敏感性可極大地不同。樣品制備可通過本領域中技術人員已知的任何數(shù)目的技術來進行，盡管本發(fā)明的優(yōu)點之一是復雜的樣品類型諸如例如血液、體液、和/或其他不透明物質(zhì)，可在極少或無大量預處理時利用該系統(tǒng)來直接檢驗?？杀粰z驗的臨床樣品包括在臨床實驗室或研究實驗室中通常檢驗的任何類型的樣品，包括但不限于，血液、血清、血漿、血液成分、關節(jié)液、尿液、精液、唾液、排泄物、腦脊液、胃內(nèi)容物、陰道分泌物、組織勻漿、骨髓抽吸物、骨勻漿、痰、抽吸物、拭子和拭子沖洗物、 其他體液，及類似的臨床樣品。本發(fā)明應用于研究中以及獸醫(yī)和醫(yī)療應用中。可以自其獲得臨床樣品的適宜的受試者通常為哺乳動物受試者，但可以是任何動物。如本文所用的術語“哺乳動物”包括但不限于，人類、非人靈長類、牛、綿羊、山羊、豬、馬、貓、狗、兔、嚙齒類(例如，大鼠或小鼠)，等
10等。人類受試者包括新生兒、嬰兒、未成年人、成人和老齡受試者。可以自其獲得樣品的受試者包括但不限于，哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物和魚類?？梢杂糜跈z驗的非臨床樣品還包括以下物質(zhì)，其包括但不限于，食品、飲料、藥物、 化妝品、水(例如，飲用水、非飲用水和廢水)、海水壓載物(seawater killasts)、空氣、土壤、污水、植物材料(例如，種子、葉、莖、根、花、果實)、血液制品(例如，血小板、血清、血漿、 白細胞成分，等等)、供體器官或組織樣品、生物武器(biowarfare)樣品，和類似的非臨床樣品。本方法還特別適于實時檢驗，以監(jiān)測工業(yè)環(huán)境、商業(yè)環(huán)境和/或臨床環(huán)境中污染水平、過程控制、質(zhì)量控制、和類似情況。在本發(fā)明的一個實施方案中，樣品獲自具有或懷疑具有微生物感染的受試者(例如，患者)。在一個實施方案中，受試者患有或懷疑患有敗血癥，例如，菌血癥或真菌血癥。 樣品可以是直接來自受試者的血液樣品。樣品可來自從患者血液的樣品進行培養(yǎng)的血液培養(yǎng)物，例如，BaeT/ALERT 血液培養(yǎng)物。血液培養(yǎng)物樣品可來自陽性血液培養(yǎng)物，例如，指示微生物的存在的血液培養(yǎng)物。在某些實施方案中，樣品在陽性血液培養(yǎng)物呈現(xiàn)陽性之后的短時間內(nèi)取自該陽性血液培養(yǎng)物，例如，在約6小時內(nèi)，例如，在約5、4、3或2小時內(nèi)，或在約 60 分鐘內(nèi)，例如，約 55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5、4、3、2 或 1 分鐘。在一個實施方案中，樣品取自其中微生物為對數(shù)期生長的培養(yǎng)物。在另一個實施方案中，樣品取自其中微生物處于穩(wěn)定期的培養(yǎng)物。本發(fā)明提供了檢測抗生素抗性微生物的高度敏感性。這使能夠進行檢測而不必首先經(jīng)過通過在固體或半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)微生物且從培養(yǎng)的菌落取樣而分離微生物的步驟。然而，在本發(fā)明的一個實施方案中，樣品來自在固體或半固體表面生長的微生物(例如，細菌、酵母或霉菌)菌落。樣品的體積應該足夠大以產(chǎn)生微生物的可檢測的量(例如，沉淀物)，可在進行本發(fā)明的方法的分離步驟之后對其進行探測。適當?shù)捏w積將取決于樣品的來源和樣品中微生物的預期水平。例如，每體積陽性血液樣品將含有與待檢驗污染的飲水樣品相比較高水平的微生物，因此與飲水樣品相比將需要較小體積的血液培養(yǎng)基。通常，樣本量可以小于約50ml，例如，小于約40、30、20、15、10、5、4、3或anl。在某些實施方案中，樣本量可以為約 lml，例如，約0. 75、0. 5或0. 25ml。在其中以微量進行分離的某些實施方案中，樣本量可小于約200 μ 1，例如，小于約150、100、50、25、20、15、10或5μ 1。在一些實施方案中(例如， 當預計樣品包括少量的微生物時)，樣本量可以為約IOOml或更多，例如，約W0、500、750或 IOOOml或更多。接觸步驟在本發(fā)明的一方面，將微生物或含有微生物的樣品與抗性測定親和配體相接觸。 在一個實施方案中，接觸可發(fā)生在樣品介質(zhì)中，例如，通過向樣品添加配體。在另一個實施方案中，接觸發(fā)生在其中導入了微生物和配體的結合混合物或組合物中。在另一個實施方案中，抗性測定親和配體包含在分離容器中的密度墊層內(nèi)。在一個實施方案中，抗性測定親和配體是抗生素，例如青霉素或另外的內(nèi)酰胺抗生素，萬古霉素或其他糖肽抗生素、多粘菌素B或頭孢托羅(ceftobiprole)，以及其任何組合。在另一個實施方案中，抗性測定親和配體是單克隆的或多克隆的抗體或抗體片段、核酸探針、適體、配體、酶底物、肽模擬物、 噬菌體來源的結合蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物、多糖、或蛋白、或其任何組合。如果抗性測定親和配體本身不發(fā)出可檢測信號，可對配體進行標記以提供可檢測信號，諸如通過將配體與標志物(例如，可見的或熒光的標志物)軛合。標志物包括，但不限于，熒光的、發(fā)光的、發(fā)磷光的、放射性的、拉曼活性的、質(zhì)譜反應性的和/或比色的化合物。被標記的抗性測定親和配體可包括但不限于，被標記的青霉素(例如，BOCILLIN FL青霉素)和被標記的萬古霉素(例如，BODIPY FL 萬古霉素)(Life Technologies, Carlsbad, CA)?？剐詼y定親和配體與微生物或含有微生物的樣品的接觸可通過任何方法來進行， 只要在配體和微生物之間存在可檢測的量的結合(例如，形成微生物/抗性測定親和配體復合物)且在與抗生素敏感性微生物和抗生素抗性微生物的結合量或結合親和力上存在可測量的差異。與微生物形成接觸的抗性測定親和配體的量和接觸的時間長度足以發(fā)生配體與微生物的結合，導致微生物/抗性測定親和配體復合物形成，且該量和接觸的時間長度將取決于多種因素，包括微生物的類型、配體的類型、配體對微生物的親和力、配體的結合靶標是胞外的或是胞內(nèi)的、溫度、緩沖條件等，如對于本領域中的技術人員將是熟知的。 接觸時間可以是，例如，約240分鐘或更少，例如，約180、120、90、60、50、40、30、20、10、10、 5、4、3、2、1分鐘或更少。接觸可發(fā)生在任何適宜于配體與微生物發(fā)生結合的溫度下，例如， 約4°C至約50°C，例如，約15°C至約40°C，例如，約37°C或約室溫。接觸步驟可在適宜的容器中進行，例如，在其中進行分離步驟的相同容器中或在分開的容器中。分離步驟微生物或含有微生物的樣品與抗性測定親和配體相接觸且已經(jīng)發(fā)生可檢測或可測量的量的配體與微生物的結合之后，可進行分離步驟以將微生物/抗性測定親和配體復合物與未結合的抗性測定親和配體相分離，以及將微生物與樣品和/或結合混合物或組合物的其他組分相分離。在一個實施方案中，分離步驟將微生物/抗性測定親和配體復合物濃縮成沉淀物，可對所述沉淀物進行探測以測定微生物的抗生素抗性狀況。微生物與樣品和/或結合混合物或組合物的其他組分的分離不必是徹底的，即，不需要發(fā)生100%分離。 所需要的就是微生物與其他組分(例如，未結合的配體)的分離足以允許微生物的探測而沒有來自其他組分的明顯干擾。例如，分離可導致至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、 95、96、97、98或99%純的或更高的純的微生物沉淀物。在一個實施方案中，分離通過離心步驟來進行，其中將微生物/抗性測定親和配體復合物放置在分離容器中的密度墊層的頂部，且容器在復合物沉淀物在容器的底部和/ 或側部且未結合的配體以及樣品和/或結合混合物或組合物的其他組分留在密度墊層的頂部上或在密度墊層的頂部內(nèi)的條件下離心。該分離將微生物與諸如培養(yǎng)基、細胞碎片和/ 或可能干擾檢測和/或測量抗性測定親和配體與微生物的結合的其他組分等材料相分離。 在一個實施方案中，密度墊層還充當將活的微生物與死的微生物(其不完全地通過密度墊層)相分離的作用。在另一個實施方案中，密度墊層在離心之前或離心之后不包括密度梯度。換言之，沒有將分離容器離心足夠量的時間和/或加速度以使構成密度墊層的材料形成密度梯度。選擇墊層的密度以使樣品和/或結合混合物或組合物中的微生物/抗性測定親和配體復合物穿過墊層而未結合的抗性測定親和配體以及樣品和/或結合混合物或組合物中的其他組分(例如，血液培養(yǎng)肉湯、細胞碎片)保留在墊層的頂部或不穿過密度墊層的全部通路。還可以選擇密度以將活的微生物(其穿過墊)與死的微生物(其不穿過墊)分離。適宜的密度將取決于密度墊層中所用的材料和待分離的樣品。在一個實施方案中，墊層的密度在約1.025至約1. 120g/ml的范圍，例如，約1. 030至約1.070g/ml，約1. 040 M 約1. 060g/ml，或在約1. 025至約1. 120g/ml之間的任何范圍。在另一個實施方案中，墊層的密度為約 1. 025,1. 030,1. 035,1. 040,1. 045,1. 050,1. 055,1. 060,1. 065,1. 070,1. 075、 1. 080,1. 085,1. 090,1. 095,1. 100,1. 105,1. 110,1. 115 或 1. 120g/ml。用于密度墊層的材料可以是具有用于本發(fā)明的方法的適當?shù)拿芏确秶娜魏尾牧匣虿牧系慕M合?？捎脕碇苽涿芏葔|層的適宜的材料包括低粘度、高密度的油，諸如顯微鏡浸油(例如，DF 型；Cargilie Labs, New York)和礦物油(例如，Drakeol 5，Draketex 50, Peneteck ； Penreco Co.，Pennsylvania)。另一種適宜的材料是膠態(tài)二氧化硅。膠態(tài)二氧化硅可以是未涂覆的(例如，Ludox (w. R. Grace, CT))或涂覆的，例如，用硅烷涂覆的(例如，PureSperm (Nidacon Int，1, Sweden),Isolate (Irvine Scientific, Santa Ana, CA)或 Percoll Plus (Sigma-Aldrich，St. Louis, MO))或用聚乙烯吡咯烷酮涂覆的(例如，Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, M0))。在一個實施方案中，選擇表現(xiàn)出對分光鏡探測最少干擾的膠態(tài)二氧化硅，例如，具有最低內(nèi)在熒光的材料?？蓪⒛z態(tài)二氧化硅稀釋于任何適宜的介質(zhì)中以形成合適的密度，所述介質(zhì)例如平衡鹽溶液、生理鹽水和/ 或0. 25M蔗糖。適宜的密度可利用約15%至約80% ν/ν、例如，約20%至約65% ν/ν的濃度的膠態(tài)二氧化硅來獲得。另一種適宜的材料是碘化造影劑(例如，碘海醇(Omnipaque Nycoft^p ，或Nycodenz )和碘克沙醇(Visipaque 或Optift^p )。對于血液培養(yǎng)樣品， 適宜的密度可利用約10%至約25% w/v、例如，約14%至約18% w/v的濃度的碘海醇或碘克沙醇來獲得。對于血液培養(yǎng)樣品，蔗糖能夠以約10%至約30% w/v，例如，約15%至約 20% w/v的濃度用作密度墊層。其他用于密度墊層的適宜的材料包括但不限于硅油(聚二甲基硅氧烷)，氟硅油，硅凝膠，例如對于血液培養(yǎng)樣品在約75 %至約100 %的濃度的甲泛影鈉-Ficoll (Lymphoft^p )，例如對于血液培養(yǎng)樣品在約25%至約50%的濃度的泛影葡胺-葡聚糖(Polymorphoft 印 )，羧甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素、聚氧化乙烯(高分子量)，Pluronie Fl27、piuranie F68、piuranie 化合物的混合物、聚丙烯酸、交聯(lián)的聚乙烯醇、交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷、PEG甲醚甲基丙烯酸酯、果膠、瓊脂糖、黃原膠、吉蘭糖(gellan)、 Phytagel 、山梨糖醇、Ficoll (例如，F(xiàn)icoll 400，對于血液培養(yǎng)樣品在約至約的濃度)、甘油、葡聚糖(例如，對于血液培養(yǎng)樣品在約10%至約15%的濃度)、糖原、氯化銫(例如，對于血液培養(yǎng)樣品在約15%至約35%的濃度)、全氟化碳液體(例如，全氟正辛烷)、氫氟碳液體(例如，Vertrel XF)和如本領域中熟知的類似物。密度墊層也可由材料的組合構成，包括以上所列的材料中的任意兩個或多個的組合。在一個實施方案中，密度墊層由浸油和礦物油的組合制成，例如，以約0. 8份至約1. 2份浸油比約0. 7份至約1. 0份礦物油的比率。在一個實施方案中，密度墊層包括DF浸油和Drakeol 5礦物油，例如，1. 000 份DF型浸油0. 875份Drakeol 5礦物油。在另一個實施方案中，密度墊層由氯化銫組成 (例如，24% w/v氯化銫)。密度墊層的體積/高度應足以實現(xiàn)微生物/抗性測定親和配體復合物與未結合的抗性測定親和配體以及樣品和/或結合混合物或組合物的其他組分的分離。體積將取決于分離容器的尺寸和形狀。通常，可使用約0. Iml至約5ml的體積，例如，約0. 2ml至約lml，例如，約0.2ml至約0.5ml。如果分離以微量進行，密度墊層的體積可以為約1 μ 1至約100μ 1，例如，約5μ 1至約50μ 1。置放或層疊在密度墊層的頂部的樣品和/或結合混合物或組合物的體積應足以提供足夠的可檢測和/或可測量的微生物，例如，以產(chǎn)生適宜于探測的沉淀物。通常，可使用適合容器的任何體積。例如，可使用約0. Iml至約5ml的體積，例如，約0. 2ml至約1ml，例如，約0. 2ml至約0. 5ml。如果以微量進行分離，體積可以為約1 μ 1至約100 μ 1，例如，約5 μ 1至約50 μ 1。在某些實施方案中，在將樣品和/或結合混合物或組合物放置在分離容器中之前可減少體積和/或提高微生物的濃度以使樣品和/ 或結合混合物或組合物具有適合容器的適當?shù)捏w積。例如，樣品和/或結合混合物或組合物可被過濾以減少體積和/或收集微生物。容器中用于樣品和/或結合混合物或組合物的可用空間將取決于容器的尺寸和形狀。在一些實施方案中，可在將樣品和/或結合混合物或組合物置于或層疊在頂部之前將中間層(液體或固體)置于密度墊層的頂部以防止密度墊層與樣品和/或結合混合物或組合物的任何混合。在一個實施方案中，中間層可以是聚丙烯珠子。在另一個實施方案中，可在密度墊層與樣品和/或結合混合物或組合物之間安置小氣泡以防止混合。在另一個實施方案中，可將密度墊層層疊在高密度材料(例如，全氟化碳液體)的頂部，使得微生物/抗性測定親和配體復合物在分離過程中穿過密度墊層并聚集在密度墊層和高密度材料之間的界面。在本發(fā)明的一個實施方案中，離心分離容器以使微生物/抗性測定親和配體復合物直接在容器底部形成沉淀物。以足夠的加速度離心容器并持續(xù)足夠的時間以使微生物/ 抗性測定親和配體復合物沉淀和/或與未結合的配體以及樣品和/或結合混合物或組合物的其他組分相分離。離心加速度可以為約1，OOOx g至約20，OOOx g，例如，約2，500x g至約15，OOOx g，例如，約7，500xg至約12，500xg，等等。離心時間可以為約30秒至約30分鐘，例如，約1分鐘至約15分鐘，例如，約1分鐘至約5分鐘。離心可在約2°C至約45°C， 例如，約15°C至約40°C，例如，約20°C至約30°C的溫度下進行。在一個實施方案中，分離容器包括封蓋，且在離心前將該封蓋應用于容器以形成氣密密封。封蓋的存在降低了處理傳染性的和/或有害的或可能為傳染性的和/或有害的微生物的風險，以及污染樣品和/ 或結合混合物或組合物的風險。本發(fā)明的方法的優(yōu)點之一是在密封的容器(例如，氣密密封容器)中利用微生物進行方法的任何一個或多個步驟(例如，接觸、分離、檢測和/或比較)。本方法涉及自動化系統(tǒng)的使用，避免了與處理高毒性微生物有關的健康和安全風險， 例如伴隨從樣品回收微生物以用于直接檢驗所發(fā)生的。在一個實施方案中，不將容器離心足以在密度墊層內(nèi)形成密度梯度的時間和/或力。本發(fā)明不涉及超速離心，例如，以大于約 100，OOOxg的力離心。并且，本發(fā)明不涉及等密度(平衡)沉降或區(qū)帶(banding)。分離容器可以是具有足以容納密度墊層和樣品和/或結合混合物或組合物的體積的任何容器。在一個實施方案中，容器適于或可使其適于離心機轉子。容器的體積可以為約0. Iml至約25ml，例如，約Iml至約10ml，例如，約2ml至約8ml。如果分離以微量進行，容器的體積可以為約2 μ 1至約100 μ 1，例如，約5 μ 1至約50 μ 1。在一個實施方案中， 容器在上部具有寬的內(nèi)徑以容納樣品和/或結合混合物或組合物以及密度墊層的大部分， 且在下部具有較狹窄的內(nèi)徑，其中收集微生物/抗性測定親和配體復合物的沉淀物。狹窄部分可具有約0. 04英寸至約0. 12英寸的內(nèi)徑，例如，約0. 06英寸至約0. 10英寸，例如， 約0. 08英寸。寬部分可具有約0. 32英寸至約0. 40英寸的內(nèi)徑，例如，約0. 34英寸至約0.38英寸，例如，約0.36英寸。對于微量分離，內(nèi)徑可甚至更小。例如，狹窄部分的內(nèi)徑可以為約0. 001英寸至約0. 04英寸，例如，約0. 002至約0. 01英寸。逐漸變細的內(nèi)徑部分可連接上部和下部。逐漸變細的部分可具有約20度至約70度的角度，例如，約30度至約 60度。在一個實施方案中，下部狹窄部分小于容器的總高度的一半，例如，小于容器的總高度的約40<%、30%、20%或10%。容器可具有連接的封蓋裝置或可以是帶螺紋的以接受封蓋裝置(例如，蓋)從而使容器在離心過程中可以是氣密密封的。在某些實施方案中，設計容器使得分離之后可容易地手動地或以自動化的方式(從而技術員不暴露于容器內(nèi)容物) 從容器回收微生物沉淀物。例如，容器可包括可移除部分或拆卸部分，所述可移除部分或拆卸部分含有沉淀物且可與容器的其余部分分離。在另一個實施方案中，容器包括用于在分離之后接近沉淀物的部件，例如用于插入針頭和/或其他取樣裝置和/或用于吸去沉淀物的一個或多個端口或可穿透表面。在一個實施方案中，容器可以是管，例如，離心管。在另一個實施方案中，容器可以是小片(chip)或卡片。在一個實施方案中，容器是獨立的容器， 艮口，用于分離單一樣品的裝置。在其他實施方案中，容器是包括兩個或多個分離容器從而可同時分離多個樣品的裝置的一部分。在一個實施方案中，裝置包括2個、3個、4個、5個、6 個、7個、8個、9個、10個、12個、15個、20個、25個、30個、36個、42個、48個、60個、72個、 84個、96個或更多個分離容器。在一個實施方案中，分離容器是在于2009年10月30日提交的標題為"Separation Device for Usein the Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms (用于微生物的分離、表征和/或鑒定的分離裝置)” 的相關美國專利申請系列第12/589,969號中所公開的分離裝置。容器可包括光學窗口，通過其可測定結合(例如，檢測結合的量和/或測量結合親和力)。光學窗口可以在容器的底部、頂部、和/或側部。窗口可由透光(例如，近紅外光譜(NIR ；700nm-1400nm)、紫外光譜(UV ； 190nm_400nm)和/或可見光譜(VIS ；400nm_700nm) 的至少一部分)的任何材料組成。適宜的材料的例子包括但不限于，丙烯酸酯(acrylic)、 甲基丙烯酸酯、石英、熔凝硅石、藍寶石、環(huán)烯烴共聚物(COC)、聚苯乙烯、聚碳酸酯和/或聚丙烯。在一個實施方案中，整個容器由光學窗口材料制成。在另一個實施方案中，容器可由兩個或多個分離的零件和組成容器其余部分的另一種材料(例如，成本較低的標準模制塑料)來制備(例如，模制)，所述兩個或多個分離的零件例如用于光學窗口的光學 UV-VIS-OTR透明組分。在一個實施方案中，光學窗口足夠薄以允許分光鏡探測，這將取決于窗口的材料。在另一個實施方案中，光學窗口盡可能地薄以減少對分光鏡探測的干擾。例如，窗口可具有小于約0. 20英寸的厚度，例如，小于約0. 15,0. 10或0. 05英寸。在另一個實施方案中，分離通過過濾步驟來進行，其中將樣品和/或結合混合物或組合物放置在裝備有具有保留微生物的孔徑的選擇性過濾器或過濾器組的裝置中。保留的微生物可通過將適宜的緩沖液平緩地通過過濾器來洗滌。且然后可直接在過濾器上對被洗滌的微生物進行探測和/或通過從過濾器表面直接取樣或通過用適宜的緩沖溶液反沖洗過濾器而回收被洗滌的微生物以用于探測。任選的裂解步驟在本發(fā)明的方法的一些實施方案中，可任選地處理(例如，在分離步驟之前)包括微生物的樣品以選擇性地裂解可能存在于樣品中的非微生物細胞(例如，非期望的細胞)， 諸如血細胞和/或組織細胞。裂解細胞以允許微生物與樣品中的其他組分相分離。微生物
15與其他組分的分離避免了檢測步驟中的干擾。如果預期非微生物細胞在樣品中不存在或可能不存在，或預期其不干擾檢測步驟，則不必進行裂解步驟。在一個實施方案中，待裂解的細胞是存在于樣品中的非微生物細胞，且可能存在于樣品中的微生物細胞沒有被裂解。然而，在一些實施方案中，特定種類的微生物的選擇性裂解可能是期望的，且因此可根據(jù)本文所描述的方法和如本領域中所熟知的方法來進行。例如，可選擇性地裂解一類非期望的微生物，例如，裂解酵母而不裂解細菌，或反之亦然。在另一個實施方案中，裂解所期望的微生物以分離微生物的特定亞細胞組分，例如，細胞膜或細胞器。在一個實施方案中，裂解所有的非微生物細胞。在其他的實施方案中，裂解一部分非微生物細胞，例如，足夠的細胞，以防止干擾檢測步驟。細胞的裂解可通過本領域中已知的任何有效的方法來進行以選擇性地裂解細胞同時裂解或不裂解微生物，所述方法包括但不限于，裂解液的添加、超聲、滲透休克、 凍融循環(huán)、化學處理和/或其組合。裂解液是能夠裂解細胞的溶液，所述細胞例如，非微生物細胞(例如，通過溶解真核細胞膜)和/或微生物細胞。在一個實施方案中，裂解液可包括一種或多種去污劑、一種或多種酶、或一種或多種去污劑與一種或多種酶的組合，且還可包括其他的劑。在一個實施方案中，去污劑可以是非變性的裂解性去污劑，諸如Triton X-100 Triton X-100-R、 Triton X_114、NP_40、Genapol C-100、Genapol X-IOO Jgepal CA 630、Arlasolve 200、 Brij 96/97、CHAPS、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、皂苷、單十二烷基九乙二醇醚(C12E9，聚多卡醇(polidocenol))，和聚氧乙烯醚(C12E10，例如，Genapol C—100)。任選地，可包括
變性裂解性去污劑，例如十二烷基硫酸鈉、N-月桂基肌氨酸、脫氧膽酸鈉、膽汁鹽類、溴化十六烷基三甲基銨、SB3-10、SB3-12、酰氨基磺基甜菜堿-14(amidosulfobetaine-14)和
C7Bz0o 任選地，還可包括增溶劑，例如Brij 98、Brij 58、Brij 35、Tween 80、Tween 20>Pluronic L64,piuronic P84,piur0nic F108、非去污劑磺基甜菜堿(NDSB 201)、兩親高分子(amphipol) (PMAL-C8)和甲基-β-環(huán)糊精。通常，使用高于臨界膠束濃度(CMC) 的濃度的非變性去污劑和增溶劑，而變性去污劑可以低于其CMC的濃度來添加。例如，可使用約0. 010%至約10%，例如，約0. 015%至約1. 0%，例如，約0. 05%至約0. 5%，例如，約 0. 10%至約0. 30%的濃度(樣品稀釋后的終濃度)的非變性裂解去污劑。在另一個實施方案中，聚氧乙烯去污劑去污劑可能是優(yōu)選的。聚氧乙烯去污劑可包括結構c12_18/E9_1(l，其中 C12-18代表從12個碳原子至18個碳原子的碳鏈長度和E9-10代表從9個到10個氧乙烯親水性首基。例如，聚氧乙烯去污劑可選自由以下組成的組Brij 97、Brij 96V、 GenapolC-100, Genapol X-100、聚多卡醇，或它們的組合。可用于裂解液中的酶包括，但不限于，消化核酸和其他膜污垢物質(zhì)的酶(例如，蛋白酶XXIII、DNA酶、神經(jīng)氨酸酶、多糖酶、 Glucanex 、和Pectinex )?？墒褂玫钠渌砑觿┌ǖ幌抻?，還原劑諸如2-巰基乙醇Q-Me)或二硫蘇糖醇(DTT)，和穩(wěn)定劑諸如鎂、丙酮酸鹽，和濕潤劑。裂解液可在適宜于裂解期望的細胞的任何PH下緩沖，且將取決于多種因素，包括但不限于，樣品的類型、待裂解的細胞和所用的去污劑。在一些實施方案中，PH可以在約2至約13的范圍中，例如，約 6至約13，例如，約8至約13，例如，約10至約13。適宜的pH緩沖液包括能夠將pH維持在期望的范圍中的任何緩沖液，例如，約0. 05M至約1. OM CAPS。
在一個實施方案中，將樣品與裂解液混合且然后孵育足以發(fā)生細胞膜的裂解和溶解的時間，例如，約 1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50或60秒，或約2、3、4、5、6、7、8、9、10、
15或20分鐘或更長，例如，約1秒至約20分鐘，約1秒至約5分鐘，或約1秒至約2分鐘。 孵育時間將取決于裂解液的強度，例如，去污劑和/或酶的濃度和裂解的溫度。一般來說， 較弱的裂解緩沖液將需要更多時間和更大的樣品稀釋度以完全溶解非微生物細胞。裂解液的強度可根據(jù)已知存在于或懷疑存在于樣品中的微生物來選擇。對于對裂解更敏感的微生物，可使用弱的裂解液。裂解可在約2°C至約45°C的溫度發(fā)生，例如，約15°C至約40°C，例如，約30°C至約40°C。在一個實施方案中，可將裂解液載入注射器中且然后可將樣品吸入注射器中從而在注射器中進行混合和孵育。在一些實施方案中，裂解條件(例如，溶液或孵育時間)，以及分離和/或探測步驟，可足以殺死樣品中的一些或所有微生物。本發(fā)明的方法是高度靈活的且進行分離和鑒定不需要活的微生物。在某些實施方案中，微生物中的一些或全部可以是死的，死亡發(fā)生在進行方法的步驟之前、進行方法的步驟期間和/或進行方法的步驟之后。檢測/比較步驟—旦微生物/抗性測定親和配體復合物已與未結合的抗性測定親和配體分離，可檢測和/或測量與微生物結合的抗性測定親和配體的量或配體的結合親和力。如果通過離心分離微生物/抗性測定親和配體復合物以產(chǎn)生沉淀物，可對所述沉淀物進行探測以檢測抗性測定親和配體的結合的量或結合親和力。在一個實施方案中，探測以非侵入性的方式進行，即，當沉淀物保留在分離容器中時對其進行探測。在另一個實施方案中，在探測期間分離容器保持密封。以非侵入方式鑒定抗生素抗性微生物、任選地同時在分離和表征過程中保持容器密封和使程序中的一些或全部自動化的能力避免了污染的和/或傳染性的樣品的持續(xù)操作并極大提高了整個過程的安全性。此外，通過直接探測而不對沉淀物進行另外的處理(例如，重懸、鋪板和菌落的培養(yǎng))來表征微生物的能力，極大提高了可進行抗生素抗性微生物的鑒定的速度。在本發(fā)明的某些方面，方法包括在探測微生物之前從分離容器中回收在分離步驟過程中形成的微生物/抗性測定親和配體復合物的沉淀物或其部分。例如，在形成沉淀物之后，可將液體吸離沉淀物并將沉淀物重懸于適宜的介質(zhì)(例如，在其中微生物為活的的介質(zhì))中。可將重懸的微生物從分離容器中移除。然后可探測微生物以檢測配體結合或親和力，例如，在懸浮液中或在已將它們再沉淀之后進行探測。在其他的實施方案中，可在分離容器中對重懸的微生物進行探測，例如，在懸浮液中或在已將它們再沉淀之后進行探測。 在另一個實施方案中，原位探測之后回收和/或重懸沉淀物并然后進行進一步的探測。例如，對于回收的和/或重懸的微生物可進行可應用于分離的微生物而非微生物的沉淀物的技術，諸如膠乳凝集檢驗或自動化表型鑒定檢驗。在另一個實施方案中，可將從沉淀物回收的微生物直接用于進一步的探測(例如，質(zhì)譜)而不進行重懸。在一些實施方案中，可對沉淀物和/或重懸的微生物進行分光鏡探測。可使用光譜學來分析抗性測定親和配體的性質(zhì)(例如，內(nèi)在性質(zhì)或結合的標記物的性質(zhì))以檢測結合。除檢測抗性測定親和配體之外，還可使用光譜學來分析復合物中的微生物的一種或多種內(nèi)在性質(zhì)(例如，內(nèi)在熒光)，例如，無外加劑(additional agent)諸如染色劑、染料、粘合劑等時微生物中存在的性質(zhì)。微生物，尤其是細菌，其內(nèi)在熒光或自發(fā)熒光利用了細菌含
17有天然熒光團(例如，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、NADH和黃素)的事實，所述天然熒光團可經(jīng)由多波長光源激發(fā)。在這些實施方案中，抗性測定親和配體的結合可與微生物的內(nèi)在性質(zhì)信號相比較，且可在每個細胞基礎上計算結合的配體的量?？衫弥T如熒光光譜、漫反射光譜、吸收和透射光譜、紅外光譜、太赫茲光譜、拉曼光譜進行探測，所述拉曼光譜包括表面增強拉曼光譜(SERS)、空間偏移拉曼光譜和/或共振拉曼光譜來。為增強拉曼(SERS)和熒光信號，可在離心之前用金和/或銀納米顆粒涂覆微生物，和/或可用特定尺寸和形狀的金屬膠體來預涂覆內(nèi)部光學表面(Lakowicz，Anal. Biochem. 337 =171 (2005)關于熒光； Efrima 等人，J. Phys. Chem. B. (Letter) 102 :5947 (1998)關于 SERS)。在另一個實施方案中， 納米顆粒在離心之前存在于密度墊層中并當微生物穿過密度墊層時與微生物締合。在其他的實施方案中，可利用質(zhì)譜技術探測微生物(重懸的或沉淀物中的微生物)，所述質(zhì)譜技術諸如MALDI-T0F質(zhì)譜、DESI質(zhì)譜、GC質(zhì)譜、LC質(zhì)譜和選擇離子流動管(SIFT)質(zhì)譜。在一個實施方案中，當沉淀物保留在分離容器中時探測該沉淀物?？赏ㄟ^容器中的光學窗口對容器進行探測。光學窗口可在容器的底部和/或任何一側或多側和/或頂部上。在一個實施方案中，在適宜于探測的位置中，分離容器適合于分光計中的支持器(holder)或可使分離容器適合于分光計中的支持器。可通過本領域那些技術人員已知的有效檢測抗性測定親和配體和/或微生物的一種或多種內(nèi)在性質(zhì)或外在性質(zhì)的任何技術來進行分光鏡探測。例如， 正表面熒光(激發(fā)光和發(fā)射光進入其中并離開相同的光學表面，且如果樣品是一般光學厚度的，則激發(fā)光穿透非常短的距離進入到樣品中(參見，例如，Eisinger, J.，和J.Flores， "Front-face fluorometry of liquid samples，”(液體樣品的正表面熒光測定術)Anal. Biochem. 94 :15 (1983))，可用來檢測沉淀物中的微生物。其他形式的測量，諸如，落射熒光 (epifluorescence)、反射系數(shù)、吸光度和/或散射測量，也可用于本發(fā)明。在本發(fā)明的某些方面，除分析微生物的一種或多種內(nèi)在性質(zhì)以用于在每個細胞基礎上測定配體結合的目的之外，內(nèi)在性質(zhì)可用來鑒定微生物。在一個實施方案中，將微生物的內(nèi)在性質(zhì)與已知生物的內(nèi)在性質(zhì)的數(shù)據(jù)庫相比較以鑒定微生物。在另一個實施方案中，抗性的測定可通過測量檢驗微生物的測量性質(zhì)的改變(例如，內(nèi)在熒光性質(zhì)的改變)和/或通過用于監(jiān)測新陳代謝或膜完整性的熒光染料的使用來間接地進行。根據(jù)本實施方案，配體或劑本身不需要發(fā)出可檢測信號或被標記可檢測信號， 因為抗性通過間接測量由配體或劑與檢驗微生物的結合引起的可測量性質(zhì)的改變(例如， 內(nèi)在熒光性質(zhì)的改變)來測定。例如，未標記的抗生素的結合和/或暴露可能改變、轉變微生物的細胞壁或使微生物的細胞壁變薄?？蓪ξ⑸镞M行探測(例如，通過本文其他處所描述的光譜學)且可間接地測量細胞壁的改變并與已知的抗性和/或敏感性微生物的數(shù)據(jù)庫相比較來測定微生物的抗微生物劑抗性狀況。可選地，轉變的或變薄的細胞壁對于一種或多種熒光染料可能是可滲透的(或更可滲透的)，因此，可將一種或多種熒光染料添加到樣品中并探測樣品以檢測和/或測量熒光染料以間接地測定微生物的抗微生物劑抗性狀況(參見，例如，實施例5)。樣品照明光源或激發(fā)光源可選自本領域中的技術人員已知的任何數(shù)目的適宜的光源?？墒褂卯a(chǎn)生可用數(shù)據(jù)的電磁波譜的任何部分。可使用能夠發(fā)射紫外光譜、可見光譜和/或近紅外線光譜以及電磁波譜的其他部分的光源，這些為本領域技術人員所知。例如， 光源可以是連續(xù)光譜燈，諸如用于產(chǎn)生紫外光的氘或氙弧燈和/或用于產(chǎn)生可見激發(fā)光/近紅外激發(fā)光的鎢鹵素燈。如本領域中所熟知，這些光源提供了寬泛的發(fā)射范圍且可利用光學干擾濾器、棱鏡和/或光柵來減少用于特定激發(fā)波長的光譜帶寬?？蛇x地，多個窄帶光源，諸如發(fā)光二極管和/或激光，可以空間多路傳輸以提供多波長激發(fā)光源。例如，發(fā)光二極管在190nm到超過900nm是可用的，且該源具有20-40nm的譜帶寬度(半高全寬)。激光在從紫外到近紅外的離散波長中是可用的，并且可以用于本領域技術人員熟知的多路傳輸(multiplexing)方法。任何光源的光譜選擇性可以通過利用光譜區(qū)分裝置來改善，例如掃描單色器。也可以使用其他的區(qū)分方法，如本領域技術人員所熟知的，例如聲光可調(diào)濾波器、液晶可調(diào)濾波器、光學干涉濾波器陣、棱鏡攝譜儀，等等，及其任何組合。選擇光譜鑒別器要考慮的是調(diào)節(jié)范圍和選擇性水平。舉例說明，例如，鑒別器可以使用波長范圍300-800nm和選擇性 lOnm。這些參數(shù)通常決定達到調(diào)節(jié)范圍和選擇性所必需的最優(yōu)技術。通常，光源引起樣品激發(fā)，隨后在預設時間點或連續(xù)測量從樣品發(fā)射的熒光。類似的，可以測量來自激發(fā)源與樣品的相互作用的反射光，以提供檢測和/或表征的有關數(shù)據(jù)。來自樣品的發(fā)射可以通過任何合適的光譜區(qū)分裝置測量，且在某些實施方案中使用分光計。分光計可以是檢測特定的發(fā)射波長的掃描單色器，其中掃描單色器的輸出由光電倍增管檢測，和/或分光計可以被配置成圖像攝譜儀，其中輸出由圖像檢測器陣例如電荷耦合器件(CCD)檢測器陣檢測。在一個實施方案中，鑒別器允許通過光電檢測裝置(例如光電倍增管、雪崩光電二極管、CCD檢測器陣、和/或電子倍增電荷耦合器件(EMCCD)檢測器陣)觀察熒光和/或散射信號。使用分光鏡技術來獲得測量結果，所述測量結果優(yōu)選地提供為激發(fā)-發(fā)射矩陣 (EEM)測量結果。如本文所用，EEM被定義為熒光物質(zhì)的發(fā)光光譜發(fā)射強度，是激發(fā)波長和發(fā)射波長兩者的函數(shù)，且EEM包括完整光譜或其子集，其中子集可以含有單一或多個激發(fā)/ 發(fā)射對。另外，具有固定激發(fā)波長的EEM的截面圖可以用于顯示特定激發(fā)波長的發(fā)射光譜， 而具有固定發(fā)射波長的EEM的截面圖可以用于顯示樣品的激發(fā)光譜。在一個實施方案中， 多個EEM在多于一個的特定激發(fā)-發(fā)射波長對處被測量，例如，至少在2、3、4、5、6、7、8、9、10 或更多特定激發(fā)-發(fā)射波長對。例如，可在檢測抗性測定親和配體的波長處采集一個或多個EEM，并在檢測微生物的內(nèi)在性質(zhì)的波長處，諸如瑞利散射點O60-580nm)、色氨酸O85/350nm)、膠原 (305/315-330nm), NADH (345/460nm)和黃素 06O/52Onm)，采集一個或多個另外的 EEM。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，已發(fā)現(xiàn)正面熒光光譜學提供了測量高度散射和高度猝滅樣品的熒光和/或反射性質(zhì)的優(yōu)點。正面方法是特別有用的光譜學方法，因為該配置較少受血液和微生物培養(yǎng)基的干擾組分的影響。如本領域中的技術人員已知的，可以以提供可接受的結果的角度來照射容器的光學表面，(例如，Eisinger, J.，和J.Flores， "Front-face fluorometry ofliquid samples, (ηππ WlEM^cTtllJ^^ ) "Anal. Biochem. 94 :15-21 (1983))。在一個實施方案中，設計系統(tǒng)以使分光鏡系統(tǒng)除在一個定角的最小處測量發(fā)射的熒光之外，在一個定角的最小處測量漫散射的光。根據(jù)本發(fā)明，對已知微生物(抗生素敏感性和/或抗生素抗性)進行對照測量， 因此允許利用本領域中的技術人員已知的多種數(shù)學方法將所測量的檢驗數(shù)據(jù)與感興趣的微生物的表征相關聯(lián)。例如，利用本領域中的技術人員已知的軟件系統(tǒng)可將來自樣品的數(shù)據(jù)與基線測量結果或對照測量結果相比較。更具體地，通過多種多元分析方法可對數(shù)據(jù)進行分析，所述多元分析方法諸如，例如，一般化判別分析(GDA)、偏最小二乘法判別分析(PLSDA)、偏最小二乘回歸、主成分分析(PCA)、平行因子分析(PARAFAC)、神經(jīng)網(wǎng)絡分析 (NNA)和/或支持向量機(SVM)。在一個實施方案中，比較步驟包括將結合的抗性測定親和配體的量或結合親和力與同樣的微生物的抗生素敏感性菌株或抗生素抗性菌株相比較。在另一個實施方案中，比較步驟包括將結合的抗性測定親和配體的量或結合親和力與同樣的微生物的抗生素敏感性菌株和抗生素抗性菌株二者相比較。在一個實施方案中，對同樣微生物的已知抗生素敏感性菌株或抗生素抗性菌株的結合的量或結合親和力與由微生物所結合的量同時進行測定。在另一個實施方案中，先前已測定了對于同樣的微生物的已知的抗生素敏感性或抗生素抗性菌株的結合的量或結合親和力。先前測定的數(shù)據(jù)可存在于諸如數(shù)據(jù)庫中。除測量微生物的抗生素抗性和任選地測量微生物的一種或多種內(nèi)在性質(zhì)(例如，內(nèi)在熒光)之外，本發(fā)明的方法還可包括使用另外的鑒定劑來協(xié)助分離和/或表征過程。與特定微生物結合的劑，諸如親和配體，可用來分離微生物以鑒定微生物的類別或種(例如，通過與獨特的表面蛋白或受體結合)和/或鑒定微生物的特性。有用的鑒定劑或親和配體包括，但不限于，單克隆和多克隆抗體和其片段(例如，用于金黃色葡萄球菌的鑒定的抗-Eap)、核酸探針、適體、肽模擬物、噬菌體來源的結合蛋白、凝集素、宿主防御肽(例如，防御素、導管素(cathelicidin)、抗菌肽(proteogrin)、爪蟾抗菌肽)、 細菌素(bacterocin)(例如，硫醚抗生素(Iantibiotic)如，乳酸鏈球菌肽、美殺菌素 (mersacidin)、表皮素、galIidermin 和植物乳桿菌素 C(plantaricin C)，以及 II 類肽)、 噬菌體以及核酸、脂質(zhì)、碳水化合物、多糖或蛋白的選擇性染料，或其任何組合。如果劑本身不發(fā)出可檢測信號，那么劑可以被標記以提供可檢測信號，例如通過將劑軛合到標志物上 (例如，可見的或熒光的標志物)。標志物包括但不限于，熒光的、發(fā)光的、發(fā)磷光的、放射性的、拉曼活性的、質(zhì)譜反應性的和/或比色的化合物。所述劑可以在本發(fā)明方法中的任何步驟添加到微生物中，例如，當樣品在接觸步驟過程中、在分離步驟過程中、和/或在檢測步驟過程中被獲得時。在一些實施方案中，所述劑在沉淀物中的存在可以在探測沉淀物的過程中測定。其他有用的鑒定劑包括，微生物酶的底物、螯合劑、光敏劑、猝滅劑、還原劑、氧化齊U、緩沖液、酸、堿、溶劑、固定齊 、去污齊 、表面活性劑、消毒劑(例如，酒精、漂白齊 、過氧化氫)和毒性化合物(例如，疊氮化鈉、氰化鉀)和代謝抑制劑例如環(huán)己酰胺、等等。類似地， 許多用于測量微生物細胞活力、新陳代謝和/或膜電位的熒光化合物，可以用作本發(fā)明的鑒定劑。如將被本領域中的技術人員之一所容易理解地，特定微生物對任何影響其物理狀態(tài)或新陳代謝的化合物諸如抗生素的敏感性，可通過向樣品、裂解緩沖液、密度墊層或其任何混合物中添加化合物而快速地確定。在本發(fā)明的一方面，方法還可包括回收微生物/抗性測定親和配體復合物的沉淀物并進行另外的檢驗的步驟。在一個實施方案中，沉淀物可通過從樣品介質(zhì)和/或結合混合物或組合物以及密度墊層中吸出而回收。在另一個實施方案中，沉淀物可通過將注射器插入到容器中且在樣品培養(yǎng)基和/或結合混合物或組合物和密度墊層保持完整時吸出沉淀物而回收。然后可將回收的沉淀物重懸于適宜的介質(zhì)中，例如，鹽水。重懸后，可對微生物進行期望的任何另外的檢驗，如本領域中的技術人員所已知和如以上所描述。尤其是，需要清潔的微生物樣品的任何檢驗可利用重懸的微生物來進行。在一些實施方案中，可進行另外的鑒定檢驗。鑒定檢驗的例子包括Vitek2、擴增和非擴增的核酸檢驗(NAT)、生色測定和膠乳凝集測定、免疫測定(例如，使用標記的抗體和/或其他配體的免疫測定)、質(zhì)譜(例如，MALDI-T0F質(zhì)譜)和/或其他光學技術諸如紅外光譜學(FTIR)或拉曼光譜學。還可進行另外的表征檢驗，諸如藥物抗性。另外的表征可以是在方法的初始分離步驟和表征步驟過程中開始的檢驗的部分。在本發(fā)明的一方面，方法步驟中的一些或全部可以是自動化的。如本文所用的，術語“自動化”意為計算機控制的。在一個實施方案中，多個熒光發(fā)射檢測和相關步驟是自動化的，且獲自方法的結果信息被自動化地用來填充數(shù)據(jù)庫。在另外的實施方案中，方法中的其他步驟，諸如接觸、分離和/或檢測也可以是自動化的。使方法的步驟自動化不僅允許更快速地檢驗更多的樣品，其還降低了在處理可能包含有害的和/或傳染性微生物的樣品中的人為失誤的風險。在另一方面，本發(fā)明涉及用于鑒定抗生素抗性微生物的系統(tǒng)，包括(a)容器，所述容器包括微生物或含有微生物的樣品以及抗性測定親和配體；(b)密度墊層；和(c)提供測量結果的分光計；其中所述測量結果鑒定已通過在所述系統(tǒng)內(nèi)進行原位分離而在所述容器中濃縮的所述抗生素抗性微生物。在另一個實施方案中，系統(tǒng)包括用于將微生物與未結合的抗性測定親和配體分離的離心機。以下的實施例進一步詳述了本發(fā)明，所述實施例以示例的方式提供并且不意在以任何方式限制本發(fā)明。使用了本領域中熟知的標準技術或以下具體描述的技術。
實施例實施例1. B0CILLIN -FL與MRSA菌株和MSSA菌株的結合使用了兩種實驗方法來檢驗B0CILLIN -FL(Molecular Probes, Invitrogen)與金黃色葡萄球菌的結合(1)用氫氧化鈉(NaOH)處理細胞，中和，添加B0CILLIN -FL，然后分離細胞(粗預處理)；和(2)用B0CILLIN -FL培養(yǎng)細胞，然后分離細胞(新陳代謝標記)。對于第一種方法，在胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)中培養(yǎng)金黃色葡萄球菌菌株ATCC 25923(甲氧西林敏感性；MSSA)和D14906(甲氧西林抗性；MRSA)直至指數(shù)生長(6小時)。 將每個懸浮液的樣品(TSB 中的 0. 9ml)和 0. IN NaOH(0. Iml ；士20 μ 1 7. 5%TRITON X100-R)渦旋5秒鐘，然后立即或在1分鐘之后通過添加IM KH2PO4 (0. 125ml)并渦旋5秒鐘進行中和。將B0CILLIN -FL(1. 0mg/ml的15 μ 1)添加到懸浮液中，然后使其渦旋，并在室溫下孵育5分鐘。通過將0. 2ml的油共混物(1. 0份的DF型顯微鏡浸油+0. 875份的Drakeol 5礦物油)上方的混合物在10，000印!11下離心1分鐘以除去未結合的肌(11^訊"4^，所述油共混物是優(yōu)化的以將微生物與培養(yǎng)基相分離。去除上清液和油層并將沉淀物重懸于3. Oml PBS，pH 7. 4中。在FluoroLog-3系統(tǒng)中在490nm的激發(fā)波長處掃描樣品，并記錄510nm處的熒光發(fā)射。結果顯示于表1中。在pH 12下處理細胞5秒鐘導致了與MRSA細胞相比更多的 B0CILLIN -FL與MSSA細胞結合(條件a = 2. 3比值)。將Trition X-100包括在反應混合物中沒有獲得益處。將細胞在PH 12下的處理增加至60秒鐘沒有提供益處，并導致細胞損失。表權利要求
1.一種用于測定微生物的抗生素抗性狀況的方法，所述方法包括(a)在可形成微生物/抗性測定親和配體復合物的條件下，將所述微生物與抗性測定親和配體相接觸；(b)將(a)中形成的微生物/抗性測定親和配體復合物與未結合的抗性測定親和配體相分離；(c)測定所述微生物/抗性測定親和配體復合物中與所述微生物結合的抗性測定親和配體的量；和(d)將所述微生物/抗性測定親和配體復合物中與所述微生物結合的抗性測定親和配體的量與被同樣的微生物的已知的抗生素敏感性或抗生素抗性菌株或已知的抗生素敏感性或抗生素抗性菌株的群體所結合的抗性測定親和配體的量相比較；其中如果所述微生物/抗性測定親和配體復合物中的所述微生物結合的抗性測定親和配體的量與所述抗生素敏感性微生物結合的抗性測定親和配體的量不同，或所述微生物 /抗性測定親和配體復合物中的所述微生物結合的抗性測定親和配體的量與所述抗生素抗性微生物結合的抗性測定親和配體的量相同，那么所述微生物被鑒定為抗生素抗性的。
2.如權利要求1所述的方法，其中步驟(a)、(b)、(c)和/或(d)中的一個或多個在密封的容器中進行。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述抗性測定親和配體選自由以下組成的組抗生素，單克隆抗體和多克隆抗體及其片段，核酸探針，酶底物，適體，肽模擬物，噬菌體來源的結合蛋白，凝集素，宿主防御肽，細菌素，噬菌體，對核酸、脂質(zhì)、碳水化合物、多糖、蛋白選擇性的染料，和其組合。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述抗性測定親和配體是抗生素。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述抗性測定親和配體是內(nèi)酰胺抗生素或糖肽抗生素。
6.如權利要求1所述的方法，其中所述抗性測定親和配體包括可檢測的標記物。
7.如權利要求6所述的方法，其中所述可檢測的標記物是熒光的、發(fā)光的、發(fā)磷光的、 放射性的、拉曼活性的、質(zhì)譜反應性的和/或比色的化合物標記物。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述微生物在臨床或非臨床樣品中。
9.如權利要求8所述的方法，其中所述樣品來自陽性血液培養(yǎng)物。
10.如權利要求1所述的方法，其中在分離步驟(b)之前對包括所述微生物的樣品進行處理以選擇性地裂解可能存在于所述樣品中的任何非微生物細胞。
11.如權利要求1所述的方法，其中所述微生物被層疊在容器中的密度墊層上并且分離步驟(b)是通過離心所述容器。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述密度墊層包括以下物質(zhì)的一種或多種的任何組合顯微鏡浸油、礦物油、硅油、氟硅油、硅凝膠、膠態(tài)二氧化硅、碘化造影劑、蔗糖、甲泛影酸鹽-Ficoll 、泛影酸鹽-葡聚糖、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚氧化乙烯(高分子量)、Pluronie F127、piuronie F68、聚丙烯酸、交聯(lián)的聚乙烯醇、交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷、PEG甲醚甲基丙烯酸酯、果膠、瓊脂糖、黃原膠、吉蘭糖、Phytagel 、山梨糖醇、:Fieall 、 甘油、葡聚糖、糖原、氯化銫、全氟化碳液體、和/或氫氟碳液體。
13.如權利要求11所述的方法，其中所述密度墊層具有約1.025g/ml至約1. 120g/ml 的密度。
14.如權利要求11所述的方法，其中所述容器包括在所述容器的底部、頂部和/或一個或多個側部的光學窗口，并且其中所述光學窗口可透過近紅外光譜、紫外光譜和/或可見光譜中的至少一部分。
15.如權利要求1所述的方法，其中所述測定步驟(c)包括光譜學。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述光譜學選自由以下組成的組熒光光譜學、漫反射光譜學、吸收和透射光譜學、紅外光譜學、太赫茲光譜學、拉曼光譜學、表面增強拉曼光譜學、空間偏移拉曼光譜學、共振拉曼光譜學，和其任何組合。
17.如權利要求15所述的方法，其中所述光譜學是正面熒光光譜學。
18.如權利要求15所述的方法，其中所述光譜學包括測定激發(fā)-發(fā)射矩陣(EEM)。
19.如權利要求18所述的方法，其中所述EEM包括至少兩種不同的波長。
20.如權利要求18所述的方法，其中將所述EEM與已知微生物的EEM的數(shù)據(jù)庫相比較。
21.如權利要求1所述的方法，其中所述結合的抗性測定親和配體的量在每個細胞基礎上通過將結合的量與所述微生物的內(nèi)在性質(zhì)相比較來測定。
22.如權利要求21所述的方法，其中所述內(nèi)在性質(zhì)是內(nèi)在熒光。
23.如權利要求11所述的方法，其中步驟(c)包括回收所述微生物以產(chǎn)生回收的微生物的步驟。
24.如權利要求1所述的方法，其中步驟(d)包括將所述結合的抗性測定親和配體的量與被同樣的微生物的抗生素敏感性和抗生素抗性菌株二者所結合的抗性測定親和配體的量相比較。
25.如權利要求1所述的方法，其中被同樣的微生物的已知的抗生素敏感性或抗生素抗性菌株所結合的量先前已被測定。
26.如權利要求1所述的方法，其中所述方法是至少部分自動化的。
27.一種用于測定微生物的抗生素抗性狀況的方法，所述方法包括(a)在可形成微生物/抗性測定親和配體復合物的條件下，將所述微生物與抗性測定親和配體相接觸；(b)將(a)中形成的微生物/抗性測定親和配體復合物與未結合的抗性測定親和配體相分離；(c)測定所述微生物/抗性測定親和配體復合物中的所述抗性測定親和配體對所述微生物的結合親和力；和(d)將所述微生物/抗性測定親和配體復合物中的所述抗性測定親和配體對所述微生物的結合親和力與抗性測定親和配體對同樣的微生物的已知的抗生素敏感性或抗生素抗性菌株或已知的抗生素敏感性或抗生素抗性菌株的群體的結合親和力相比較；其中如果所述微生物/抗性測定親和配體復合物中的所述微生物表現(xiàn)出的抗性測定親和配體的結合親和力與所述抗生素敏感性微生物所表現(xiàn)出的結合親和力不同，或所述微生物/抗性測定親和配體復合物中的所述微生物表現(xiàn)出的抗性測定親和配體的結合親和力與所述抗生素抗性微生物所表現(xiàn)出的抗性測定親和配體的結合親和力相同，那么所述微生物被鑒定為抗生素抗性的。
28.一種用于測定微生物的抗生素抗性狀況的方法，所述方法包括(a)獲得已知含有微生物或可能含有微生物的檢驗樣品；(b)在可形成微生物/抗性測定親和配體復合物的條件下將所述檢驗樣品中的微生物與抗性測定親和配體相接觸；(c)任選地添加測量細胞新陳代謝或膜完整性的一種或多種熒光染料；(d)任選地選擇性地裂解可能存在于所述樣品中的任何非微生物細胞以產(chǎn)生裂解的樣Pm ；(e)將所述微生物與所述檢驗樣品或所述裂解的樣品中的其他組分相分離，以形成微生物的沉淀物；(f)探測所述沉淀物以產(chǎn)生所述微生物的測量結果；(g)通過將所述測量結果與針對同種的抗生素抗性和/或抗生素敏感性微生物所取得或預測的測量結果相比較而測定所述檢驗樣品中的微生物的抗生素抗性狀況。
29.如權利要求觀所述的方法，其中在步驟(c)中添加了一種或多種熒光染料。
30.如權利要求觀所述的方法，其中步驟(g)中的所述抗生素抗性測定被測定為誘導的抗性。
31.如權利要求觀所述的方法，其中所述探測步驟(f)包括通過光譜學進行的探測。
32.如權利要求31所述的方法，其中所述光譜學選自由以下組成的組熒光光譜學、漫反射光譜學、吸收和透射光譜學、紅外光譜學、太赫茲光譜學、拉曼光譜學、表面增強拉曼光譜學、空間偏移拉曼光譜學、共振拉曼光譜學，和其任何組合。
33.如權利要求四所述的方法，其中所述微生物被層疊在容器中的密度墊層上，并且分離步驟(b)是通過離心所述容器。
34.一種用于測定微生物的抗生素抗性狀況的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括(a)容器，所述容器包括微生物或含有所述微生物的樣品、和抗性測定親和配體；(b)密度墊層；和(c)提供測量結果的分光計；其中所述測量結果測定已通過在所述系統(tǒng)內(nèi)原位分離而在所述容器中濃縮的所述微生物的抗生素抗性狀況。
35.如權利要求34所述的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)還包括離心機。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于測定微生物的抗生素抗性狀況的方法和系統(tǒng)。本發(fā)明還提供了用于在單個系統(tǒng)內(nèi)原位測定微生物的抗生素抗性狀況的方法。
文檔編號G01N33/569GK102460172SQ201080028598
公開日2012年5月16日 申請日期2010年5月6日 優(yōu)先權日2009年5月7日
發(fā)明者瓊斯·海曼, 約翰·沃爾什 申請人:生物梅里埃有限公司