專利名稱：診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白、其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物檢測領域，具體涉及一種重組蛋白，尤其涉及一種診斷細粒棘球 蚴病的重組抗原蛋白；此外，本發(fā)明還涉及上述重組抗原蛋白的制備方法和用途。
背景技術：
細粒棘球蚴病又稱囊型包蟲病(cystic echinococcosis, CE)是一種由細粒棘球 絳蟲的幼蟲引起的嚴重危害人體健康和畜牧業(yè)發(fā)展的人獸共患寄生蟲病，且已成為世界范 圍的一個重要的公共衛(wèi)生、經(jīng)濟問題。我國棘球蚴病流行嚴重，約占全國總面積的44%，據(jù) 推算全國棘球蚴病患者數(shù)約為38萬人，西部地區(qū)尤為嚴重。目前CE確診主要是通過物理 影像，如X線、B超、斷層掃描及核磁共振等方法，但由于棘球蚴病患者早期無明顯臨床癥 狀，這些方法也僅適用確診中、晚期病患階段，所以早期診斷對該病治療和預后起著重要的 作用。對臨床早期可疑病患或對高風險人群進行大規(guī)模篩查采用免疫學檢測顯得尤為必 要。目前廣泛用于細粒棘球蚴病診斷抗原主要是囊液抗原及其組分抗原B和抗原5等，但受 到不易標準化，特異性、敏感性不理想以及與其他帶絳蟲抗原存在交叉反應等問題的限制。 尋找具有更高敏感性和特異性的抗原組分，提高對CE的診斷效率，是當前棘球蚴病免疫診 斷研究任務中的重要內(nèi)容之一，而研制特異性快速診斷試劑盒也是目前免疫診斷的發(fā)展趨 勢。隨著分子生物學技術的發(fā)展，用基因工程技術制備重組抗原有助于解決上述問題。近 年來，諸多重組抗原已用于CE免疫診斷效果的研究，其中EPCl在免疫診斷方面受到學者的 關注。Li等通過感染細粒棘球絳蟲六鉤蚴的小鼠血清篩選細粒棘球蚴cDNA文庫獲得Epcl 基因。通過免疫印跡實驗方法證實rEPCl對細粒棘球蚴病患者血清的敏感性為92. 2%，特 異性為95. 6%，是一種新的CE診斷抗原。根據(jù)不完全統(tǒng)計，我國受細粒棘球蚴病威脅的人口在5000萬人以上，但目前對于 包蟲病的治療效果尚不理想，所以早期診斷對于人囊型包蟲病(CE)的及時治療至關重要， 而具有特異的免疫學診斷對CE的確診有其重要作用。EPCl是Li等從Eg原頭節(jié)cDNA文庫 篩選得到一編碼為8. 4KDa的多肽。將EPCl分截成10段(Pl-PlO)，通過免疫印跡檢測囊型 包蟲病患者血清和感染細粒棘球蚴的實驗鼠血清確定EPCl蛋白的抗體結合部位主要存在 于PI、P5螺旋結構的兩多肽段和含Pl和P5的EPCl蛋白中，這是EPCl具有特異性血清診 斷的主要原因；另外，Epcl蛋白序列與豬帶絳蟲的氨基酸序列有86%的同源性，然而檢測 顯示與囊蟲病(豬肉絳蟲囊尾蚴病)僅有9%的交叉反應，主要是EPCl具有B細胞抗原表 位，不與囊蟲病患者血清發(fā)生交叉反應。因此，尋找具有更高敏感性和特異性的CE診斷抗原，提高對囊型包蟲病的檢測效 率，是當前細粒棘球蚴病免疫診斷研究課題之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題之一是提供一種診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白。本發(fā)明要解決的技術問題之二是提供一種用于診斷細粒棘球蚴病的引物。
本發(fā)明要解決的技術問題之三是提供一種上述診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋 白的制備方法。本發(fā)明要解決的技術問題之四是提供上述診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白的 用途。為了解決上述技術問題，本發(fā)明從我國青海省細粒棘球蚴分離原頭節(jié)cDNA擴增 了 Epcl基因片段，克隆表達EgEPCl重組蛋白，通過ELISA方法評價分析重組抗原的診斷價值。在本發(fā)明的一方面，提供一種診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白，其氨基酸序列 如SEQ ID NO 1所示。編碼上述重組抗原蛋白的基因為SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。本發(fā)明提供一種重組質粒載體，其由上述編碼重組抗原蛋白的基因與表達載體 PET28a(+)連接構建。所述的連接可以采用本領域常規(guī)或已知的方法進行，例如所述的連接可以是將 利用內(nèi)切酶酶切處理含有在細粒棘球蚴抗原蛋白基因兩側帶有限制性內(nèi)切酶識別位點的 克隆質粒得到的細粒棘球蚴抗原蛋白的基因，與經(jīng)相同酶切處理的表達載體PET28a(+)連 接，構建重組表達質粒。所述的內(nèi)切酶可以是本領域通常使用的內(nèi)切酶，例如BamH I.Sal I。所述克隆質粒可以是將所述細粒棘球蚴抗原蛋白基因與PGEM-T Easy載體連接而成的。 所述的連接可以是將含所述細粒棘球蚴抗原蛋白基因的PCR產(chǎn)物與PGEM-T Easy載體連接 構建成。所述細粒棘球蚴抗原蛋白基因的PCR產(chǎn)物可以通過抽取細粒棘球蚴總RNA，反轉錄 成cDNA作為擴增模板，通過PCR法進行擴增而得。本發(fā)明提供一種轉化體，其由上述重組質粒載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)而得。 所述的轉化可以按照本領域的常規(guī)或已知的方法進行。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于診斷細粒棘球蚴病的引物，其序列為上游5，-GCGGATCCATGAGTCTTCAGAAAAC-3’(如 SEQ ID NO 3 所示)或其互補鏈； 下游5，-GCGTCGACTTAGAAGAGAGCCATTAAC-3’ (如 SEQ ID NO 4 所示)或其互補鏈。在本發(fā)明的另一方面，提供一種上述診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白的制備方 法，包括如下步驟l)Epcl 基因擴增；2)重組質粒構建和鑒定；3)重組蛋白的誘導表達及純化。步驟1)具體為設計SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列或其互補 鏈為引物，抽取細粒棘球蚴總RNA，反轉錄成cDNA，并以其為模板進行RT-PCR擴增。所述 RT-PCR擴增的反應條件為95°C預變性5min ；94°C變性45s，59°C退火30s，72°C延伸45s，30 個循環(huán)；最后72°C延伸5min。步驟2)具體為將步驟1)所得的PCR產(chǎn)物與PGEM-T Easy載體連接，轉化大腸 桿菌JM109，篩選菌落、培養(yǎng)并提取質粒，雙酶切鑒定并測序，將測序無誤的質粒和表達載體 PET28a(+)分別經(jīng)BamH I和Sal I雙酶切、純化回收連接，轉入大腸桿菌DH5 α，并培養(yǎng)過 夜；篩選陽性菌落提取質粒，雙酶切鑒定并測序，將測序無誤的重組表達質粒轉化到大腸桿 菌 BL21(DE3)。步驟3)具體為將重組菌接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入IPTG
4誘導表達，分別收集誘導前及不同誘導時間菌液，進行SDS-PAGE電泳分析；離心收集菌體， 用純化緩沖液重懸，冰浴，后冰上超聲裂解，離心后分別取上清和沉淀進行可溶性分析；按 純化試劑盒純化重組蛋白，測定吸光度計算蛋白濃度并用SDS-PAGE鑒定其純度。在本發(fā)明的另一方面，提供一種上述重組抗原蛋白在制備診斷細粒棘球蚴病藥物 中的應用。在本發(fā)明的另一方面，提供一種上述重組抗原蛋白在制備細粒棘球蚴病診斷試劑 盒中的應用。本發(fā)明從我國青海省細粒棘球蚴包囊中分離原頭蚴，抽提總RNA，采用RT-PCR擴 增EgEPCl基因，將其克隆到pGEM-T載體中，再將其與原核表達載體PET28a(+)連接構建 重組質粒PET28a-EgEPCl，轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導表達重組蛋白，用 SDS-PAGE及Western blotting對純化后重組抗原進行鑒定分析，對60例囊型包蟲病、37例 泡型包蟲病、16例囊蟲病、7例肝吸蟲病、4例血吸蟲病、4例弓形蟲病和33名健康人共161 份血清進行ELISA檢測，評價重組抗原的免疫診斷效果。雙酶切鑒定及測序結果均顯示重 組質粒PET28a-EgEPCl構建成功，SDS-PAGE及Western blotting分析顯示重組質粒在大腸 桿菌BL21(DE3)中獲得高效表達，產(chǎn)物以可溶蛋白形式存在，重組蛋白相對分子質量約為 11000，可被囊型包蟲病患者混合血清識別；該重組抗原對CE血清的診斷敏感性為78. 3%, 特異性為96. 9% (除泡型包蟲病人血清)。實驗證明，本發(fā)明的EgEPCl重組抗原對細粒棘 球蚴病的診斷具有敏感性和特異性高等優(yōu)點，具有較好的診斷價值，為研制相關診斷試劑 盒奠定了基礎，在細粒棘球蚴病診斷方面具有廣泛的應用前景。


圖1是本發(fā)明實施例中EgEpcl基因的RT-PCR擴增結果示意圖，其中，M表示DNA 標志物(IOObp)，1表示陰性對照，2表示EgEpcl PCR擴增產(chǎn)物；圖2是本發(fā)明實施例中重組質粒酶切鑒定結果示意圖，其中，M、M1、M2表示DNA 標志物(100_3000bp、100bp、Ikb)，1 表示 EgEPCl-T 質粒經(jīng) BamH I 和 Sal I 雙酶切，2 表示 PET28a-EgEPCl 質粒經(jīng) BamH I 和 Sal I 雙酶切；圖3是本發(fā)明實施例中PET28a_EgEPCl重組蛋白的SDS-PAGE分析結果示意圖，其 中，M表示蛋白分子量標準，1表示PET28a/BL21誘導前，2表示PET28a/BL21誘導4h，3表示 PET28a-EgEPCl/BL21 誘導前，4 表示 PET28a_EgEPCl/BL21 誘導 4h，5 表示 PET28a_EgEPCl/ BL21誘導表達的菌液超聲后上清，6表示PET28a-EgEPCl/BL21誘導表達的菌液超聲后沉 淀，7表示純化的PET28a-EgEPCl重組蛋白；圖4是本發(fā)明實施例中PET28a_EgEPCl重組蛋白的Western-blot分析結果示意 圖，其中，M表示蛋白分子量標準，1表示健康人混合血清，2表示CE患者混合血清，3表示AE 患者混合血清。
具體實施例方式以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。 實施例1細粒棘球蚴重組抗原蛋白的制備
1 材料1. 1細粒棘球蚴從青海省屠宰場收集綿羊肝臟棘球蚴囊，無菌條件下分離并收集青海(羊源)細 粒棘球蚴原頭節(jié)。1. 2待檢血清樣本青海省地方病預防控制所提供確診CE患者血清60份、泡型包蟲病(alveolar echinococcosis, AE)患者血清37份、囊尾蚴病患血清11份，及中國疾病預防控制中心寄 生蟲病預防控制所提供健康人血清33份、囊蟲病患血清5份、肝吸蟲病患血清7份、血吸蟲 病患血清4份、弓形蟲病患血清4份。1. 3主要試劑和工具酶Total RNA Isolation kit 購自德國 Macherey-Nagel 公司；AMV逆轉錄酶、TaqDNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶、PGEM-T Easy載體試劑盒均購自美國promega公司；DNA膠回收試劑 盒、質粒DNA小量抽提試劑盒購自北京博大泰克公司；Probond Purification System購自 Invitrogen 公司；DNA Marker、蛋白預染 Marker 購自 Fermentas 公司；羊抗人 IgG-HRP、羊 抗鼠IgG-HRP購自Ptglab公司。2 方法2. IEpcl基因擴增與克隆2. 1.1基因擴增根據(jù)報道的Epcl基因序列(登錄號AF481884)設計引物，上游引物含BamH I酶 切位點，下游引物含Sal I酶切位點，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引 物序列如下上游Pl :5，-GCGGATCCATGAGTCTTCAGAAAAC-3’ (如 SEQ ID NO 3 所示)；下游P2 :5，-GCGTCGACTTAGAAGAGAGCCATTAAC-3’ (如 SEQ ID NO 4 所示)；利用總RNA提取試劑盒抽取原頭蚴總RNA，反轉錄成cDNA，并以其為模板進行PCR 擴增。反應條件為95°C預變性5min ；94°C變性45s，59°C退火30s，72°C延伸45s，30個循 環(huán)；最后72°C延伸5min。2. 1. 2重組質粒構建和鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳DNA純化回收試劑盒回收，與PGEM-T Easy載體4°C條 件下連接過夜，轉化大腸桿菌JM109，經(jīng)藍白斑篩選，挑取白色單菌落，分別接種于含氨芐青 霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質粒，雙酶切鑒定，并將酶切鑒定正確的菌樣送Irwitrogen 上海生物技術有限公司進行測序分析；將測序正確的質粒和表達載體PET28a(+)分別經(jīng) BamH I和Sal I雙酶切、純化回收連接，轉入大腸桿菌DH5 α，并在含有30ug/ml卡那霉素 的LB平板中37°C培養(yǎng)過夜；篩選陽性菌落提取質粒，雙酶切鑒定并測序。將測序無誤的重 組表達質粒轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)。2. 2重組蛋白的誘導表達及純化將重組菌接種于含卡那霉素(30ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜。按 1 %的比例接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37°C振蕩培養(yǎng)至菌液吸光度A6tltl 0. 4 0. 6，加 入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為l.Ommol/L誘導表達4h，分別收集誘 導前及不同誘導時間菌液，進行SDS-PAGE電泳分析；大量誘導表達菌液經(jīng)4°C，5000r/min
6離心15min收集菌體，用純化緩沖液重懸，冰浴10分鐘，后冰上超聲裂解，離心后分別取上 清和沉淀進行可溶性分析。按純化試劑盒純化重組蛋白，測定吸光度計算蛋白濃度并用 SDS-PAGE鑒定其純度。3 結果3. IEgEPCl基因擴增與克隆3. 1. 1基因擴增采用RT-PCR的方法，獲取EgEpcl的cDNA片段并以其為模板，擴增出207bp與預 期長度一致的目的片段(見圖1)。經(jīng)測序及與GenBank中Epcl基因序列blast分析，確定 擴增片段正確。3. 1. 2 EgEpcl基因克隆與亞克隆目的基因片段與pGEM-T Easy載體TA克隆，構建重組質粒EgEPCl-T，經(jīng)雙酶切及 測序鑒定，酶切片段及測序結果均與目的基因片段大小相符，其同源性100% ；與表達載體 PET28a構建重組表達質粒PET28a-EgEPCl，酶切鑒定獲得與預期大小一致片段，測序結果 表明序列無變異，開放閱讀框正確，重組表達質粒構建成功(見圖2)。3.2 PET28a_EgEPCl重組蛋白的表達、純化將蛋白表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，在誘導4h時，在IlKDa處出現(xiàn)一最高量表達 條帶，與目的蛋白分子質量基本相符；蛋白以可溶性形式存在于上清中，經(jīng)純化后蛋白在 IlKDa位置得到一清晰條帶，與目的蛋白相符(見圖3)。實施例2 PET28a-EgEPCl 重組蛋白的 Western-blot 鑒定1. Western-blot 鑒定方法將純化后的PET28a-EgEPCl重組蛋白(由實施例1制得)經(jīng)15% SDS-PAGE電泳 后電轉移至硝酸纖維素膜上；將膜剪成條狀置于5 %脫脂奶粉溶液封閉過夜，PBS-T洗3次， 每次5min;分別與正常健康人混合血清和CE患者混合血清、AE患者混合血清(1 100稀 釋)反應，室溫輕搖2h，PBS-T洗3次，每次5min ；加入羊抗人HRP-IgG (1 1000)室溫輕 搖2h，PBS-T洗3次，每次5min ；加入新鮮配制的DAB聯(lián)合顯色液，直到出現(xiàn)目的條帶，去離 子水終止反應。2.重組蛋白的Western-blot鑒定分析結果分析結果顯示，PET28a-EgEPCl純化重組蛋白可被CE患者混合血清特異性識別， 在IlKDa處出現(xiàn)特異性的條帶，與健康人混合血清和AE患者混合血清無反應(見圖4)。實施例3細粒棘球蚴重組抗原蛋白的診斷效果實驗1.重組抗原的ELISA血清學評價將多份血清CE和健康人血清分別等量混合配制成陽性和陰性血清對照。血清按 1 100稀釋，通過方陣滴定確定重組抗原(由實施例1制得)工作濃度0.5 μ g/ml，羊抗 人IgG辣根過氧化物酶標記物工作濃度為1 14000。鄰苯二胺底物(OPD)顯色，測A49tl。 以33例健康人血清的吸光度均值2倍SD作為陽性判斷值。2.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用Excel電子表格處理軟件對實驗數(shù)據(jù)進行整理和統(tǒng)計分析。3.重組抗原的血清學檢測結果的分析評價用重組抗原EPCl分別對CE、AE和其他寄生蟲病感染及健康人血清進行ELISA的
7IgG檢測，其敏感性為78.3%，特異性為96. 9% (除泡型包蟲病人血清)。由表1可見，除泡 型包蟲病患者血清外，重組抗原與CE患者血清有較好的特異性反應，與健康人血清和弓形 蟲患者血清僅1例交叉反應，但與囊蟲病、血吸蟲、肝吸蟲病患血清均未發(fā)生交叉反應。經(jīng) 統(tǒng)計學處理比較分析顯示，CE患者血清與AE、囊蟲患者、肝吸蟲、血吸蟲及健康人血清檢測 結果之間存在顯著性差異(P < 0.005)，與弓形蟲患者之間差異無顯著性(P >0.05)。
表1 EPCl重組抗原ELISA檢測不同血清結果
數(shù)量(No. ofsera 重組抗原 EPCl (ReEPCl)
權利要求
一種診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.一種用于診斷細粒棘球蚴病的引物，其特征在于，其序列為上游5，-GCGGATCCATGAGTCTTCAGAAAAC-3’ (如 SEQ ID NO 3 所示)或其互補鏈；下游5，-GCGTCGACTTAGAAGAGAGCCATTAAC-3’ (如 SEQ ID NO 4 所示)或其互補鏈。
3.—種如權利要求1所述的診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白的制備方法，其特征在 于，包括如下步驟DEpcl基因擴增；2)重組質粒構建和鑒定；3)重組蛋白的誘導表達及純化。
4.如權利要求3所述的診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于， 步驟1)具體為設計SEQ ID NO 3和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或其互補鏈為引物， 抽取細粒棘球蚴總RNA，反轉錄成cDNA，并以其為模板進行RT-PCR擴增。
5.如權利要求4所述的診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于， 所述RT-PCR擴增的反應條件為95°C預變性5min ；94°C變性45s，59°C退火30s，72°C延伸 45s，30個循環(huán)；最后72°C延伸5min。
6.如權利要求3所述的診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于， 步驟2)具體為將步驟1)所得的PCR產(chǎn)物與PGEM-T Easy載體連接，轉化大腸桿菌JM109， 篩選菌落、培養(yǎng)并提取質粒，雙酶切鑒定并測序，將測序無誤的質粒和表達載體PET28a(+) 分別經(jīng)BamH I和Sal I雙酶切、純化回收連接，轉入大腸桿菌DH5 α，并培養(yǎng)過夜；篩 選陽性菌落提取質粒，雙酶切鑒定并測序，將測序無誤的重組表達質粒轉化到大腸桿菌 BL21(DE3)。
7.如權利要求3所述的診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于， 步驟3)具體為將重組菌接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入IPTG誘導表達， 分別收集誘導前及不同誘導時間菌液，進行SDS-PAGE電泳分析；離心收集菌體，用純化緩 沖液重懸，冰浴，后冰上超聲裂解，離心后分別取上清和沉淀進行可溶性分析；按純化試劑 盒純化重組蛋白，測定吸光度計算蛋白濃度并用SDS-PAGE鑒定其純度。
8.—種如權利要求1所述的重組抗原蛋白在制備診斷細粒棘球蚴病藥物中的應用。
9.一種如權利要求1所述的重組抗原蛋白在制備細粒棘球蚴病診斷試劑盒中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白(其氨基酸序列如SEQID NO1所示)。此外，本發(fā)明還公開了上述重組抗原蛋白的制備方法，包括采用RT-PCR擴增EgEPC1基因，將其克隆到pGEM-T載體中，再將其與表達載體PET28a(+)連接構建重組質粒PET28a-EgEPC1，轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導表達重組蛋白，用SDS-PAGE及Western blotting對純化后重組抗原進行鑒定。此外，本發(fā)明還公開了上述重組抗原蛋白的診斷用途。實驗證明，本發(fā)明的重組抗原蛋白對細粒棘球蚴病的診斷具有敏感性和特異性高等優(yōu)點，在細粒棘球蚴病診斷方面具有廣泛的應用前景。
文檔編號G01N33/53GK101948521SQ20101028491
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月17日 優(yōu)先權日2010年9月17日
發(fā)明者盧濰媛, 官亞宜, 徐馀信, 曹建平, 沈玉娟, 王虎, 胡媛, 蔡輝霞, 韓秀敏 申請人:中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所