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鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗的效力檢測試劑及方法

文檔序號:5920352閱讀:246來源:國知局
專利名稱:鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗的效力檢測試劑及方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及動物醫(yī)藥領(lǐng)域,特別涉及鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗的效力檢測試劑及 方法。
背景技術(shù)
鴨傳染性漿膜炎是由鴨疫里氏桿菌(RA)引起的鴨、鵝等禽類敗血癥或慢性感染。 其病變特征是出血、纖維素性心包炎、氣囊炎、肝周炎、關(guān)節(jié)炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎等 多種臨床病癥。由于鴨傳染性漿膜炎給養(yǎng)鴨業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,有關(guān)其診斷和免疫預(yù) 防等方面的研究引起了越來越多的關(guān)注。其中,疫苗效力檢測技術(shù)非常重要,不僅可評價疫 苗質(zhì)量,還可對疫苗免疫鴨抵抗感染的狀態(tài)做出評判。目前鴨傳染性漿膜炎疫苗與其它疫 苗的效力檢測多采用攻毒保護(hù)率(或保護(hù)指數(shù))來表示;此外也采用與攻毒保護(hù)率有平行 關(guān)系的替代指標(biāo)表示,即通過體液和細(xì)胞免疫檢測評價疫苗的免疫效力??贵w檢測方法主 要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和間接血凝試驗(IHA)等,細(xì)胞免疫檢測主要有淋巴細(xì)胞 轉(zhuǎn)化試驗(LTT)等。但這些方法或需要通過活體動物,或操作復(fù)雜,僅適用于實(shí)驗室研究而 不適用于大規(guī)模使用。因此急需一種在生產(chǎn)上切實(shí)可行、操作簡單、檢測結(jié)果與免疫鴨產(chǎn)生 保護(hù)效力相關(guān)性好的檢測方法和相關(guān)試劑,但目前國內(nèi)、外目前沒有相關(guān)研究。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此,本發(fā)明的目的之一在于提供一種鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗的效力檢測 試劑,該試劑通過抽取鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗免疫鴨的血液,測定血液中凝集抗體滴度, 再利用上述滴度制備的鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗的效力檢測試劑;該檢測試劑成本低廉, 配制簡單、專一性強(qiáng)。為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明的技術(shù)方案為鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗的效力檢測試劑,通過與鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗免疫 動物的血清發(fā)生凝集反應(yīng)的程度來檢測鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗的效力,所述檢測試劑由 菌體含量為2. OOX 108CFU/mL的鴨疫里默氏桿菌抗原與稀釋劑混合而成,所述稀釋劑的體 積大于或等于待測血清體積的3倍,所述鴨疫里默氏桿菌抗原的體積等于待測血清與稀釋 劑的體積之和。進(jìn)一步,所述的鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗的效力檢測試劑,所述鴨疫里默氏桿菌 抗原的制備步驟具體為a、菌體培養(yǎng)將鴨疫里默氏桿菌接種于含有體積分?jǐn)?shù)為10%新生牛血清的胰酶 大豆肉湯培養(yǎng)基中,37°C培養(yǎng)24 48h,得鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)液;b、菌體滅活向步驟a所得鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)液中加入甲醛至體積分?jǐn)?shù)為 0. 5%,37°C作用24小時滅活菌體,得滅活鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)液;C、調(diào)節(jié)濃度將步驟b所得滅活鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)液離心,菌體沉淀用稀釋劑 離心洗滌后,再用稀釋劑調(diào)節(jié)菌體含量為2. 00X 108CFU/mL,即得鴨疫里默氏桿菌抗原;
進(jìn)一步,所述檢測試劑由鴨疫里默氏桿菌抗原與相當(dāng)于待測血清體積3倍的稀釋 劑組成;進(jìn)一步,所述稀釋劑為生理鹽水或含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%的石碳酸的生理鹽水。本發(fā)明的目的之二在于提供一種鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗的效力檢測方法,該方 法無需借助儀器檢測和動物攻毒保護(hù)試驗即可以實(shí)現(xiàn)快速檢測鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗 的效力。為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明的技術(shù)方案為所述檢測試劑檢測鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗效力的方法,其特征在于,具體包括 以下步驟a凝集反應(yīng)將所述的檢測試劑與待測血清充分混勻,置37°C溫箱中16 24h,得 凝集反應(yīng)液;b觀測結(jié)果觀測所述凝集反應(yīng)液中菌體凝集程度;c判斷所述鴨疫里默氏桿菌抗原中數(shù)量為50%以上的菌體被凝集,判定為陽性, 即鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗效力檢測合格。進(jìn)一步,步驟a中所述檢測試劑與待測血清之和為ImL ;進(jìn)一步,所述方法中還設(shè)置空白對照和陽性血清對照。本發(fā)明的有益效果在于本檢測試劑彌補(bǔ)了鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗效力檢測試 劑的空白,且成本低、配制簡單、專一性強(qiáng);另外,本試劑與免疫鴨產(chǎn)生保護(hù)效力的相關(guān)性 好,且穩(wěn)定性高;運(yùn)用本試劑實(shí)現(xiàn)的鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗的效力檢測方法避免了活體 試驗對動物的傷害,且操作簡單,僅需通過測量血清中間數(shù)值即可實(shí)現(xiàn)對所述疫苗效力的 判斷;另外,本方法重現(xiàn)性高。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗的效力檢測試劑及方法一、檢測試劑中稀釋劑用量的確定1、材料準(zhǔn)備①培養(yǎng)基為含有體積分?jǐn)?shù)為10%新生牛血清的胰酶大豆肉湯培養(yǎng)基;實(shí)驗動 物選用健康非免疫的1日齡鴨購自鴨場,隔離飼養(yǎng)觀察6天,進(jìn)一步確診健康后于7日齡 進(jìn)行實(shí)驗,其抗血清I型鴨傳染性漿膜炎血清抗體為陰性;供試疫苗含血清I型鴨疫里默 氏桿菌滅活菌1.00X101(lCFU/ml,批號為2005003,批量為20000ml,供試疫苗采取隨機(jī)抽 樣;另外,巧克力瓊脂平板、鮮血瓊脂平板、普通肉湯及厭氧肉肝湯培養(yǎng)基均按常規(guī)方法配 制。②血清I型鴨疫里默氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的制作免疫抗原的制備將鴨疫里默氏桿菌進(jìn)行純培養(yǎng),對培養(yǎng)物進(jìn)行計數(shù)后滅活,備 用。將弗氏完全佐劑在研缽中研磨均勻,在研磨過程中加入等體積的滅活鴨疫里默氏桿菌 菌液,直至其成為均勻的乳白色油包水狀液體,得弗氏完全佐劑免疫抗原。檢查乳化效果標(biāo) 準(zhǔn)取一滴該液體置于冰水上5 10分鐘不擴(kuò)散判定為合格。乳化物中鴨疫里默氏桿菌菌 體含量應(yīng)為101(lCFU/ml。制備弗氏不完全佐劑免疫抗原可參照弗氏完全佐劑免疫抗原的制 備方法。
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免疫動物準(zhǔn)備體重約2 3kgSPF雞10只,免疫前每只采血檢測無RA抗體存在, 繼續(xù)飼養(yǎng)觀察2天,無異常情況即可用于陽性血清制備。SPF雞群是指沒有目前國際、國 內(nèi)流行的雞疫病感染史,也不攜帶這些疫病的病原和抗體的具有良好生長和繁殖性能的雞群。免疫程序分別于第一次免疫(弗氏完全佐劑免疫抗原)后第7日、14日和21天 進(jìn)行二、三和四次免疫(弗氏不完全佐劑免疫抗原),免疫部位為胸、腿部皮下多點(diǎn)注射,每 次免疫劑量為Iml/只;并于第四次免疫后10天靜脈注射純菌體抗原1. 00X IO10CFU/只。抗體效價測定采用試管凝集試驗進(jìn)行測定,其中凝集效價 32,判定其為合 格。2、鴨疫里默氏桿菌抗原的制備將血清I型鴨疫里默氏桿菌接種于盛有250ml含有體積分?jǐn)?shù)為10%新生牛血清 的胰酶大豆肉湯培養(yǎng)基的玻璃三角瓶中,37°C溫箱中24h,得鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)菌液。在 鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)菌液中加入體積濃度為10%的甲醛至所述鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)菌液 的甲醛體積濃度為0. 5%,并于37°C繼續(xù)作用24h滅活。用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%石碳酸 的生理鹽水在轉(zhuǎn)速5000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心洗滌3次,至上清液透明,去上清液得鴨疫 里默氏桿菌,用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%石碳酸的生理鹽水將鴨疫里默氏桿菌調(diào)整濃度為 2. OOX 108CFU/ml,得鴨疫里默氏桿菌抗原。采用玻片凝集試驗測定鴨疫里默氏桿菌抗原,生理鹽水作為空白對照品,具體為 分別將鴨疫里默氏桿菌抗原和生理鹽水滴加于干凈玻片上,并滴加未稀釋的所述血清I型 鴨疫里默氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清1滴,將載玻片輕輕反復(fù)擺動或用接種環(huán)涂開,37°c溫箱35 分鐘觀察結(jié)果,鴨疫里默氏桿菌抗原中出現(xiàn)清晰的乳白絮狀凝集塊,生理鹽水中無凝集現(xiàn) 象發(fā)生。4、實(shí)驗方法取7日齡鴨60只作為實(shí)驗鴨,隨機(jī)分為實(shí)驗組和對照組。實(shí)驗1組為經(jīng)鴨傳染 性漿膜炎滅活疫苗免疫后7日用5. 08X 109CFU RA-CH-I菌株活菌進(jìn)行攻毒的實(shí)驗鴨,對 照1組為同齡僅注射生理鹽水7日后用5. 08X 109CFU RA-CH-I菌株活菌進(jìn)行攻毒的試驗 鴨;實(shí)驗2組為經(jīng)鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗免疫后14日用5. 25X IO9CFU RA-CH-I菌株活 菌進(jìn)行攻毒的實(shí)驗鴨,對照2組為同齡僅注射生理鹽水14日后用5. 25X IO9CFU RA-CH-I 菌株活菌進(jìn)行攻毒的試驗鴨;實(shí)驗3組為經(jīng)鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗免疫后21日用 5. 44X IO9CFU RA-CH-I菌株活菌進(jìn)行攻毒的實(shí)驗鴨,對照3組為同齡僅注射生理鹽水21日 后用5. 44 X IO9CFURA-CH-I菌株活菌進(jìn)行攻毒的試驗鴨。在RA-CH-I菌株活菌進(jìn)行攻毒后, 觀察7日,記錄臨床發(fā)病及其死亡情況并剖殺存活的試驗鴨,記錄心包膜、肝周膜、漿膜病 變,并從心血管和肝臟進(jìn)行細(xì)菌的再分離。實(shí)驗鴨發(fā)病的判定標(biāo)準(zhǔn)如下,即符合下列條件之 一,判為發(fā)?、僭囼烒喅霈F(xiàn)精神不振、行動蹣跚、眼鼻有分泌物流出、排綠、黃綠色稀薄糞 便等鴨傳染性漿膜炎臨床癥狀;②死亡;③剖檢時鴨可見心包膜炎或肝周膜炎或漿膜炎病 變或心血、肝臟、脾臟分離細(xì)菌呈陽性。試驗鴨每只采血1. OOml并分離血清測定其凝集抗體,待測血清依次按2、4、8、16、 32、64、128倍稀釋,并按試管凝集法檢測血清凝集抗體滴度,進(jìn)而確定檢測試劑中稀釋劑用 量。凝集抗體滴度測定采用1. OOml反應(yīng)體系依次取按上述倍數(shù)稀釋的待檢血清0. 50ml和鴨疫里默氏桿菌抗原0. 50ml。以血清I型RA標(biāo)準(zhǔn)陽性血清為陽性對照品,以生理鹽水為 空白對照品。按照下述試管凝集法的判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷++++ 管底形成傘狀沉淀,或沉淀物呈片狀、塊狀或顆粒狀,直徑> 0. 25cm,即數(shù) 量為100%以上的菌體被凝集;+++ 菌體大部分凝集呈片狀、塊狀或顆粒狀,直徑0. 20cm 0. 24cm,即數(shù)量為 75%以上的菌體被凝集;++:管底有明顯的凝集沉淀,呈塊狀或小片絮狀物,直徑0. IOcm 0. 19cm,即數(shù)量 為50%以上的菌體被凝集;+ 有不太顯著的凝集沉淀或僅有凝集沉淀的痕跡,直徑0. Olcm 0. 09cm,即數(shù)量 為25%以上的菌體被凝集;-液體呈渾濁、不透明,無凝集沉淀或凝集沉淀的痕跡。以出現(xiàn)“++”判斷標(biāo)準(zhǔn)的血清最高稀釋度的下一倍比稀釋度為待檢血清效價,即抗 體滴度。例如血清稀釋度為1 1時未出現(xiàn)凝集反應(yīng),則待檢血清效價仍記為0;如果出現(xiàn) 凝集反應(yīng),則待檢血清效價記為1 2,依次類推。其中生理鹽水對照凝集效價應(yīng)彡1 2。5、實(shí)驗結(jié)果經(jīng)鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗免疫后7日用5. 08X IO9CFU RA-CH-I菌株活菌進(jìn)行 攻毒的實(shí)驗鴨凝集抗體滴度與保護(hù)效力的關(guān)系見表1。表1鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗免疫7日齡鴨后7日抵抗5.08X 109CFU攻擊的結(jié)果
權(quán)利要求
鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗的效力檢測試劑,其特征在于所述檢測試劑通過與鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗免疫動物的血清發(fā)生凝集反應(yīng)的程度來檢測鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗的效力,其由菌體含量為2.00×108CFU/mL的鴨疫里默氏桿菌抗原與稀釋劑混合而成,所述稀釋劑的體積大于或等于待測血清體積的3倍,所述鴨疫里默氏桿菌抗原的體積等于待測血清與稀釋劑的體積之和。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗的效力檢測試劑,其特征在于,所 述鴨疫里默氏桿菌抗原可由以下方法獲得a、菌體培養(yǎng)將鴨疫里默氏桿菌接種于含有體積分?jǐn)?shù)為10%的新生牛血清的胰酶大 豆肉湯培養(yǎng)基中,37°C培養(yǎng)24 48小時,得鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)液;b、菌體滅活向步驟a所得鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)液中加入甲醛至體積分?jǐn)?shù)為0.5%, 37°C作用24小時滅活菌體,得滅活鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)液;c、調(diào)節(jié)濃度將步驟b所得滅活鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)液離心,菌體沉淀用稀釋劑離心 洗滌后,再用稀釋劑調(diào)節(jié)菌體含量為2. 00X 108CFU/mL,即得鴨疫里默氏桿菌抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗的效力檢測試劑,其特征在于所 述稀釋劑為生理鹽水或含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%的石碳酸的生理鹽水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項所述的鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗的效力檢測試劑,其特 征在于所述稀釋劑的體積等于待測血清體積的3倍。
5.應(yīng)用權(quán)利要求1所述檢測試劑檢測鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗效力的方法,其特征在 于,具體包括以下步驟a凝集反應(yīng)將所述檢測試劑與待測血清充分混勻,37°C反應(yīng)16 24小時,得凝集反 應(yīng)液;b觀測結(jié)果觀測所述凝集反應(yīng)液中菌體凝集程度;c判斷所述鴨疫里默氏桿菌抗原中數(shù)量為50%以上的菌體被凝集,判定為陽性,即鴨 傳染性漿膜炎滅活疫苗效力檢測合格。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗效力的方法,其特征在于步 驟a中所述檢測試劑與待測血清體積之和為lmL。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗效力的方法,其特征在于所 述方法中還設(shè)置有空白對照和陽性血清對照。
全文摘要
本發(fā)明涉及動物醫(yī)藥領(lǐng)域,特別涉及鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗的效力檢測試劑及方法,該檢測試劑通過與鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗免疫動物的血清發(fā)生凝集反應(yīng)的程度來檢測鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗的效力,由菌體含量為2.00×108CFU/mL的鴨疫里默氏桿菌抗原與稀釋劑混合而成,稀釋劑的體積大于或等于待測血清體積的3倍,鴨疫里默氏桿菌抗原的體積等于待測血清與稀釋劑的體積之和;該檢測試劑配制簡單,成本低廉,專一性強(qiáng);利用該試劑檢測鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗效力的方法包括凝集反應(yīng)、觀測結(jié)果、效力判斷共三個步驟,避免了活體試驗對動物的傷害,且操作簡單,僅需通過測量血清中間數(shù)值即可判斷疫苗效力。
文檔編號G01N33/569GK101975855SQ201010261638
公開日2011年2月16日 申請日期2010年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月25日
發(fā)明者朱德康, 汪銘書, 程安春, 陳孝躍 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗動物工程技術(shù)中心
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