專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基于流式微球技術(shù)分型檢測(cè)禽流感病毒方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物疫病檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域，具體的講是一種基于流式微球技術(shù)分型 檢測(cè)禽流感病毒方法。
背景技術(shù)：
禽流感(Avian Influenza, Al)，俗稱(chēng)雞瘟，是由A型流感病毒引起的一種禽類(lèi)感 染性疾病綜合癥。1878年，在意大利雞群中首次發(fā)現(xiàn)該病毒。自從1997年在香港發(fā)現(xiàn)人類(lèi) 也會(huì)感染禽流感之后，此病癥引起全世界衛(wèi)生組織的高度關(guān)注。現(xiàn)在該病幾乎遍布世界各 地，對(duì)世界養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，甚至對(duì)人類(lèi)的健康都造成了嚴(yán)重威脅。禽流感特別是H5和H7亞 型高致病性禽流感(HPAI)已經(jīng)被國(guó)際獸醫(yī)局(OIE)定為A類(lèi)烈性傳染病，曾在歷史上造成 過(guò)巨大的災(zāi)難。和其他禽流感病毒檢測(cè)的方法相比較，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)還在于進(jìn)行檢測(cè)的同 時(shí)可以對(duì)禽流感病毒進(jìn)行分型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于流式微球技術(shù)分型檢測(cè)禽流感病毒方法。它的技術(shù) 方案為一、設(shè)計(jì)并合成禽流感病毒的通用型和亞型特異性探針，并進(jìn)行氨基化修飾；二、將氨基化修飾探針通過(guò)化學(xué)交聯(lián)方法偶聯(lián)至不同的微球；三、合成禽流感病毒通用型和不同亞型的特異性引物，并進(jìn)行生物素化修飾；四、提取待測(cè)樣本RNA，在包含所述引物的RT-PCR反應(yīng)液中進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到 樣本cDNA ；五、將cDNA高溫或加入變性液使之變性；六、將變性cDNA與雜交液加入包含氨基化修飾的微球溶液中，進(jìn)行雜交反應(yīng)；七、再將量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈酶親和素交聯(lián)液加入反應(yīng)，后通過(guò)流式微球技術(shù)檢測(cè)，判 斷待測(cè)樣本是否含有禽流感病毒以及確定病毒的分型。該發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(1)通量高目前有100種微球可供研究使用。(2)檢測(cè)所需樣 本量少，本技術(shù)只需ι μ L的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。(3)快速本技術(shù)對(duì)單個(gè)微球進(jìn)行檢測(cè)，不 存在本底影響，基本上不需洗滌，因此所需時(shí)間短。(4)可靠性高本技術(shù)是對(duì)多個(gè)熒光信 號(hào)進(jìn)行單獨(dú)檢測(cè)后，用配套軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。是結(jié)果更加精確、可靠。(5)重復(fù)性好不 同種類(lèi)的微球進(jìn)行標(biāo)記后混合，分成小份用于檢測(cè)個(gè)標(biāo)本，各小份性質(zhì)完全一致。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的檢測(cè)步驟如下1.微球-氨基化探針偶聯(lián)取1. 25Χ IO6個(gè)微球?yàn)橐慌危?. 5mL離心管中，將微球置換到MES緩沖液(MES， 0. 1Μ，ρΗ4. 5)中，加入優(yōu)化量的氨基化探針，加入一定量的EDC溶液，避光振搖常溫反應(yīng)0. 5小時(shí)，再加入等量的EDC溶液，避光振搖常溫反應(yīng)0. 5小時(shí)，用Tween 20和SDS溶液洗滌微 球。最后，用PH8. 0的TE溶液儲(chǔ)存微球-氨基化探針偶聯(lián)物。2. RT-PCR 擴(kuò)增提取待測(cè)樣本RNA，在包含禽流感病毒通用型和不同亞型的生物素化特異性引物 的RT-PCR反應(yīng)液中進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到樣本cDNA ；3. cDNA 變性將cDNA高溫或加入變性液使之變性；4.微球-氨基化探針-變性cDNA-量子點(diǎn)標(biāo)記鏈酶親和素復(fù)合物的形成在96孔濾膜板中，同時(shí)加入微球-氨基化探針偶聯(lián)物、變性cDNA，與雜交液室溫避 光振搖反應(yīng)2-3小時(shí)，進(jìn)行雜交反應(yīng)，抽濾掉板上孔中反應(yīng)液，其中多余的變性cDNA隨反應(yīng) 液被抽濾掉，與微球_氨基化探針偶聯(lián)物結(jié)合的變性cDNA留在孔中；然后加入量子點(diǎn)標(biāo)記 鏈酶親和素，室溫避光振搖反應(yīng)0. 5-1小時(shí)，量子點(diǎn)標(biāo)記鏈酶親和素與孔中變性cDNA特異 性結(jié)合，形成微球_氨基化探針_變性cDNA-量子點(diǎn)標(biāo)記鏈酶親和素復(fù)合體。5.熒光檢測(cè)將96孔濾膜板上孔內(nèi)溶液轉(zhuǎn)移至管中上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，該檢測(cè)方法的測(cè) 定原理是通過(guò)檢測(cè)結(jié)合到微球上的氨基化探針_變性cDNA-量子點(diǎn)標(biāo)記鏈酶親和素復(fù)合體 的熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)對(duì)待側(cè)物的檢測(cè)。檢測(cè)標(biāo)本的同時(shí)，將空白PCR產(chǎn)物作為正常對(duì)照。計(jì)算 正常對(duì)照平均熒光強(qiáng)度的均值，將標(biāo)本平均熒光強(qiáng)度與之比較并計(jì)算比率。以上實(shí)施方式僅用于幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員更加全面的理解本發(fā)明，但并不對(duì)本發(fā) 明做任何限制。凡依照本發(fā)明的內(nèi)容所做出的任何本領(lǐng)域等同的替換均屬于本發(fā)明保護(hù)的 范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種基于流式熒光編碼微球技術(shù)的用于禽流感病毒多亞型同步檢測(cè)的RT-PCR一流式微球檢測(cè)方法，其特征在于以具有功能化基團(tuán)的聚苯乙烯熒光編碼微球作為固相載體，將禽流感病毒亞型特異性探針以形成共價(jià)鍵方式包被到固相載體上，形成微球-包被探針偶聯(lián)物，與不同亞型禽流感病毒生物素標(biāo)記引物擴(kuò)增獲得的RT-PCR產(chǎn)物發(fā)生特異性反應(yīng)，再與量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈酶親和素反應(yīng)，使用流式分析系統(tǒng)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物中逐一通過(guò)檢測(cè)區(qū)的微球所負(fù)載的多種熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)與陰性樣本對(duì)比，判斷樣本是否為陽(yáng)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于微球-包被探針偶聯(lián)物的形成過(guò)程， 在96孔濾膜板內(nèi)的微球_包被探針偶聯(lián)物的體系中加入帶有生物素的待測(cè)病毒的RT-PCR 產(chǎn)物，進(jìn)行雜交反應(yīng)，RT-PCR產(chǎn)物再與量子點(diǎn)標(biāo)記鏈酶親和素特異性結(jié)合而形成基于微球 的熒光雜交復(fù)合體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于基于微球的熒光雜交復(fù)合體的形成 是以量子點(diǎn)作為熒光標(biāo)記物，用量子點(diǎn)標(biāo)記鏈酶親和素，加入的微球-包被探針偶聯(lián)物、帶 有生物素的待測(cè)病毒RT-PCR產(chǎn)物反應(yīng)完后，加入量子點(diǎn)標(biāo)記鏈酶親和素反應(yīng)形成微球-包 被探針偶聯(lián)物_病毒RT-PCR產(chǎn)物-量子點(diǎn)標(biāo)記鏈酶親和素的熒光雜交復(fù)合體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于根據(jù)內(nèi)部包埋熒光染料比例的不同 對(duì)微球進(jìn)行編碼，不同的熒光編碼微球連接不同亞型禽流感病毒的探針，加入病毒RT-PCR 產(chǎn)物，可同步檢測(cè)同一樣品中多型禽流感病毒，或者同步檢測(cè)多個(gè)樣品中不同型禽流感病
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)的用流式系統(tǒng)對(duì)逐一流過(guò)檢 測(cè)區(qū)的微球所負(fù)載的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，是指檢測(cè)系統(tǒng)的兩束激光光源發(fā)射波長(zhǎng)分別為 488nm和635nm，一束通過(guò)判定微球內(nèi)包埋的染料比例從而對(duì)待測(cè)物進(jìn)行種類(lèi)定性分析，另 一束通過(guò)測(cè)定微球上反應(yīng)連接的熒光探針強(qiáng)度從而判斷待測(cè)物含量多少。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于定性檢測(cè)使用陰性、陽(yáng)性對(duì)照樣本為 參照，根據(jù)待測(cè)病毒的平均熒光強(qiáng)度比率來(lái)定性，平均熒光強(qiáng)度比率大于或等于陰性檢測(cè) 值的2. 1倍時(shí)為陽(yáng)性，小于時(shí)為陰性。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基于流式微球技術(shù)分型檢測(cè)禽流感病毒方法，它包括以下步驟一、根據(jù)公布的禽流感病毒核酸序列設(shè)計(jì)禽流感病毒的亞型特異性探針和引物；二、設(shè)計(jì)和合成用于RT-PCR擴(kuò)增不同亞型禽流感病毒特異性片段的探針與引物，用化學(xué)交聯(lián)法將探針交聯(lián)于相應(yīng)熒光微球，以禽流感病毒提取核酸為模板，RT-PCR擴(kuò)增后與熒光微球進(jìn)行雜交，檢測(cè)熒光信號(hào)進(jìn)行分型；三、通過(guò)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，建立了特異性強(qiáng)、敏感性高、實(shí)用可靠的禽流感病毒檢測(cè)及分型檢測(cè)用的流式微球技術(shù)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101880733SQ201010245670
公開(kāi)日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月5日
發(fā)明者張帆, 李錦豐, 薛強(qiáng), 鄒明強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院