專(zhuān)利名稱(chēng)：鍵合有反應(yīng)性物質(zhì)的微粒的穩(wěn)定化方法及含有該微粒的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鍵合有抗體或抗原等具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微粒(以下簡(jiǎn)稱(chēng)反應(yīng)性物 質(zhì)鍵合微粒)的穩(wěn)定化方法及使用該反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的免疫測(cè)定用試劑。特別是涉及 主要在臨床檢查領(lǐng)域用于利用抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)測(cè)定的反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的穩(wěn)定 化方法及使用該反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的免疫測(cè)定用試劑。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，在臨床檢查等各種檢查中，正在謀求自動(dòng)化和測(cè)定時(shí)間的縮短化。例如， 利用免疫反應(yīng)測(cè)定生物樣品中的微量物質(zhì)的方法得到廣泛使用。作為該免疫測(cè)定方法，可 列舉出RIA法、EIA法、免疫比濁法、膠乳凝集法、膠體金凝集法、免疫色譜法等。其中，膠乳 凝集法、膠體金凝集法等使用鍵合有具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微粒(反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒)的 方法由于不需要反應(yīng)液的分離和洗滌操作，所以特別適合測(cè)定的自動(dòng)化和短時(shí)間化。但是，上述膠乳凝集法和膠體金凝集法由于反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒在分散液中不穩(wěn) 定，因?yàn)槌两祷蜃陨砟葻o(wú)法長(zhǎng)時(shí)間維持反應(yīng)性，所以存在難以在不降低測(cè)定精密度的 情況下長(zhǎng)時(shí)間保存試劑的問(wèn)題。專(zhuān)利文獻(xiàn)1中記載了包括使選自聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環(huán)糊精、聚乙二醇和丙 三醇的至少1種共存于反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒分散液中的工序的反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒沉降 抑制方法。該方法通過(guò)抑制試劑溶液中的反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒沉降使反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒 穩(wěn)定化。但是，當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間保存含有反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的試劑時(shí)，反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒發(fā)生 自身凝集，存在反應(yīng)性降低的問(wèn)題。專(zhuān)利文獻(xiàn)2中記載了添加金屬離子和螯合劑作為穩(wěn)定劑的方法，專(zhuān)利文獻(xiàn)3中記 載了添加鈣離子、鎂離子、硫酸葡聚糖、膽酸、去氧膽酸、黃尿酸或這些物質(zhì)的鹽的方法。但 是，依然存在自身凝集、反應(yīng)性降低等問(wèn)題。而專(zhuān)利文獻(xiàn)4中記載了以在具有硫醇基和氨基的化合物共存下還原氯金酸為特 征的具有陽(yáng)離子性表面的金納米粒子的制備方法(權(quán)利要求項(xiàng)1)。在專(zhuān)利文獻(xiàn)5中記載 了作為包覆混合單層膜的金屬質(zhì)納米粒子的硫普羅寧(★才/ π 二 > tiopronin)單層膜 保護(hù)金納米粒子的合成法(實(shí)施例3)。專(zhuān)利文獻(xiàn)6中記載了免疫反應(yīng)性凝集劑，其特征在 于，相對(duì)于金粒子介由半胱氨酸中的硫原子鍵合含有至少1個(gè)上述半胱氨酸的肽(權(quán)利要 求1)。但是，這些均是示出僅以提高反應(yīng)性為目的而將物質(zhì)鍵合于金粒子表面上的金粒子 的制備方法的文獻(xiàn)，并未公開(kāi)金粒子的穩(wěn)定化方法。在先技術(shù)文獻(xiàn) 專(zhuān)利文獻(xiàn)
專(zhuān)利文獻(xiàn)1 日本特開(kāi)2007-114129號(hào)公報(bào) 專(zhuān)利文獻(xiàn)2 日本特開(kāi)2000-146967號(hào)公報(bào) 專(zhuān)利文獻(xiàn)3 日本特開(kāi)平11-101799號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)4 日本特開(kāi)2005-287507號(hào)公報(bào) 專(zhuān)利文獻(xiàn)5 日本特表2005-534810號(hào)公報(bào) 專(zhuān)利文獻(xiàn)6 日本特開(kāi)2006-317401號(hào)公報(bào)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題
因此，為了在不降低測(cè)定精密度的情況下實(shí)現(xiàn)試劑的長(zhǎng)時(shí)間保存，需要使反應(yīng)性物質(zhì) 鍵合微粒在分散液中穩(wěn)定化，從而長(zhǎng)時(shí)間維持反應(yīng)性的技術(shù)。因此，本發(fā)明的目的在于提供在反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的分散液中使該微粒穩(wěn)定 化的方法。本發(fā)明的目的還在于提供含有可長(zhǎng)時(shí)間維持反應(yīng)性的反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的、 在不降低測(cè)定精密度的情況下可長(zhǎng)時(shí)間保存的試劑。解決課題的手段
本發(fā)明人為達(dá)成上述課題而進(jìn)行深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的分散 液中，通過(guò)使含硫氨基酸或其衍生物共存，可使反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒穩(wěn)定化，且可長(zhǎng)時(shí)間維 持反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的反應(yīng)性，從而完成本發(fā)明。本發(fā)明提供鍵合于具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微粒的穩(wěn)定化方法，該方法包括使含硫氨 基酸或其衍生物共存于該微粒的分散液中的工序。在1個(gè)實(shí)施方式中，上述含硫氨基酸為選自半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸的至少1 種。在其它實(shí)施方式中，在上述分散液中以0. 00Γ2. 0質(zhì)量％的比例含有上述含硫氨 基酸或其衍生物。在另一實(shí)施方式中，包括進(jìn)一步使沉降抑制物質(zhì)共存于上述分散液中的工序。在另一實(shí)施方式中，上述沉降抑制物質(zhì)為選自聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環(huán)糊精、 聚乙二醇和丙三醇的至少1種。在另一實(shí)施方式中，上述聚陰離子為硫酸葡聚糖或肝素。在另一實(shí)施方式中，上述鍵合有具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微粒為鍵合有抗體或抗原的 膠體金粒子。本發(fā)明的試劑含有鍵合有具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微粒和含硫氨基酸或其衍生物，因 此使該微粒穩(wěn)定化。在1個(gè)實(shí)施方式中，上述含硫氨基酸為選自半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸中的至少1 種。在其它實(shí)施方式中，在上述試劑中以0. 00Γ2. 0質(zhì)量％的比例含有上述含硫氨基 酸或其衍生物。在另一實(shí)施方式中，上述試劑進(jìn)一步含有沉降抑制物質(zhì)。在另一實(shí)施方式中，上述沉降抑制物質(zhì)為選自聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環(huán)糊精、 聚乙二醇和丙三醇中的至少1種。在另一實(shí)施方式中，上述聚陰離子為硫酸葡聚糖或肝素。在另一實(shí)施方式中，上述鍵合有具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微粒為鍵合有抗體或抗原的 膠體金粒子。
本發(fā)明還提供含有上述試劑的試劑盒。本發(fā)明進(jìn)一步提供包括將上述試劑和樣品混合的工序的自動(dòng)化免疫測(cè)定方法。發(fā)明效果
根據(jù)本發(fā)明，在用于在臨床檢查等領(lǐng)域中利用抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)測(cè)定的反應(yīng)性物 質(zhì)鍵合微粒的分散液中，可使該微粒穩(wěn)定化。根據(jù)本發(fā)明，可提供含有長(zhǎng)時(shí)間維持反應(yīng)性的 反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的試劑。通過(guò)使用本發(fā)明的試劑，使得在不降低測(cè)定精密度的情況下 長(zhǎng)時(shí)間保存試劑成為可能。


[圖1]示出添加各種濃度的蛋氨酸時(shí)半胱氨酸蛋白酶抑制劑C測(cè)定用第二試劑 (抗半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體鍵合膠體金試劑)反應(yīng)性的經(jīng)時(shí)變化的圖。[圖2]示出在添加各種含硫化合物時(shí)半胱氨酸蛋白酶抑制劑C測(cè)定用第二試劑 (抗半胱氨酸蛋白酶抑制劑C還原IgG鍵合膠體金試劑A)反應(yīng)性的經(jīng)時(shí)變化的圖。[圖3]示出在添加各種氨基酸時(shí)半胱氨酸蛋白酶抑制劑C測(cè)定用第二試劑(抗 半胱氨酸蛋白酶抑制劑C還原IgG鍵合膠體金試劑B)反應(yīng)性的經(jīng)時(shí)變化的圖。
具體實(shí)施例方式1.反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的穩(wěn)定化方法
在本說(shuō)明書(shū)中，反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的穩(wěn)定化是指反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的反應(yīng)性在實(shí) 質(zhì)上無(wú)經(jīng)時(shí)變化，即反應(yīng)性得到長(zhǎng)時(shí)間維持。通過(guò)使反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒穩(wěn)定化，可提供含 有該微粒的、在不降低測(cè)定精密度的情況下可長(zhǎng)時(shí)間保存的試劑。本發(fā)明的反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的穩(wěn)定化方法包括使含硫氨基酸及其衍生物共存 于該微粒的分散液中的工序。本發(fā)明的方法中使用的反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒為可用作免疫測(cè)定試劑的微粒，優(yōu)選 為膠乳粒子和金屬膠體粒子。作為金屬膠體粒子，有金、銀、硒等的膠體粒子，膠體金粒子通 常容易利用，故優(yōu)選使用。膠體金粒子可使用市售品，也可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員通常采用的 方法(例如用枸櫞酸鈉還原氯金酸的方法)制備。膠體金粒子的粒徑為通常5rniTl00nm、優(yōu) 選30nnT60nm的范圍。對(duì)于鍵合于上述微粒的物質(zhì)，只要是特異性鍵合于測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的物質(zhì)，則可以 利用。例如可列舉出抗體、還原IgG、抗體的F(ab’)2片段或Fab’片段、抗原、受體、凝集素、 脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)等具有鍵合親和性的物質(zhì)。在本發(fā)明的方法中，使用含硫氨基酸或其衍生物。在本說(shuō)明書(shū)中，將這些化合物稱(chēng) 為穩(wěn)定化物質(zhì)。穩(wěn)定化物質(zhì)可單獨(dú)使用或?qū)?種以上組合使用。在本說(shuō)明書(shū)中，含硫氨基酸是指天然的含硫氨基酸以及在天然的氨基酸中導(dǎo)入了 硫原子的氨基酸。另外，衍生物意味著有機(jī)化學(xué)中通常使用的概念，是指取代物、加合物等。在作為上述穩(wěn)定化物質(zhì)的含硫氨基酸中，作為天然的含硫氨基酸，例如可列舉出 半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸，作為含硫氨基酸的衍生物，例如可列舉出蛋氨醇、蛋氨醛(J f 二 t 一> methioninal)、蛋氨酰胺、2-烷基半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸、半胱氨醇、半胱 氨醛(〉7 f 4 fcysteinal)和半胱氨酰胺。半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸已市售，故而在本發(fā)明中優(yōu)選利用這些化合物。特別優(yōu)選蛋氨酸。本發(fā)明的方法使上述穩(wěn)定化物質(zhì)共存于上述反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的分散液中。共 存的手段無(wú)特殊限制。例如，可向反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的分散液中加入穩(wěn)定化物質(zhì)，也可向 穩(wěn)定化物質(zhì)或用分散劑稀釋穩(wěn)定化物質(zhì)得到的稀釋液中加入反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒，或可將 反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒和穩(wěn)定化物質(zhì)混合，將該混合物加入分散劑中。需要說(shuō)明的是，分散劑 無(wú)特殊限制，例如可使用水或使用下述緩沖劑的緩沖液等。在本發(fā)明的方法中，分散液中的反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的濃度可以是該領(lǐng)域通常所 采用的濃度。在本發(fā)明的方法中，共存于分散液中的穩(wěn)定化物質(zhì)的濃度可根據(jù)穩(wěn)定化物質(zhì)的種 類(lèi)適當(dāng)設(shè)定。例如，在含硫氨基酸的情況下，優(yōu)選為0. 00Γ2. 0質(zhì)量％，更優(yōu)選為0. 005^1. 0 質(zhì)量％，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 02、. 5質(zhì)量％。在本發(fā)明的方法中，也可向分散液中進(jìn)一步適當(dāng)添加沉降抑制物質(zhì)。在本說(shuō)明書(shū) 中，沉降抑制物質(zhì)是指通過(guò)共存于反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的分散液中來(lái)抑制該微粒的沉降的 物質(zhì)。作為上述沉降抑制物質(zhì)，例如可列舉出聚陰離子或其鹽、葡聚糖、環(huán)糊精、聚乙二 醇或丙三醇。沉降抑制物質(zhì)可單獨(dú)使用或?qū)?種以上組合使用。作為屬于上述沉降抑制物質(zhì)中的1種的聚陰離子，例如可列舉出硫酸葡聚糖、肝 素、聚苯乙烯磺酸、透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素。作為聚陰離子的鹽，例如可列舉出硫酸葡聚糖 鈉、肝素鈉等。在聚陰離子或其鹽中，從沉降抑制效果高的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選使用具有硫酸基 的水溶性高分子化合物。這樣的化合物為例如硫酸葡聚糖、肝素、硫酸葡聚糖鈉和肝素鈉。在本發(fā)明的方法中，共存于分散液中的沉降抑制物質(zhì)的濃度可根據(jù)沉降抑制物 質(zhì)的種類(lèi)適當(dāng)設(shè)定。例如，在聚陰離子或其鹽的情況下，優(yōu)選為0.3、. 0質(zhì)量％，更優(yōu)選 為0. 5^2. 0質(zhì)量％，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 7^1. 1質(zhì)量％。在葡聚糖或環(huán)糊精的情況下，優(yōu)選為 0. Γ5. 0質(zhì)量％，更優(yōu)選為0. 2^1. 8質(zhì)量％，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 5^1. 5質(zhì)量％。在聚乙二醇的情 況下，優(yōu)選為0. 3^5. 0質(zhì)量％，更優(yōu)選為0. 5^3. 0質(zhì)量％。在丙三醇的情況下，優(yōu)選為5 40 質(zhì)量％，更優(yōu)選為10 35質(zhì)量％。在本發(fā)明的方法中，作為其它穩(wěn)定化物質(zhì)，也可向分散液中進(jìn)一步適當(dāng)添加金屬 離子及螯合劑(專(zhuān)利文獻(xiàn)2)，選自鈣離子、鎂離子、硫酸葡聚糖、膽酸、去氧膽酸、黃尿酸及 這些化合物的鹽的至少1種(專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。在本發(fā)明的方法中，分散液中可進(jìn)一步適當(dāng)含有目前所使用的緩沖劑、糖及糖醇、 白蛋白、聚乙二醇、氯化鈉、防腐劑及其它物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的方法，可使穩(wěn)定化物質(zhì)共存于反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的分散液中，由 此可使反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒穩(wěn)定。因此，通過(guò)使用該方法，使得在分散液中長(zhǎng)時(shí)間維持該微 粒的反應(yīng)性成為可能。特別是在使聚陰離子、葡聚糖等沉降抑制物質(zhì)共存于分散液中時(shí)有用。2.含有反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒和穩(wěn)定化物質(zhì)的試劑
本發(fā)明的試劑含有上述反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒和上述穩(wěn)定化物質(zhì)，根據(jù)需要含有上述沉 降抑制物質(zhì)、其它穩(wěn)定化物質(zhì)、緩沖劑、糖、糖醇、白蛋白、氯化鈉、防腐劑及其它添加劑。本發(fā)明的試劑由于使反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒穩(wěn)定化，所以可長(zhǎng)時(shí)間維持該微粒的反應(yīng)性。作為本發(fā)明的試劑的保存溫度，優(yōu)選為25°C以下，更優(yōu)選為10°C以下，進(jìn)一步優(yōu)選為 8°C以下。作為本發(fā)明的試劑的其它保存條件，優(yōu)選為暗處且低濕度下。本發(fā)明的試劑通常為液狀，作為使用反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的試劑、特別是在該領(lǐng) 域通常所使用的免疫測(cè)定用試劑使用。本發(fā)明的試劑中的反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒濃度和穩(wěn)定化物質(zhì)濃度無(wú)特殊限制。從提 高反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的穩(wěn)定性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為在上述方法中所采用的濃度范圍內(nèi)。作為本發(fā)明的試劑可含有的緩沖劑，可列舉出磷酸緩沖液，三羥甲基氨基甲烷鹽 酸緩沖液，琥珀酸緩沖液，甘氨酰甘氨酸、MES (2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)、HEPES (N-2-羥乙 基-哌嗪-N，-乙磺酸)、TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、MOPS (3-(N-嗎啡 啉)丙磺酸)、PIPES(哌嗪-1，4-雙乙磺酸))、Bis-Tris (雙羥乙基)亞胺基三 (羥甲基)甲烷)等的Good緩沖液等。上述緩沖劑優(yōu)選按照試劑中的pH為5、或濃度為 廣IOOmM的條件含有。作為本發(fā)明的試劑可含有的糖和糖醇，可列舉出葡萄糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、麥芽 糖、甘露醇、山梨醇等。上述糖或糖醇在試劑中的濃度優(yōu)選為0. 0Γ10. 0質(zhì)量％。作為本發(fā)明的試劑可含有的白蛋白，可列舉出牛血清白蛋白(BSA)等。白蛋白在 試劑中的濃度優(yōu)選為0.00Γ1. 0質(zhì)量％。作為本發(fā)明的試劑中可含有的防腐劑，可列舉出疊氮化鈉等。防腐劑在試劑中的 濃度優(yōu)選為0.0廣0.5質(zhì)量％。作為本發(fā)明的試劑中可含有的其它添加劑，可列舉出吐溫20、聚乙二醇月桂醚、 5-溴水楊酸、水楊酸鈉、苯甲酸鈉、苯磺酸鈉、苯酚、麝香草酚等。如上所述，本發(fā)明的試劑由于使反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒穩(wěn)定化，所以可長(zhǎng)時(shí)間維持 該微粒的穩(wěn)定性。因此，當(dāng)使用該試劑進(jìn)行免疫測(cè)定時(shí)，在不降低測(cè)定精密度的情況下長(zhǎng)時(shí) 間保存試劑成為可能。3.試劑盒
本發(fā)明的試劑盒含有包含上述反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒和穩(wěn)定化物質(zhì)的試劑(本發(fā)明的 試劑)。該試劑盒例如可用于采用膠乳凝集法、膠體金凝集法等的免疫測(cè)定，特別是可用于 自動(dòng)化免疫測(cè)定。當(dāng)將本發(fā)明的試劑盒用作免疫測(cè)定用試劑盒時(shí)，該試劑盒通?？捎珊休o助樣品 的稀釋、樣品在免疫反應(yīng)前的預(yù)處理及免疫反應(yīng)的成分等的第一試劑，含有本發(fā)明的試劑 的第二試劑，和根據(jù)需要用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)成。本發(fā)明的試劑盒可根據(jù)本發(fā)明的試劑中的微粒所鍵合的反應(yīng)性物質(zhì)，以樣品中的 各種物質(zhì)作為測(cè)定對(duì)象。作為可成為測(cè)定對(duì)象的物質(zhì)(測(cè)定對(duì)象物質(zhì))，例如可列舉出白蛋 白、血紅蛋白、血紅蛋白Ale、肌紅蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、鐵 蛋白、〃-胎蛋白、癌胚抗原、CA19-9、前列腺特異抗原、C反應(yīng)性蛋白(CRP)、纖維素分解產(chǎn) 物(FDP)、胃蛋白酶原I和II、膠原等蛋白質(zhì)，高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋 白等脂蛋白，脫氧核糖核酸、核糖核酸等核酸，堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、脂酶、淀粉酶等酶， IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等免疫球蛋白，乙肝病毒、丙肝病毒、人免疫缺陷病毒、幽門(mén)螺旋桿菌 及與之相對(duì)應(yīng)的抗體等與感染癥有關(guān)的抗原或抗體，氟哌啶醇、溴哌利多等藥物，性激素等 激素等。
作為含有供測(cè)定的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的樣品，可列舉出血液、血漿、血清、尿、糞便(混 懸液)、髄液、腹水等生物樣品，從環(huán)境中取得的樣品或其提取物等。4.自動(dòng)化免疫測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的自動(dòng)化免疫測(cè)定方法使用本發(fā)明的試劑進(jìn)行。該自動(dòng)化免疫測(cè)定方法由于在 試劑中使反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒穩(wěn)定化，可長(zhǎng)時(shí)間維持反應(yīng)性，所以即使使用長(zhǎng)時(shí)間保存的 試劑也可得到精密度高的測(cè)定值。具體而言，本發(fā)明的自動(dòng)化免疫測(cè)定方法通過(guò)將樣品、第一試劑和本發(fā)明的試劑 (第二試劑)放于自動(dòng)分析裝置中，將第一試劑和第二試劑依次自動(dòng)混合于樣品中來(lái)進(jìn)行。 第一試劑和第二試劑的比例可酌情設(shè)定。優(yōu)選將本發(fā)明的試劑(第二試劑)稀釋至2、倍， 更優(yōu)選將其稀釋至3飛倍。
實(shí)施例以下根據(jù)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體地說(shuō)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例限定。在 以下實(shí)施例中，只要無(wú)特殊記載，%均表示質(zhì)量/容量％(w/v%)。制備例1 膠體金溶液的制備
邊攪拌邊向IL的95°C蒸餾水中加入2mL的10%氯金酸水溶液，在1分鐘后加入IOmL 的洲枸櫞酸鈉水溶液，進(jìn)一步攪拌20分鐘，然后冷卻至30°C。待冷卻后，用0. 1%碳酸鉀水 溶液調(diào)節(jié)至PH7. 1。制備例2 抗半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體鍵合膠體金試劑的制備
將抗半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體(Dako Japan Inc. ( Ψ 二 ^ ^ >株式會(huì)社)) 用含有0. 05%疊氮化鈉的IOmM HEPES (pH7. 1)稀釋?zhuān)瞥?0// g/mL的濃度。將IOOmL的 該抗半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體溶液加入到約IL的在制備例1中制備的膠體金溶液中， 在冷藏下攪拌2小時(shí)。進(jìn)一步添加IlOmL的含有5. 46%甘露醇、0. 5%牛血清白蛋白(BSA) 和0. 05%疊氮化鈉的IOmM HEPES (pH7. 1)，于37°C攪拌90分鐘。接著，于8000rpm下離 心分離40分鐘，除去上清液，然后加入約IL的含有3%甘露醇、0. P/oBSA和0. 05%疊氮化鈉 的5mM HEPES (pH7. 5) (Α溶液)，將抗體鍵合膠體金分散。進(jìn)一步于8000rpm下離心分離 40分鐘，除去上清液，用含有1. 5%硫酸葡聚糖鈉的A溶液分散抗體鍵合膠體金，使總量為 240mL,制得抗半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體鍵合膠體金試劑。制備例3 抗半胱氨酸蛋白酶抑制劑C還原IgG的制備
將抗半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體(Dako Japan Inc.)用含有0. 05%疊氮化鈉、5mM EDTA *2Na和150mM氯化鈉的IOmM HEPES (pH7. 1) (B溶液)進(jìn)行透析，然后用B溶液進(jìn)行 稀釋?zhuān)節(jié)舛冗_(dá)到10mg/mL。向該抗體溶液中添加2-巰基乙胺鹽酸鹽，使?jié)舛冗_(dá)到6mg/mL， 待溶解后于37°C加熱90分鐘。使用凝膠過(guò)濾色譜柱除去2-巰基乙胺鹽酸鹽，制得抗半胱 氨酸蛋白酶抑制劑C還原IgG。制備例4 抗半胱氨酸蛋白酶抑制劑C還原IgG鍵合膠體金試劑的制備
將在制備例3中制備的抗半胱氨酸蛋白酶抑制劑C還原IgG用含有0. 05%疊氮化鈉的 IOmM HEPES (pH7. 1)稀釋?zhuān)瞥?0// g/mL的濃度。將IOOmL的該抗半胱氨酸蛋白酶抑制劑 C還原IgG溶液加入到IL的在制備例1中制備的膠體金溶液中，在冷藏下攪拌2小時(shí)。進(jìn) 一步添加IlOmL的含有5. 46%甘露醇、0. 5%BSA和0. 05%疊氮化鈉的IOmM HEPES (pH7. 1)，于37°C攪拌90分鐘。接著，于SOOOrpm下離心分離40分鐘，除去上清液，然后加入約IL的 A溶液，將還原IgG鍵合膠體金分散。進(jìn)一步于SOOOrpm下離心分離40分鐘，除去上清液， 用含有1. 5%硫酸葡聚糖鈉的A溶液分散抗體敏化膠體金，使總量為MOmL，制得抗半胱氨酸 蛋白酶抑制劑C還原IgG鍵合膠體金試劑A。用含有1. 25%硫酸葡聚糖鈉的A溶液分散抗 體敏化膠體金，使總量為MOmL，制得抗半胱氨酸蛋白酶抑制劑C還原IgG鍵合膠體金試劑 B0制備例5 半胱氨酸蛋白酶抑制劑C測(cè)定用第一試劑的制備
向含有5%氯化鈉、0. 2%EDTA、0.洲烷基苯二磺酸鈉鹽和0. 35%聚氧乙烯月桂醚的0. 5M Bis-Tris (pH6. 7)緩沖液中添加1. (Γ2. 5%左右的作為反應(yīng)促進(jìn)劑的聚乙二醇，制成半胱 氨酸蛋白酶抑制劑C測(cè)定用第一試劑。實(shí)施例1 蛋氨酸的添加效果的研究
向在制備例2中制備的抗半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體鍵合膠體金試劑中添加蛋氨 酸，使其濃度達(dá)到0. 005%,0. 02%,0. 05%,0. 1%或0. 5%，制成半胱氨酸蛋白酶抑制劑C測(cè)定 用第二試劑。在半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度為8mg/L的樣品的測(cè)定中，對(duì)因保存引起的 第二試劑反應(yīng)性的經(jīng)時(shí)變化進(jìn)行研究。作為對(duì)照，將未添加蛋氨酸的抗半胱氨酸蛋白酶抑 制劑C抗體鍵合膠體金試劑作為半胱氨酸蛋白酶抑制劑C測(cè)定用第二試劑。將第二試劑于 25°C保存，在開(kāi)始時(shí)、4日后、8日后、20日后和39日后，使用在制備例5中制備的第一試劑， 按照如下所示的方法進(jìn)行研究。(研究方法)
向3// L的樣品中注入200// L的第一試劑，于37°C加熱約5分鐘，接著注入100// L的 第二試劑，使之于37°C反應(yīng)，通過(guò)日立7070自動(dòng)分析裝置，在505nm的主波長(zhǎng)和660nm的 副波長(zhǎng)下測(cè)定測(cè)光點(diǎn)18至M的吸光度變化量。將經(jīng)過(guò)各種保存時(shí)間后的吸光度變化量相 對(duì)于保存開(kāi)始時(shí)的吸光度變化量的比例作為第二試劑的反應(yīng)性(%)。結(jié)果如表1和圖1所示 ο[表1]
權(quán)利要求
1.鍵合有具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微粒的穩(wěn)定化方法，所述方法包括使含硫氨基酸或其衍 生物共存于所述微粒的分散液中的工序。
2.權(quán)利要求1的方法，其中，所述含硫氨基酸為選自半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸的至少 1種。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中，在所述分散液中以0.00Γ2. 0質(zhì)量％的比例含有所述 含硫氨基酸或其衍生物。
4.權(quán)利要求廣3中任一項(xiàng)的方法，其中，所述方法包括進(jìn)一步使沉降抑制物質(zhì)共存于 所述分散液中的工序。
5.權(quán)利要求4的方法，其中，所述沉降抑制物質(zhì)為選自聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環(huán)糊 精、聚乙二醇和丙三醇的至少1種。
6.權(quán)利要求5的方法，其中，所述聚陰離子為硫酸葡聚糖或肝素。
7.權(quán)利要求廣6中任一項(xiàng)的方法，其中，所述鍵合有具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微粒為鍵合 有抗體或抗原的膠體金粒子。
8.試劑，所述試劑含有鍵合有具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微粒和含硫氨基酸或其衍生物。
9.權(quán)利要求8的試劑，其中，所述含硫氨基酸為選自半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸的至少 1種。
10.權(quán)利要求8或9的試劑，其中，在所述試劑中以0.00Γ2. 0質(zhì)量％的比例含有所述 含硫氨基酸或其衍生物。
11.權(quán)利要求纊10中任一項(xiàng)的試劑，其中，所述制劑進(jìn)一步含有沉降抑制物質(zhì)。
12.權(quán)利要求11的試劑，其中，所述沉降抑制物質(zhì)為選自聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環(huán) 糊精、聚乙二醇和丙三醇的至少1種。
13.權(quán)利要求12的試劑，其中，所述聚陰離子為硫酸葡聚糖或肝素。
14.權(quán)利要求壙13中任一項(xiàng)的試劑，其中，所述鍵合有具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微粒為鍵 合有抗體或抗原的膠體金粒子。
15.試劑盒，所述試劑盒含有權(quán)利要求纊14中任一項(xiàng)的試劑。
16.自動(dòng)化免疫測(cè)定方法，所述測(cè)定方法包括將權(quán)利要求壙14中任一項(xiàng)的試劑和樣品 混合的工序。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供通過(guò)在反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的分散液中使該微粒穩(wěn)定來(lái)長(zhǎng)時(shí)間維持分散液中的反應(yīng)性物質(zhì)鍵合微粒的反應(yīng)性的方法。本發(fā)明提供鍵合有具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微粒的穩(wěn)定化方法，該方法包括使含硫氨基酸或其衍生物分散于該微粒的分散液中的工序。作為含硫氨基酸，優(yōu)選為半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸。本發(fā)明的方法特別在使聚陰離子、葡聚糖等沉降抑制物質(zhì)共存于分散液中時(shí)有用。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102089660SQ20098012634
公開(kāi)日2011年6月8日 申請(qǐng)日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月14日
發(fā)明者田中睦 申請(qǐng)人:愛(ài)芙樂(lè)賽制藥株式會(huì)社