專利名稱：用于檢測微生物的方法和組合物的制作方法
用于檢測微生物的方法和組合物相關(guān)專利申請的交叉引用本申請要求2008年2月14日提交的美國臨時申請序列號61/028，898的權(quán)利，該 臨時申請以引用方式并入本文。
背景技術(shù)：
真菌微生物(例如酵母和霉菌)在自然界中普遍存在。雖然真菌微生物(例如酵 母和霉菌)在一些領(lǐng)域如抗生素或酶的生產(chǎn)中是有用的，但已知它們會造成食物腐敗，某 些種類還已知會產(chǎn)生毒素或者引起人類或動物感染。真菌微生物包括非常龐大和多樣化的一群化能異養(yǎng)微生物。有大約1500種酵母 菌。大多數(shù)酵母菌以單細胞生物體形式存在，通過出芽生殖繁殖。一些種類以多細胞形式 存在，還有其他種類通過二分分裂方式繁殖。霉菌包括可形成長長的多細胞菌絲的絲狀真 菌。霉菌通過形成小孢子來繁殖，這些孢子通常能抵抗多種惡劣環(huán)境條件，如極端溫度。真菌微生物的存在通常是通過標準的培養(yǎng)技術(shù)來檢測。將樣品放入營養(yǎng)培養(yǎng)基中 溫育一段時間，以讓微生物增殖。溫育后，菌落可以肉眼看見，或者可用顯微鏡檢查樣品以 觀察和鑒定微生物。基于生長的培養(yǎng)試驗法仍是真菌微生物檢測和計數(shù)的最通用方法。真菌微生物的生長速度各不相同。某些酵母種類可每隔大約30-40分鐘進行細胞 分裂。這些酵母生物體能在約1-2天后檢測和計數(shù)。相比之下，某些霉菌每次細胞分裂需 要幾個小時。這些霉菌能在約4-5天后檢測和計數(shù)。盡管目前有多種方法供真菌微生物檢測和計數(shù)，但仍需要更快更靈敏的方法來進 行真菌微生物檢測和計數(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及檢測樣品中的酵母和/或霉菌微生物并任選對其進行計數(shù)。盡管真菌 微生物存在遺傳和生化多樣性，但本發(fā)明方法和組合物能提供對樣品中多種酵母和霉菌微 生物的簡便且同時進行的檢測。在一個方面，本發(fā)明提供用于檢測靶標微生物或其成分的方法。該方法包括提供 識別元件和懷疑含有靶標微生物的樣品，其中該識別元件選擇性結(jié)合酵母聚糖。該方法還 包括使該樣品與該識別元件之間接觸并檢測該靶標微生物。任選地，該方法還可包括在培 養(yǎng)裝置中提供營養(yǎng)培養(yǎng)基的步驟和將該樣品在容許至少一次細胞分裂的條件下進行溫育 的步驟。在另一個方面，本發(fā)明提供用于檢測靶標微生物或其成分的方法。該方法可包括 提供選擇性結(jié)合酵母聚糖的識別元件、產(chǎn)生能被檢測到的信號的信號元件和懷疑含有靶標 微生物的樣品。信號元件可包含連接部分。該方法還包括使該樣品與該識別元件和該信號 元件之間接觸并檢測該能被檢測到的信號。任選地，該方法還可包括在培養(yǎng)裝置中提供營 養(yǎng)培養(yǎng)基的步驟和將該樣品在容許至少一次細胞分裂的條件下進行溫育的步驟。在另一個方面，本發(fā)明提供用于檢測靶標微生物或其成分的方法。該方法可包括
5提供識別元件、產(chǎn)生能被檢測到的信號的信號元件和懷疑含有靶標微生物的樣品。該識別 元件可與該信號元件連接且可選擇性結(jié)合酵母聚糖。該方法還包括使該樣品與該識別元件 之間接觸并檢測該能被檢測到的信號。任選地，該方法還可包括在培養(yǎng)裝置中提供營養(yǎng)培 養(yǎng)基的步驟和將該樣品在容許至少一次細胞分裂的條件下進行溫育的步驟。在另一個方面，本發(fā)明提供用于檢測靶標微生物或其成分的方法。該方法可包括 提供包含脂質(zhì)雙層和產(chǎn)生能被檢測到的信號的信號元件的脂質(zhì)囊泡、選擇性結(jié)合細胞壁成 分的識別元件和懷疑含有該靶標微生物的樣品。該方法還可包括使該樣品、該識別元件和 該脂質(zhì)囊泡之間在能有效引起該脂質(zhì)囊泡與如果存在的該靶標微生物的結(jié)合的條件下接 觸，并檢測該能被檢測到的信號。任選地，該方法還可包括在培養(yǎng)裝置中提供營養(yǎng)培養(yǎng)基的 步驟和將該樣品在容許至少一次細胞分裂的條件下進行溫育的步驟。在另一個方面，本發(fā)明提供用于檢測靶標微生物的組合物。該組合物可包含選擇 性結(jié)合酵母聚糖的捕獲劑和產(chǎn)生能被檢測到的信號的信號元件。術(shù)語“被分析物”和“抗原”可互用，指所關(guān)注的微生物特征性的各種分子(如酵母 聚糖)或分子表位(如酵母聚糖的不同結(jié)合位點)或微生物全細胞。它們包括細胞壁成分 (如細胞壁蛋白質(zhì))、細胞壁外成分(如甘露聚糖、幾丁質(zhì)或酵母聚糖)、細胞內(nèi)成分(如細 胞質(zhì)膜蛋白質(zhì))等。詞語“優(yōu)選的”和“優(yōu)選地”是指在某些情況下可提供某些有益效果的本發(fā)明實施 例。然而，在相同的或其他的情況下，其他實施例也可以是優(yōu)選的。此外，述及一個或多個 優(yōu)選的實施例并非暗示其他實施例不可用，也并非旨在將其他實施例排除在本發(fā)明的范圍 之外。術(shù)語“包含”和其變型形式在說明書和權(quán)利要求書中出現(xiàn)時不具有限制性意義。本文所用的“ 一種”、“至少一種”和“ 一種或多種”可互換使用。因此，例如，懷疑 含有“一種”靶標微生物的樣品可解釋為意指該樣品可包含“一種或多種”靶標微生物。術(shù)語“和/或”意指所列要素的一個或全部，或所列要素的任何兩個或更多個的組
口 o另外，在本文中，由端點界定的數(shù)值范圍包括該范圍內(nèi)所含的所有數(shù)值(如，1至5 包括 1、1. 5,2,2. 75,3,3. 80、4、5 等)。上述的“發(fā)明內(nèi)容”并非意圖描述本發(fā)明的每個公開的實施例或每種實施方式。下 面的描述更為具體地舉例說明了示例性的實施例。在本專利申請中的幾個地方，通過實例 的列表來提供指導，這些實例可以以各種組合來使用。在每種情況中，所述及的列表只是用 作代表性的群組，不應被解釋為是排他性的列表。


本發(fā)明將結(jié)合下面所列的附圖進行進一步的闡述，其中在幾個視圖中相同的結(jié)構(gòu) 由相同的數(shù)字指代。圖1是根據(jù)本發(fā)明一個實施例，信號元件和靶標微生物之間的結(jié)合相互作用的示 意圖。圖2a是根據(jù)本發(fā)明一個實施例，靶標微生物、識別元件和帶標記的第二識別元件 之間的結(jié)合相互作用的示意圖。
圖2b是根據(jù)本發(fā)明一個實施例，靶標微生物、帶生物素標記的識別元件和帶鏈霉 抗生物素蛋白標記的信號元件之間的結(jié)合相互作用的示意圖。圖3是根據(jù)本發(fā)明一個實施例，連接到載體材料的捕獲劑、細胞壁成分、帶生物素 標記的識別元件和帶鏈霉抗生物素蛋白標記的信號元件之間的結(jié)合相互作用的示意圖。圖4a是根據(jù)本發(fā)明一個實施例，靶標微生物、帶生物素標記的識別元件和含有潛 在信號元件的帶生物素標記的脂質(zhì)囊泡的結(jié)合相互作用的示意圖。圖4b是圖4a的潛在信號元件的活化的示意圖。圖5a是根據(jù)本發(fā)明一個實施例，靶標微生物、帶生物素標記的識別元件、鏈霉抗 生物素蛋白和含有潛在信號元件的帶生物素標記的脂質(zhì)囊泡的結(jié)合相互作用的示意圖。圖5b是圖5a的潛在信號元件的活化的示意圖。圖6a是根據(jù)本發(fā)明一個實施例，連接到載體材料的捕獲劑、細胞壁成分、帶生物 素標記的識別元件、鏈霉抗生物素蛋白和含有潛在信號元件的帶生物素標記的脂質(zhì)囊泡的 結(jié)合相互作用的示意圖。圖6b是圖6a的潛在信號元件的活化的示意圖。圖7a是使用捕獲劑檢測樣品中的靶標微生物的方法的框圖。圖7b是檢測樣品中的靶標微生物的方法的框圖。圖7c是采用生長步驟檢測樣品中的靶標微生物的方法的框圖。
具體實施例方式當試圖開發(fā)用于檢測酵母和霉菌微生物當中的大多數(shù)或全部種類的快速方法時， 這兩類微生物的多樣性提出了一個挑戰(zhàn)。多樣性可由各真菌微生物的基因組和蛋白質(zhì)組的 差異看出。多樣性還由這些微生物在傳統(tǒng)的生長培養(yǎng)基上的生長速度在相對較寬的范圍得 到反映。本發(fā)明涉及用于快速檢測多種多樣的酵母和霉菌微生物的方法和組合物。這些方 法包括使用選擇性結(jié)合在大量不同的真菌微生物中存在的被分析物(例如細胞壁成分)的 識別元件，來傳遞用于檢測這些微生物的信號元件。酵母聚糖作為多種真菌微生物的細胞 壁中存在的葡聚糖，是檢測酵母和霉菌微生物的優(yōu)選被分析物。真菌細胞壁基質(zhì)的主要多糖由非纖維素葡聚糖例如酵母聚糖和糖原樣化合物、甘 露聚糖(甘露糖的聚合物)、殼聚糖(葡糖胺的聚合物)和半乳聚糖(半乳糖的聚合物)組 成。可能存在少量的巖藻糖、鼠李糖、木糖和糖醛酸。許多真菌尤其是酵母具有處于a-和葡聚糖的基質(zhì)中的可溶性肽甘露聚糖 (peptidomannan)作為它們外細胞壁的成分。甘露聚糖、半乳甘露聚糖和鼠李甘露聚糖造成 對許多醫(yī)學上重要的酵母和霉菌的免疫應答(鼠李甘露聚糖的情況較少)。甘露聚糖是甘 露糖的聚合物或具有a-D-甘露聚糖主鏈的雜聚糖。在結(jié)構(gòu)上，甘露聚糖由內(nèi)芯、外鏈和堿 敏感的寡甘露糖苷組成。用來檢測微生物的信號元件主要分成兩類明顯信號元件和潛在信號元件。明顯 信號元件是能容易被多種手段(如熒光)中的至少一種檢測到的分子或組合物。明顯信號 元件的非限制性例子包括染料(例如熒光染料)、顆粒(例如磁性顆粒、聚合物顆?；蚪痤w 粒，其可任選用染料標記)、多肽(例如酶或熒光蛋白如GFP或YFP)以及其他可用可檢測部分(例如熒光素)進行標記并連接到識別元件(例如抗體)的化學基團(例如聚氧化烯)。 信號元件與識別元件的連接優(yōu)選不干擾識別元件與其相應的結(jié)合伴侶的相互作用。潛在信號元件是被隔離或保護而不能容易檢測到的分子或組合物，直到隔離或保 護被降低到該信號元件變得可檢測的這么一個程度才能被檢測到。潛在信號元件的非限制 性例子包括被隔離在脂質(zhì)囊泡當中的酶、酶底物、染料和/或熒光分子。將酶與其相應的底 物隔離開來能防止發(fā)色反應或發(fā)熒光反應?？蓪晒夥肿右宰銐蚋叩臐舛劝b在脂質(zhì)囊泡 中，以促進熒光猝滅?；蛘?，可將熒光分子與相應的猝滅試劑一起包裝在脂質(zhì)囊泡中。當脂 質(zhì)囊泡破開時，熒光分子和/或猝滅試劑的濃度可變得足夠稀釋以克服猝滅作用，從而變 得可檢測地發(fā)熒光。圖1顯示使用直接連接到識別元件的明顯信號元件檢測靶標微生物的方法的一 個實施例。在這個實施例中，將含有包含被分析物122(例如酵母聚糖)的靶標微生物120 的樣品與選擇性結(jié)合被分析物122的識別元件130(例如抗體)混合。識別元件130還 包含直接連接到識別元件130的信號元件140(例如熒光染料)。有多種將小分子(例 如生物素或熒光染料)或多肽(例如酶)連接到抗體的方法是本領(lǐng)域公知的(參見例如 "Antibodies, A Laboratory Manual ”;E，Harlow 禾口 D. Lane (編輯)；1988 ；冷泉港實驗室出 版社；美國紐約州冷泉港)。異硫氰酸熒光素(FITC)是可直接連接到識別元件的熒光信號 元件一個例子。圖1中還顯示了任選的載體材料115。在本發(fā)明方法中，靶標微生物120可自由懸 浮于液體相中，或者可附接到載體材料115。載體材料115的非限制性例子包括塑料薄膜、 顆?；蚧?例如微量滴定板)；玻璃薄膜、顆?；蚧?例如玻璃小珠或載玻片)；金屬 薄膜、顆?；蚧?；膜和/或過濾器(例如玻璃纖維過濾器、尼龍或硝酸纖維素)；陶瓷顆粒 或基材；水凝膠(例如瓊脂糖或聚丙烯酰胺)，或者任何兩種或更多種前述材料的組合。有 多種將靶標微生物120固定于載體材料115的方法是本領(lǐng)域公知的。固定靶標微生物120 的非限制性例子包括熱固定、化學交聯(lián)(例如使用戊二醛)、抗體捕獲等。固定靶標微生物 120的方法應加以選擇，使得它不會掩蓋、改變或破壞全部的被分析物122而妨礙識別元件 130選擇性結(jié)合被分析物122。圖2a顯示使用間接連接到識別元件的明顯信號元件檢測靶標微生物的方法的一 個實施例。在這個實施例中，將含有包含被分析物222 (例如酵母聚糖)的靶標微生物220 的樣品與選擇性結(jié)合被分析物222的識別元件230 (例如抗體)混合。標記有信號元件240 的第二識別元件235 (例如第二抗體)選擇性結(jié)合識別元件230。在這個實施例中，信號元 件240包含將酶底物254轉(zhuǎn)化成可檢測酶產(chǎn)物256的酶活性。酶反應可通過本領(lǐng)域公知的 多種手段檢測，例如通過顏色變化(例如光吸收或反射)、通過熒光、通過阻抗或電導率或 通過發(fā)光來檢測。如上所述，靶標微生物220可自由懸浮于液體相中，或者可附接到載體材 料(未顯示)。圖2b顯示使用間接連接到識別元件的明顯信號元件檢測靶標微生物的方法的另 一個實施例。在這個實施例中，將含有包含被分析物222(例如酵母聚糖)的靶標微生物 220的樣品與選擇性結(jié)合被分析物222且包含生物素基團236的識別元件230 (例如抗體) 混合。標記有信號元件240的生物素結(jié)合分子238 (例如抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋 白)選擇性結(jié)合生物素基團236。在這個實施例中，信號元件240包含將酶底物254轉(zhuǎn)化成
8可檢測酶產(chǎn)物256的酶活性。信號元件240通過接頭237連接到生物素結(jié)合分子238。用 來連接不同的分子如兩個多肽的接頭237是本領(lǐng)域公知的，在下文有更詳細的描述。酶反 應可通過多種上述的手段檢測。如上所述，靶標微生物220可自由懸浮于液體相中，或者可 附接到載體材料(未顯示)。圖3顯示在夾心型測定中使用明顯信號元件檢測靶標微生物的方法的一個實施 例。在這個實施例中，捕獲劑330a(例如選擇性結(jié)合酵母聚糖的抗體或受體)連接到載體 材料315。將含有被分析物322 (例如酵母聚糖)的樣品與標記有生物素336的識別元件 330b (例如選擇性結(jié)合酵母聚糖的抗體或受體)、標記有信號元件352的生物素結(jié)合分子 338(例如抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白)和捕獲劑330a(連接到載體材料315)接觸， 以形成圖3中所示的復合物。在這個實施例中，信號元件352包含將酶底物354轉(zhuǎn)化成可 檢測酶產(chǎn)物356的酶活性。在這個和其他的實施例中，信號元件352可通過任選的接頭337 連接到生物素結(jié)合分子338，只要接頭337不會妨礙生物素結(jié)合分子338結(jié)合生物素336和 不會阻斷信號元件352的酶活性。接頭337的例子在下文描述。載體材料315可以多種形 式(例如薄膜、膜、顆粒)構(gòu)造和用多種不同的材料構(gòu)造。載體材料115的非限制性例子在 上文描述過。圖4a顯示使用潛在信號元件檢測靶標微生物的方法的一個實施例。在這個實施 例中，將含有包含被分析物422(例如酵母聚糖)的靶標微生物420的樣品與選擇性結(jié)合被 分析物422的識別元件430(例如包含來自Dectin-1的碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域的抗體或組 合物)和脂質(zhì)體450混合。在這個實施例中，脂質(zhì)體450充當潛在信號元件，因為脂質(zhì)體 450、識別元件430和靶標微生物420本身的相互作用并不一定導致產(chǎn)生能被檢測到的信 號。更確切地，在這個實施例中，一個另外的步驟(在圖4b中顯示)可產(chǎn)生能被檢測到的 信號。在這個實施例中，識別元件430還包含通過任選的接頭437連接到識別元件的生物 素結(jié)合分子438 (例如抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白)。或者，生物素結(jié)合元件438可 直接連接到識別元件430。脂質(zhì)體450包含酶452和能被生物素結(jié)合元件438選擇性結(jié)合的生物素436。脂質(zhì) 體450可從包含生物素436的磷脂構(gòu)造而成。例如，雙層膜458可如實例3中所述從N-生 物素酰-1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(Avanti Polar Lipids，美國亞拉巴馬 州Alabaster市)合成，和/或從非生物素酰化的磷脂合成。酶452可(例如以含水懸浮 液的形式)存在于脂質(zhì)體450當中(如圖4a中所示)?；蛘撸?52可以與脂質(zhì)體450的 雙層膜458物理締合。本文所用的“物理締合”意指該酶可跨越雙層膜458的兩個脂質(zhì)層 (例如該酶的至少一部分在雙層膜458的兩側(cè)面上)，或者酶452可分配到雙層膜458的內(nèi) 脂質(zhì)層或外脂質(zhì)層中。在一些實施例中，酶452可用化學加合物(例如烷基加合物)修飾 以促進與雙層膜458的物理締合。圖4b顯示圖4a的潛在信號元件(酶452)如何可被活化以產(chǎn)生能被檢測到的信 號。在這個實施例中，脂質(zhì)體450的雙層膜458被破壞，從而讓酶452接觸酶底物454并將 其轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物456。酶底物454向產(chǎn)物456的轉(zhuǎn)化可導致產(chǎn)生能被檢測到的信號。能被檢 測到的信號可通過光學法檢測。光學檢測的非限制性例子包括比色測定法檢測、熒光測定 法檢測或發(fā)光測定法(例如生物發(fā)光或化學發(fā)光)檢測。能被檢測到的信號可以目測觀察， 或者可用諸如分光光度計、熒光計或發(fā)光計之類的儀器來檢測?；蛘?，該信號可通過混合物中阻抗或電導率的變化來檢測，或者通過混合物PH的變化來檢測。雙層膜458的滲透性可通過多種可導致形成脂質(zhì)體碎片451的手段來破壞。破壞 手段的非限制性例子包括聲振動、冷凍-解凍過程、加熱、化學(例如表面活性劑)破壞、滲 透破壞(例如滲透溶解(osmolysis))，或用成孔劑如溶細胞肽(下文描述)進行的透化處 理。破壞雙層膜458的滲透性可讓酶452移出脂質(zhì)體450、酶底物454移入脂質(zhì)體450或 者同時進行這兩方面。圖4b中還顯示接頭437，其將識別元件430連接到生物素結(jié)合分子 438。圖5a顯示使用潛在信號元件檢測靶標微生物的方法的另一個實施例。在這個實 施例中，將含有包含被分析物522(例如酵母聚糖)的靶標微生物520的樣品與標記有生物 素536的選擇性結(jié)合被分析物522的識別元件530 (例如包含來自Dectin-1的碳水化合物 識別結(jié)構(gòu)域的抗體或組合物)、生物素結(jié)合分子538和包含生物素536的脂質(zhì)體550混合。 生物素結(jié)合分子538可在識別元件530和脂質(zhì)體550之間形成橋。在這個實施例中，脂質(zhì) 體550充當潛在信號元件，因為脂質(zhì)體550、識別元件530和靶標微生物520本身之間的相 互作用不一定導致產(chǎn)生能被檢測到的信號。更確切地，在這個實施例中，一個另外的步驟 (在圖5b中顯示)可產(chǎn)生能被檢測到的信號。在這個實施例中，識別元件530還包含生物 素536。圖5a中還顯示了酶底物554。 脂質(zhì)體550包含酶552和能被生物素結(jié)合分子538選擇性結(jié)合的生物素536。脂質(zhì) 體550可從包含生物素536的磷脂構(gòu)造而成。例如，雙層膜558可如實例3中所述從N-生 物素酰-1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(Avanti Polar Lipids，美國亞拉巴馬州 Alabaster市)構(gòu)造而成，和/或從非生物素酰化的磷脂合成。酶552可(例如以含水懸浮 液的形式)存在于脂質(zhì)體550當中(如圖5a中所示)。或者，酶552可以與脂質(zhì)體550的 雙層膜558物理締合。在一些實施例中，酶552可用化學加合物(例如烷基加合物)修飾 以促進與雙層膜558的物理締合。圖5b顯示圖5a的潛在信號元件(酶552)如何可被活化以產(chǎn)生能被檢測到的信 號。在這個實施例中，脂質(zhì)體550的雙層膜558被破壞，從而讓酶552得以接觸酶底物554 并將其轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物556。酶底物554向產(chǎn)物556的轉(zhuǎn)化可導致產(chǎn)生能被檢測到的信號。能 被檢測到的信號可如上所述通過光學法檢測，或者該信號可通過混合物中阻抗或電導的變 化或通過混合物PH的變化來檢測。如上所述，雙層膜558的滲透性可通過多種可導致形成 脂質(zhì)體碎片551的手段來破壞。破壞雙層膜558的滲透性可讓酶552移出脂質(zhì)體550、酶底 物554移入脂質(zhì)體550或者同時進行這兩方面。圖6a顯示在夾心型測定中使用潛在信號元件檢測靶標微生物的方法的一個實施 例。在這個實施例中，捕獲劑630a (例如選擇性結(jié)合酵母聚糖的抗體)連接到載體材料615。 將含有被分析物622 (例如酵母聚糖)的樣品與標記有生物素636的識別元件630b (例如 選擇性結(jié)合酵母聚糖的抗體或受體)、生物素結(jié)合分子638 (例如抗生物素蛋白或鏈霉抗生 物素蛋白)、包含生物素636的脂質(zhì)體和捕獲劑630a(連接到載體材料615)接觸，以形成圖 6a中所示的復合物。或者，被分析物622可連接到靶標微生物或其片段(未顯示)。脂質(zhì) 體650還包含酶652。在這個實施例中，脂質(zhì)體650充當潛在信號元件，因為脂質(zhì)體650、識 別元件630a和630b和被分析物622本身之間的相互作用不一定導致產(chǎn)生能被檢測到的信 號。更確切地，在這個實施例中，一個另外的步驟(在圖6b中顯示)可讓酶652接觸酶底物654，從而產(chǎn)生能被檢測到的信號。脂質(zhì)體658包含酶652和能被生物素結(jié)合分子638選擇性結(jié)合的生物素636。脂質(zhì) 體658可從包含生物素636的磷脂構(gòu)造而成。例如，雙層膜658可如實例3中所述從N-生 物素酰-1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(Avanti Polar Lipids，美國亞拉巴馬州 Alabaster市)構(gòu)造而成。酶652可(例如以含水懸浮液的形式)存在于脂質(zhì)體650當中 (如圖5a中所示)?；蛘?，酶652可以與脂質(zhì)體650的雙層膜658物理締合。在一些實施 例中，酶652可用化學加合物(例如烷基加合物)修飾以促進與雙層膜658的物理締合。圖6b顯示圖6a的潛在信號元件(酶652)如何可被活化以產(chǎn)生能被檢測到的信 號。在這個實施例中，脂質(zhì)體650的雙層膜658被信號產(chǎn)生元件如成孔多肽(未顯示)破 壞，從而讓酶底物654通過孔657進入脂質(zhì)體而接觸酶652?；蛘撸|(zhì)體650可通過上述 的其他化學和/或機械手段破壞。表1中顯示可使脂質(zhì)體透化的示例性多肽的列表。多肽對脂質(zhì)體顆粒的裂解在 標題為“顆?！?(“PARTICLES”)的國際專利申請?zhí)朠CT/GB98/03071和標題為“受保護 肽”(“ARMED PEPTIDES”)的國際專利申請?zhí)朠CT/GB02/00033中有公開，這兩個專利申請 以引用方式全文并入本文。雙層膜658被透化后，酶652將酶底物654轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物656。如 上所述，酶底物654向產(chǎn)物656的轉(zhuǎn)化可導致產(chǎn)生能被檢測到的信號。破壞雙層膜658的 滲透性可讓酶652移出脂質(zhì)體650、酶底物654移入脂質(zhì)體650或者同時進行這兩方面。載 體材料615可如上所述進行構(gòu)造。表1.可破壞脂質(zhì)體滲透性的肽
權(quán)利要求
一種檢測靶標微生物或其成分的方法，包括提供選擇性結(jié)合酵母聚糖的識別元件；使所述識別元件與懷疑含有所述靶標微生物的樣品接觸；以及檢測所述靶標微生物。
2.一種檢測靶標微生物或其成分的方法，包括 提供選擇性結(jié)合酵母聚糖的識別元件；提供產(chǎn)生能被檢測到的信號的信號元件，其中所述信號元件包含連接部分； 使所述識別元件和所述信號元件與懷疑含有所述靶標微生物的樣品接觸；以及 檢測所述能被檢測到的信號。
3.—種檢測靶標微生物或其成分的方法，包括 提供選擇性結(jié)合酵母聚糖的識別元件；提供產(chǎn)生能被檢測到的信號的信號元件，其中所述識別元件連接到所述信號元件； 使所述識別元件和所述信號元件與懷疑含有所述靶標微生物的樣品接觸；以及 檢測所述能被檢測到的信號。
4.一種檢測靶標微生物或其成分的方法，包括提供包含脂質(zhì)雙層和產(chǎn)生能被檢測到的信號的信號元件的脂質(zhì)囊泡； 提供選擇性結(jié)合細胞壁成分的識別元件；使所述脂質(zhì)囊泡和所述識別元件與懷疑含有所述靶標微生物的樣品在有效引起所述 脂質(zhì)囊泡與如果存在的所述靶標微生物的結(jié)合的條件下接觸；以及 檢測所述能被檢測到的信號。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述脂質(zhì)雙層包含至少一種生物素分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或權(quán)利要求5所述的方法，其中所述識別元件包含至少一種生物素 分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項所述的方法，還包括提供生物素結(jié)合分子。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，還包括以下步驟i)在培養(yǎng)裝置中提供營 養(yǎng)培養(yǎng)基和ii)將所述樣品在容許至少一次細胞分裂的條件下進行溫育。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，還包括從培養(yǎng)裝置移出活微生物的步驟。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，還包括裂解所述樣品中的微生物的步驟。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，還包括i)提供捕獲劑和ii)捕獲所述靶 標微生物或其成分。
12.根據(jù)權(quán)利要求2-11中任一項所述的方法，其中所述信號元件包含脂質(zhì)囊泡、磁性 顆粒、聚合物顆?；蚪痤w粒。
13.根據(jù)權(quán)利要求2-11中任一項所述的方法，其中所述信號元件包含多肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求2-11中任一項所述的方法，其中所述信號元件包含多核苷酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求2-12中任一項所述的方法，其中所述信號元件包含轉(zhuǎn)化成能被檢測 到的信號的潛在信號成分。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，還包括以下步驟i)提供信號產(chǎn)生元件和ii)使所 述信號產(chǎn)生元件與所述信號元件接觸以將所述潛在信號成分轉(zhuǎn)化成能被檢測到的信號。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述信號產(chǎn)生元件是能活化的信號產(chǎn)生元件，且還包括活化所述能活化的信號產(chǎn)生元件的步驟。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述能活化的信號產(chǎn)生元件包含多肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述多肽包含能活化的結(jié)構(gòu)，所述能活化的結(jié) 構(gòu)當被活化時能增強所述多肽調(diào)節(jié)膜的滲透性的能力。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述能活化的結(jié)構(gòu)包含能水解的鍵。
21.根據(jù)權(quán)利要求18或權(quán)利要求19所述的方法，其中所述多肽通過pH變化來活化。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，還包括對所述樣品中的所述靶標微生物 進行計數(shù)的步驟。
23.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述能被檢測到的信號能通過光學 法檢測。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中光學法檢測包括比色測定法檢測、熒光測定法 檢測或發(fā)光測定法檢測。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或權(quán)利要求24所述的方法，其中光學法檢測包括用儀器進行檢測。
26.一種用于檢測靶標微生物的組合物，包含 選擇性結(jié)合酵母聚糖的識別元件；和包含產(chǎn)生能被檢測到的信號的顆粒的信號元件。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的信號元件，其中所述顆粒包含脂質(zhì)囊泡。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的信號元件，其中所述顆粒包含熒光分子。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的信號元件，其中所述顆粒包含磁性顆粒。
30.根據(jù)權(quán)利要求26所述的信號元件，其中所述顆粒包含聚合物顆粒。
31.根據(jù)權(quán)利要求26所述的信號元件，其中所述顆粒包含金顆粒。
32.根據(jù)權(quán)利要求26所述的信號元件，其中所述顆粒包含多肽。
33.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，還包含連接部分。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的組合物，其中所述識別元件與所述信號元件連接。
35.根據(jù)權(quán)利要求26-34中任一項所述的組合物，其中所述信號元件包含轉(zhuǎn)化為能被 檢測到的信號的潛在信號元件。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的信號元件，其中所述潛在信號元件包含酶底物。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的信號元件，其中所述信號元件包含多肽。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的多肽，其中所述多肽含有酶活性。
39.根據(jù)權(quán)利要求35所述的組合物，其還包含信號產(chǎn)生元件，其中所述信號產(chǎn)生元件 將潛在信號元件轉(zhuǎn)化為能被檢測到的信號。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述信號產(chǎn)生元件是能活化的。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的組合物，其中所述能活化的信號產(chǎn)生元件包含多肽。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的多肽，其中所述多肽包含能活化的結(jié)構(gòu)，所述能活化的結(jié) 構(gòu)當被活化時能增強所述多肽調(diào)節(jié)膜的滲透性的能力。
43.根據(jù)權(quán)利要求41或權(quán)利要求42所述的組合物，其中所述能活化的結(jié)構(gòu)包含能水解 的鍵。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的組合物，其中所述能水解的鍵是酯鍵或酰胺鍵。
45.根據(jù)權(quán)利要求41-44中任一項所述的組合物，其中所述信號產(chǎn)生元件通過pH變化 來活化。
46.根據(jù)權(quán)利要求26-45中任一項所述的組合物，還包含捕獲劑。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的組合物，其中所述捕獲劑連接到固相支撐物。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的組合物，其中所述固相支撐物選自塑料薄膜、塑料顆粒、金 屬薄膜、顆粒、膜、水凝膠、纖維素組合物、無紡織物、纖維、微通道。
49.根據(jù)權(quán)利要求46-48中任一項所述的組合物，其中所述捕獲劑或所述識別元件選 擇性結(jié)合酵母聚糖。
50.根據(jù)權(quán)利要求46-48中任一項所述的組合物，其中所述捕獲劑和所述識別元件選擇性結(jié)合酵母聚糖。
51.根據(jù)權(quán)利要求26-50中任一項所述的組合物，其中所述識別元件或所述捕獲劑包 含包括有酵母聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的組合物，其中所述多肽包含選擇性結(jié)合酵母聚糖的抗體或 其衍生的抗原結(jié)合片段。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的其抗原結(jié)合片段，其中所述其抗原結(jié)合片段選自Fab片段、 Fab'片段、F(ab)2片段、單鏈Fv和Fv片段。
54.根據(jù)權(quán)利要求51所述的多肽，其中所述多肽包含受體。
55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的受體，其中所述受體包含來自Dectin-1的碳水化合物識別 結(jié)構(gòu)域。
56.根據(jù)權(quán)利要求51所述的多肽，其中所述多肽結(jié)合酵母聚糖的能被Dectin-1的碳水 化合物識別結(jié)構(gòu)域識別的同一表位。
全文摘要
本發(fā)明描述了分析樣品中所關(guān)注的靶標微生物的方法。具體地講，這些方法可用于基于普遍性細胞壁成分如酵母聚糖的存在來檢測多種酵母和霉菌微生物。本發(fā)明還描述了用脂質(zhì)體和/或培養(yǎng)基分析樣品中的真菌微生物的方法。
文檔編號G01N33/53GK101981447SQ200980111736
公開日2011年2月23日 申請日期2009年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月14日
發(fā)明者史蒂芬·B·羅斯科, 斯特凡妮·J·莫勒, 曼基里·T·克希爾薩加爾 申請人:3M創(chuàng)新有限公司