專利名稱：一種魚(yú)類胚胎染色體制片方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到遺傳工程，特別是涉及到魚(yú)類胚胎染色體標(biāo)本的制作方法。
背景技術(shù)：
把生物工程的新技術(shù)用于魚(yú)類的遺傳育種和品種改良，是漁業(yè)上的一個(gè)發(fā)展方 向，特別是多倍體誘導(dǎo)等以染色體為操作對(duì)象的魚(yú)類細(xì)胞工程，已展示出廣闊的應(yīng)用前景。 目前，魚(yú)類胚胎期倍性檢測(cè)的方法主要有單胚胎制片法和混合胚胎制片法。單胚胎制片法 的優(yōu)點(diǎn)是可以準(zhǔn)確鑒定單個(gè)胚胎倍性，不足之處是操作精細(xì)、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，當(dāng)需要鑒定的胚胎 數(shù)量很多時(shí)，這種方法的應(yīng)用受到了限制，如計(jì)算誘導(dǎo)率時(shí)至少需30個(gè)以上的胚胎，傳統(tǒng) 的混合胚胎制片方法可以解決大規(guī)模制片的問(wèn)題，但取樣時(shí)需要將每個(gè)魚(yú)卵剝卵膜、去卵 黃，操作非常不便，比較費(fèi)時(shí)，而且取樣的囊胚期和原腸期是胚胎死亡的高峰期，由于取樣 時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致樣品大量死亡，它不僅影響制片結(jié)果的穩(wěn)定性，甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種快速穩(wěn)定的魚(yú)類胚胎染色體制片方法，它是一種簡(jiǎn)單、 快速、穩(wěn)定且能批量生產(chǎn)的魚(yú)類胚胎染色體標(biāo)本的制作方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是以如下的方式實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的操作方法是(1)取樣最佳取樣時(shí)間為魚(yú)類原腸中期至原腸晚期，過(guò)早或過(guò)遲都會(huì)影響制片 效果，取樣數(shù)量為取魚(yú)卵100-200粒，數(shù)量過(guò)多將不利于卵黃的清除，影響染色效果，所取 的魚(yú)卵都要發(fā)育良好，盡量剔除其中的壞卵，樣品取好后放入IOml燒杯中，用0. 75 %生理 鹽水清洗兩次，清洗時(shí)用大口吸管吹打，盡量除去表面污物；(2)細(xì)胞培養(yǎng)、收集；樣品清洗后，將生理鹽水倒掉，再加入3_5ml含10微克/毫 升秋水仙素的1640細(xì)胞培養(yǎng)液處理45-60分鐘，處理期間用鑷子每次可將多個(gè)魚(yú)卵一起夾 破，使胚胎細(xì)胞游離出來(lái)，魚(yú)卵全部夾破后用吸管吹打成懸液，再用吸管將胚胎細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 5ml的離心管中，轉(zhuǎn)管時(shí)用100目的篩絹網(wǎng)過(guò)濾，除去其中的卵膜和部分的卵黃物質(zhì)，然后 補(bǔ)加1640細(xì)胞培養(yǎng)液至5ml，處理過(guò)程中，每隔20分鐘用吸管吹打一次，處理結(jié)束后離心， 離心速度為700-1000rpm/min，時(shí)間為4_5分鐘；(3)低滲離心結(jié)束后，輕輕吸取上清液倒掉，僅留0. 3-0. 6ml細(xì)胞沉淀，然后再 將沉淀?yè)舸蚓鶆?，擊打方法為左手握緊心管，右手食指用力擊打離心管底部，利用離心管中 液體的回旋力將細(xì)胞沖散混勻，再加入4-5ml0. 0375mol/L氯化鉀低滲溶液并吸打均勻，靜 置20-30分鐘后低滲結(jié)束并加入0. 5-lml固定沉淀劑，其固定劑為甲醇與冰乙酸按體積比 3 1配制，再用吸管吹打均勻后離心，離心速度為lOOOrpm/min，時(shí)間為5分鐘；(4)固定先吸取離心管中的上清液倒掉后留下的0. 2-0. 5ml沉淀加入0. 1-0. 5ml 固定劑，將沉淀按照上述擊打方法擊打均勻，擊打時(shí)用力要適度，不可過(guò)大，以免細(xì)胞破裂， 再加2-3ml甲醇與冰乙酸按體積比3 1配制的固定劑，用吸管吹打均勻，靜置20分鐘后離心，其離心速度為lOOOrpm/min，時(shí)間為5-6分鐘，再吸取上清液倒掉后重復(fù)固定操作一 次；(5)滴片固定操作結(jié)束后，吸取上清液倒掉，將離心管中的0. l-o. 3ml沉淀按照 上述擊打方法擊打均勻，再加入重新按甲醇與冰乙酸按體積比3 1配制的固定劑至0.5ml 刻度處，吹打均勻，取冷凍玻片使之成40-45°角，吸取細(xì)胞懸液在冷凍玻片上滴2-3滴，并 輕輕吹動(dòng)，使細(xì)胞散開(kāi)，待其自然干燥；(6)染色Giemsa 染色。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、本發(fā)明在取樣方法上不需要?jiǎng)兟涯ぁ⑷ヂ腰S，操作簡(jiǎn)單高效，大大縮短了取樣時(shí) 間，保證了各個(gè)處理組的同步取樣和同步制片，克服了傳統(tǒng)方法費(fèi)力、費(fèi)時(shí)，不能批量制作 的缺點(diǎn)；2、本發(fā)明取樣時(shí)間縮短、胚胎細(xì)胞的存活率大大提高，保證制片結(jié)果的穩(wěn)定性和 誘導(dǎo)性的準(zhǔn)確性；3、本發(fā)明用1640細(xì)胞培養(yǎng)液取代生理鹽水進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，大大提高了胚胎細(xì)胞 細(xì)胞存活率，其細(xì)胞混勻方法用擊打取代吸管吹打，不僅快速簡(jiǎn)單，節(jié)省了時(shí)間，且細(xì)胞混 勻的效果更好。
具體實(shí)施例方式參看下述實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例用具和試劑5ml錐形刻度離心管，吸管，大口吸管，鑷子，冷凍玻片，10ml燒杯， RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液，魚(yú)用生理鹽水0. 75%氯化鈉溶液，秋水仙素溶液100微克/毫升， 低滲溶液0. 0375mol/L氯化鉀溶液，固定劑甲醇和冰醋酸按體積比3 1混勻，Giemsa染 色母液。其操作方法如下(1)取樣取黃顙魚(yú)魚(yú)卵100粒，放入10ml燒杯中，用0.75%魚(yú)用生理鹽水清洗兩 次，清洗時(shí)用大口吸管吹打，除去表面污物；(2)細(xì)胞培養(yǎng)和收集樣品清洗完畢后，將魚(yú)用生理鹽水倒掉，再加入4ml含10微 克/毫升秋水仙素的1640細(xì)胞培養(yǎng)液，處理60分鐘，處理期間用鑷子將多個(gè)魚(yú)卵一起夾 破，使胚胎細(xì)胞游離出來(lái)，魚(yú)卵全部然夾破后用大口吸管吹打成懸液，處理過(guò)程中，每隔20 分鐘用大口吸管吹打一次，處理結(jié)束后再用吸管將胚胎細(xì)胞轉(zhuǎn)移到5ml的離心管中，轉(zhuǎn)管 時(shí)用100目的篩絹網(wǎng)過(guò)濾，除去其中的卵膜和部分的卵黃物質(zhì)，然后在離心管中補(bǔ)加細(xì)胞 培養(yǎng)液至5ml后離心，離心速度為lOOOrpm/min，時(shí)間為5分鐘；(3)低滲離心結(jié)束后，輕輕吸取上清液倒掉，僅留0. 5ml細(xì)胞沉淀，將左手握緊離 心管，右手食指用力擊打離心管底部，使離心管中的細(xì)胞沖散混勻，再加入4ml0. 0375mol/L 氯化鉀低滲溶液，靜置25分鐘后低滲結(jié)束并加入0. 5ml固定劑，用吸管吸打均勻后離心，離 心速度為1000rpm/min，時(shí)間為5分鐘；(4)固定吸取離心管中上清液倒掉，加入0. lml固定劑后將離心管中的0. 2ml沉 淀按照上述擊打方法擊打均勻，擊打時(shí)用力要適度，不可過(guò)大，以免細(xì)胞破裂，再在離心管中加入3ml固定劑并吹打均勻，靜置20分鐘后離心，其離心速度為lOOOrpm/min，時(shí)間為6
分鐘，然后將固定重復(fù)操作一次；(5)滴片兩次固定操作結(jié)束后，再將離心管中的0. 15ml沉淀按照上述擊打方法擊打均勻后加入新配制的甲醇和冰醋酸按體積比3 1混勻的固定劑至0.5ml刻度處，并 吹打均勻，取冷凍玻片使之成45°角，吸取細(xì)胞懸液在冷凍玻片上滴2-3滴，并輕輕吹動(dòng)， 使細(xì)胞散開(kāi)，待其自然干燥；(6)染色用Giemsa母液染色。
權(quán)利要求
涉及遺傳工程的一種魚(yú)類胚胎染色體制片方法，其特征是(1)取樣取樣時(shí)間為魚(yú)類原腸中期至原腸晚期，取樣量為發(fā)育良好的魚(yú)卵100-200粒，放入10ml燒杯中，用0.75％的魚(yú)用生理鹽水清洗兩次，清洗時(shí)用大口吸管吹打，盡量除去表面污物；(2)細(xì)胞培養(yǎng)和收集樣品清洗完畢后，倒掉魚(yú)用生理鹽水，加入3-5ml含10μg/ml秋水仙素的1640細(xì)胞培養(yǎng)液處理45-60分鐘，處理期間用鑷子每次將多個(gè)魚(yú)卵夾破，使胚胎細(xì)胞游離出來(lái)，魚(yú)卵全部夾破后用吸管吹打成懸液，再用吸管將懸液轉(zhuǎn)移到5ml的離心管中，轉(zhuǎn)管時(shí)用100目的篩絹網(wǎng)過(guò)濾除去卵膜和卵黃，然后補(bǔ)加細(xì)胞培養(yǎng)液至5ml，處理期間，每20分鐘用吸管吹打一次，結(jié)束后離心，離心速度為700-1000rpm/min，時(shí)間為4-5分鐘；(3)低滲離心結(jié)束后，吸除上清液，僅留0.3-0.5ml細(xì)胞沉淀?yè)舸蚓鶆?，擊打方法為左手握緊離心管，右手食指用力擊打離心管底部將細(xì)胞沖散混勻，再加入4-5ml 0.0375mol/L氯化鉀低滲液，吸打均勻，靜置20-30分鐘后，加入0.5-1ml固定劑，其固定劑為甲醇與水乙酸按體積比3∶1配制，再用吸管吹打均勻后離心，離心速度為1000rpm/min，時(shí)間為5分鐘；(4)固定吸除上清液，加入0.1-0.5ml固定劑，將0.2-0.5ml沉淀按照上述擊打方法擊打均勻，再加2-3ml固定劑吹打均勻，靜置20分鐘后離心，離心速度為1000rpm/min，時(shí)間為6分鐘。重復(fù)固定操作一次；(5)滴片兩次固定操作結(jié)束后，吸除上清液，將0.1-0.3ml沉淀按照上述擊打方法擊打均勻，加入0.5-1ml重新按甲醇與水乙酸按體積比3∶1配制的固定劑吹打均勻，取冷凍玻片使之成40-45°角，吸取細(xì)胞懸液在冷凍玻片上滴2-3滴，并輕輕吹動(dòng)，使細(xì)胞鋪散開(kāi)，待其自然干燥；(6)染色Giemsa染色。
全文摘要
涉及到遺傳工程的一種魚(yú)類胚胎染色體制片方法，它是將原腸中期至原腸晚期的魚(yú)卵取出100-200粒后用魚(yú)用生理鹽水清洗兩次除去卵膜和卵黃后加入含有秋水仙素的1640培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，再用擊打的方法使細(xì)胞混勻，最后加入固定劑固定后讓其干燥直至用染色母液染色。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不能批量制作的缺陷，提高了制片結(jié)果的穩(wěn)定性和誘導(dǎo)率的準(zhǔn)確性，為魚(yú)類的遺傳育種和品種改良提供了可靠的保證。
文檔編號(hào)G01N1/02GK101825532SQ20091027352
公開(kāi)日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者吳勤超, 李忠, 梁宏偉, 羅相忠, 鄒桂偉 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所