專利名稱：：白前提取物的質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及白前提取物的質(zhì)量控制方法，更具體的是通過(guò)高效液相色譜對(duì)白前提取物質(zhì)量進(jìn)行控制的方法。
背景技術(shù)：
：植物性殺蟲、殺菌和除草劑的研究和利用，一直廣受世界各國(guó)的重視。我國(guó)是最早利用植物性生物制劑的國(guó)家，但應(yīng)用水平一直處于比較低級(jí)層次，主要是利用植物的初提物，而且應(yīng)用領(lǐng)域狹窄，面積不大，沒(méi)有形成規(guī)模，且大都沒(méi)有建立系統(tǒng)的制劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，使得產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，難以形成規(guī)模。因此，近幾十年來(lái)幾乎沒(méi)有推出成功的新產(chǎn)品。國(guó)外對(duì)植物性殺蟲劑的研究相對(duì)較多，比較成功的有除蟲菊素、印楝素等，印楝素類殺蟲劑的產(chǎn)值已經(jīng)超過(guò)數(shù)億美元，人工種植的印楝樹已經(jīng)遍及世界各地，印楝樹也被認(rèn)為是解決全球化學(xué)農(nóng)藥污染的希望之樹。另外，除蟲菊素等藥源植物也已經(jīng)在發(fā)達(dá)國(guó)家的有機(jī)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，其人工種植技術(shù)、活性成分提高技術(shù)等均在深入研究之中。目前，各國(guó)科學(xué)家均在尋找有效的植物資源，以期開發(fā)出更高效的植物源殺蟲殺菌除草劑。從我國(guó)現(xiàn)實(shí)情況來(lái)看，發(fā)展和選用藥源植物并從中提取植物性殺蟲劑是一條非常有效的途徑。一方面可以使廢棄甚至有害資源綜合利用，另一方面，又可為我國(guó)無(wú)害化農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)提供新的技術(shù)支持。白前提取物對(duì)鱗翅目害蟲具有很高的拒食活性，因此利用白前提取物開發(fā)生產(chǎn)的殺蟲劑具有綠色環(huán)保，低毒無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)，符合可持續(xù)發(fā)展的目標(biāo)。但是，目前還沒(méi)有建立起白前生物活性提取物的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，這在很大程度上限制了白前提取物作為殺蟲劑的應(yīng)用。因此，建立白前提取物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)白前類生物制劑進(jìn)行質(zhì)量控制，有利于提升我國(guó)藥源植物生物制劑的質(zhì)量控制技術(shù)，也可為今后在我國(guó)促進(jìn)一類新型植物性殺蟲制劑的開發(fā)應(yīng)用，提高植物性殺蟲或抗菌劑的殺滅效果提供新的技術(shù)支持。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供白前提取物的質(zhì)量控制方法。本發(fā)明所提供的白前提取物的質(zhì)量控制方法，包括下述步驟1)將白前提取物溶于乙腈和水的混合溶劑中，得到白前提取物溶液；2)采用高效液相色譜法分析所述白前提取物溶液，色譜條件為色譜柱為C18半制備柱，規(guī)格20mmX250mm;檢測(cè)波長(zhǎng)230nm±2.Onm;流動(dòng)相為乙腈-水，體積比為70-85:30-15;流速12-18ml/min;得到白前提取物的高效液相色譜；3)采用面積歸一化法計(jì)算各色譜峰的含量，將保留時(shí)間為4.0-7.5min的所有色譜峰的含量進(jìn)行加和，若含量大于等于23%，則視為合格，含量小于23%，則視為不合格。其中，步驟2)中所述流動(dòng)相優(yōu)選體積比為80:20的乙腈-水的混合溶劑；所述流速優(yōu)選為15ml/min。步驟1)所述混合溶劑中乙腈與水的積比具體可為70-85:30-15，優(yōu)選80:20。所述白前提取物溶液中白前提取物的濃度可為0.02-0.07g/ml，優(yōu)選0.05g/ml。在對(duì)白前提取物溶液進(jìn)行高效液相色譜分析前，還需對(duì)所述白前提取物溶液進(jìn)行過(guò)濾，以除去不溶物，得到澄清的綠色溶液。本發(fā)明中所述白前提取物可按照專利CN101156604"白前提取物及其制備方法與應(yīng)用"中的方法進(jìn)行制備，具體方法如下采用酸乙醇溶液作為提取溶劑，浸提白前植株，得到白前粗提物，然后將所述白前粗提物溶于O.5-0.6mol/L鹽酸水溶液中，用氯仿萃取，收集水層，加氨水調(diào)節(jié)pH值為9-10，再以氯仿萃取，回收氯仿層，除去氯仿，得到白前提取物；所述酸乙醇是由無(wú)機(jī)酸和乙醇組成的溶液。本發(fā)明根據(jù)白前提取物對(duì)鱗翅目害蟲具有很高的拒食活性、生物活性提取物在紫外下顯色、提取物的拒食活性與其中所含的活性成分的含量密切相關(guān)以及活性成分含量與其峰面積含量有關(guān)等特點(diǎn)，采用紫外掃描和高效液相色譜等技術(shù)，系統(tǒng)地建立了白前生物活性提取物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)白前類生物制劑進(jìn)行質(zhì)量控制。本發(fā)明系統(tǒng)地提出了白前活性成分提取物質(zhì)量控制方法，有利于提升我國(guó)藥源植物生物制劑的質(zhì)量控制技術(shù)，從而為今后在我國(guó)促進(jìn)一類新型植物性殺蟲制劑的開發(fā)應(yīng)用，提高植物性殺蟲或抗菌劑的殺滅效果提供新的技術(shù)支持，為此類中草藥植物的綜合開發(fā)利用提供新技術(shù)手段。圖1為檢測(cè)波長(zhǎng)依次為210nm、230nm、254nm、260nm、270nm和280nm的條件下，白前提取物溶液的高效液相色譜圖。圖2為230nm波長(zhǎng)條件下分析白前提取物溶液的高效液相色譜圖。圖3為白前提取物質(zhì)量控制流程圖。具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明提供的白前提取物的質(zhì)量控制方法加以說(shuō)明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中"乙腈_水"表示為乙腈和水的混合溶劑。實(shí)施例1、白前提取物的質(zhì)量檢測(cè)按照?qǐng)D3中的流程圖對(duì)白前提取物進(jìn)行質(zhì)量控制。1)分析樣品的制備a:白前提取物的制備用2L酸乙醇(其中，鹽酸的摩爾濃度為12mol/L，乙醇的摩爾濃度為17mo/L)浸提2kg白前植株6目干法72小時(shí)，浸提4次，將4次的浸提液混合，得到浸膏，將浸膏溶于0.5-0.6mol/L鹽酸水溶液中，用氯仿萃取，收集水層，加氨水調(diào)節(jié)pH值為9_10，再以氯仿萃取，回收氯仿層，除去氯仿，得到3.30白前粗提物，重復(fù)上述萃取步驟，得到l.16g精制的白前提取物。b、將lg精制的白前提取物溶于20ml乙腈_水(體積比80:20)中，得到濃度為0.05g/ml的綠色溶液，過(guò)濾除去不溶物，得到澄清的綠色溶液，4t:冷藏保存。2)檢測(cè)波長(zhǎng)的確定4高效液相色譜P3000型高壓輸液泵，UV2000型可變波長(zhǎng)紫外分光檢測(cè)器；色譜條件流動(dòng)相乙腈-水(體積比80:20)，流速15ml/min，進(jìn)樣量5-8ul，色譜柱C18半制備柱(20mmX250mm)(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)。按照上述色譜條件，分別選擇210nm，230nm，254nm，260nm，270nm和280nm的波長(zhǎng)，對(duì)白前提取物溶液進(jìn)行HPLC分析，得到色譜圖見圖1。根據(jù)分離情況(見圖1)，確定230nm±2.Onm為合適的檢測(cè)波長(zhǎng)。3)分離不同的組分采用高效液相色譜儀進(jìn)行分離制備，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm±2.Onm，其它色譜條件同2)，得到的色譜圖見圖2?；钚晕镔|(zhì)分7段收集提取物，得到7個(gè)組分，即組分1:1.0-4.Omin;組分2:4.0-7.5min;組分3:7.5-9.Omin;組分4:9.0-12.Omin;組分5:12.0-14.Omin;組分6:14.0-22.Omin;組分7:22.0-32.Omin。4)確定活性組分將分離得到的7個(gè)組分，進(jìn)行室內(nèi)生物活性測(cè)定。具體方法為采用傳統(tǒng)的葉碟法，將上述組分1-7均配成濃度為2070mg/ml的溶液，然后選取結(jié)凈的甘藍(lán)葉片，用打孔器打出葉碟，將葉碟分別在組分1-7的溶液中浸ls后取出，放在潔凈的臺(tái)面上自然晾干，然后將葉碟置于墊有保濕濾紙的9cm培養(yǎng)皿中；另設(shè)只浸泡無(wú)水乙醇的甘藍(lán)葉片為對(duì)照，每皿4片葉，放入三齡的斜紋夜蛾1頭。24h、48h后用葉面積測(cè)定儀分別測(cè)定剩余葉面積，據(jù)此計(jì)算取食葉面積和拒食率。選擇性拒食率=(對(duì)照組取食葉面積-處理組取食葉面積)+(處理組取食葉面積+對(duì)照組取食葉面積)。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果見表l，表1中的數(shù)據(jù)為三次重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果表明，組分2為高活性組分，判定組分2為質(zhì)量控制對(duì)象。表1高效液相色譜分離制備所得各組分的活性<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同字母者，表示經(jīng)LSD法于0.5X水平有顯著差異，大寫字母表示在1%水平不同組分之間有極顯著差異。5)測(cè)定活性組分色譜峰的含量及制定控制標(biāo)準(zhǔn)采用3)中的色譜條件，重復(fù)測(cè)試待測(cè)提取物15次，采用面積歸一化法計(jì)算各色譜峰的含量，將組分2(保留時(shí)間為4.0-7.5min)的所有色譜峰的含量進(jìn)行加和，結(jié)果見表2。組分2的峰含量<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>將上述15次的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算得到15次結(jié)果的平均值為25.17%，變異系數(shù)為O.08，。25.172%*0.92=23.158%，故制定標(biāo)準(zhǔn)大于等于23%的樣品視為合格。權(quán)利要求白前提取物的質(zhì)量控制方法，包括下述步驟1)將白前提取物溶于乙腈和水的混合溶劑中，得到白前提取物溶液；2)采用高效液相色譜法分析所述白前提取物溶液，色譜條件為色譜柱為C18半制備柱，規(guī)格20mm×250mm；檢測(cè)波長(zhǎng)230nm±2.0nm；流動(dòng)相為乙腈-水，體積比為70-85∶30-15；流速12-18ml/min；得到白前提取物的高效液相色譜；3)采用面積歸一化法計(jì)算各色譜峰的含量，將保留時(shí)間為4.0-7.5min的所有色譜峰的含量進(jìn)行加和，若含量大于等于23％，則視為合格，含量小于23％，則視為不合格。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟2)中所述流動(dòng)相為體積比為80:20的乙腈-水的混合溶劑；3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟2)中所述流動(dòng)相的流速為15m1/min。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于步驟1)所述混合溶劑中乙腈與水的體積比為70-85:30-15。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟1)所述混合溶劑中乙腈與水的體積比為80:20。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于步驟1)所述白前提取物溶液中白前提取物的濃度為0.02-0.07g/ml。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于步驟l)所述白前提取物溶液中白前提取物的濃度為0.05g/ml。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述白前提取物是按照下述方法提取得到的采用酸乙醇溶液作為提取溶劑，浸提白前植株，得到白前粗提物，然后將所述白前粗提物溶于0.5-0.6mol/L鹽酸水溶液中，用氯仿萃取，收集水層，加氨水調(diào)節(jié)pH值為9-10，再以氯仿萃取，回收氯仿層，除去氯仿，得到白前提取物；所述酸乙醇是由無(wú)機(jī)酸和乙醇組成的溶液。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括對(duì)步驟1)中得到的白前提取物溶液進(jìn)行過(guò)濾的步驟。全文摘要本發(fā)明公開了一種白前提取物的質(zhì)量控制方法。該方法包括下述步驟1)將白前提取物溶于乙腈和水的混合溶劑中，得到白前提取物溶液；2)采用高效液相色譜法分析所述白前提取物溶液，色譜條件為色譜柱為C18半制備柱，規(guī)格20mm×250mm；檢測(cè)波長(zhǎng)230nm±2.0nm；流動(dòng)相為乙腈-水，體積比為70-85∶30-15；流速12-18ml/min；得到白前提取物的高效液相色譜；3)采用面積歸一化法計(jì)算各色譜峰的含量，將保留時(shí)間為4.0-7.5min的所有色譜峰的含量進(jìn)行加和，若含量大于等于23％，則視為合格，含量小于23％，則視為不合格。本發(fā)明提出了白前活性成分提取物質(zhì)量控制方法，有利于提升我國(guó)藥源植物生物制劑的質(zhì)量控制技術(shù)，為此類中草藥植物的綜合開發(fā)利用提供新技術(shù)手段。文檔編號(hào)G01N30/36GK101696961SQ20091023551公開日2010年4月21日申請(qǐng)日期2009年9月29日優(yōu)先權(quán)日2009年9月29日發(fā)明者凌云,楊新玲,石旺鵬,郭艷艷申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);