專利名稱：：一種基于雙抗體識別的血清中MG7-Ag的定量檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及血清中MG7-Ag的檢測方法，特別涉及一種基于雙抗體識別的血清中MG7-Ag的定量檢測方法。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤是當前嚴重影響人類健康、威脅人類生命的主要疾病之一。惡性腫瘤的研究及應用方向已從以治療為主轉(zhuǎn)向防治結(jié)合。腫瘤的早期診斷尤為重要，它決定了腫瘤治療的成敗。胃癌是我國常見重大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均在繼續(xù)上升。目前用于胃癌早期篩查最可靠的途徑是內(nèi)窺鏡檢查結(jié)合活體組織病理檢查。但是，對于少數(shù)夾雜在正常組織細胞中的形態(tài)不典型胃癌細胞、分化差或未分化的胃癌細胞、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌腫瘤鑒別難度很大；而腫瘤標志物的檢查是一種很有效的方法。腫瘤標志物(Cancerbiomarker)的發(fā)現(xiàn)和應用是一個系統(tǒng)的方法，從高危人群的篩查、早期癌癥的檢出，到診斷及定位、機體對治療的反應及預后觀察，直至癌癥復發(fā)的檢測，腫瘤標志物發(fā)揮了重要的作用。目前臨床常用的胃癌的腫瘤標志物有CEA、CA19-9、CA72-4等，受CEA、CA19-9和CA72-4標志物特異性的限制，能夠檢測到以上標志物的絕大多數(shù)患者，其病情已進入中晚期。樊代明等人最新發(fā)現(xiàn)了一種胃癌特異性抗原MG7-Ag(LeeCH，LumJH，F(xiàn)anDMetal.Proteomics.2005;5(4):1160-1166)，并針對該抗原制備了鼠源性單克隆抗體MG7(FanDM，ZhangXY，ChenXTetal.JournalofGastroener-ologyandH印atology.2005;20(3):360-365)。在組織學研究中發(fā)現(xiàn)，MG7_Ag在胃癌中陽性率達90%以上，在正常胃粘膜中不表達。MG7-Ag表達量在萎縮性胃炎、異型增生及胃癌組織中呈漸進遞增，同時對MG7-Ag陽性的萎縮性胃炎及異型增生患者隨訪，其轉(zhuǎn)癌率顯著增高(LiuJ，Hu幾，F(xiàn)an匿etal.IntJClinPract.2002;56(3):169-172)。國家973項目(G1998051203)通過嚴格"雙盲"前瞻回顧性研究證實，胃粘膜上皮腸化生、異型增生呈MG7-Ag陽性表達者與陰性表達者相比較，病變進展危險性增加2540多倍，提示MG7-Ag與胃癌發(fā)生發(fā)展和分化有良好的相關(guān)性，對于檢測胃癌的高危個體有重要的應用價值。現(xiàn)有對于MG7-Ag的定量檢測主要是通過酶聯(lián)免疫(ELISA)方法，其中包括包被抗原、抗原抗體反應、二抗反應、顯色、讀板等步驟。由于血清中MG7-Ag屬于微量抗原，含量很小，酶聯(lián)免疫測定方法敏感度僅達ng水平，精度不高，容易出現(xiàn)誤差，無法實現(xiàn)準確定量。實時熒光定量PCR技術(shù)出現(xiàn)于1996年，該技術(shù)的核心是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累，實時監(jiān)測整個PCR進程，通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在PCR反應早期，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別；而后熒光的產(chǎn)生進入指數(shù)擴增期，熒光水平隨之呈指數(shù)增長；最后在PCR到達平臺期時熒光水平達到飽和，且由于PCR技術(shù)是指數(shù)擴大系統(tǒng)，微小誤差的指數(shù)放大使終產(chǎn)物量存在較大的離散度。而實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)PCR只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度。設定檢測點熒光值在指數(shù)擴增階段為熒光閾值，當熒光信號強度到3達所設定的熒光閾值時，自動記錄熒光信號達到熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct值)。已經(jīng)證實，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。因此利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線對未知樣本進行定量測定。由于PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期，此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到Ct值是恒定的?；谝陨蟽纱筇攸c，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。由于傳統(tǒng)定量方法都是PCR到達平臺期后進行檢測，而PCR經(jīng)過指數(shù)期擴增到達平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差，無法直接從終點產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性。但在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標，則PCR反應變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標。也正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標，但仍然只是一種半定量、粗略定量的方法。外標法定量和內(nèi)標法定量的方法學比較后的結(jié)論是內(nèi)標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方法。隨著實時熒光定量PCR技術(shù)的不斷推廣和普及，該技術(shù)已被廣泛應用于基礎科學研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等重要領(lǐng)域。主要集中在以下幾個方面1、DNA或RNA的絕對定量分析，包括病原微生物或病毒含量的檢測，轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi基因失活率的檢測等。2、基因表達差異分析，例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學處理等)，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA芯片或差異顯示結(jié)果的確證。3、基因分型，例如SNP檢測，甲基化檢測等。但是，實時熒光定量PCR技術(shù)僅限于核酸定量。申請?zhí)枮?00910021300.7的中國發(fā)明專利公開了一種血清中MG7-Ag抗原的檢測方法，該方法是基于抗原抗體反應捕捉血清中的MG7-Ag，然后再通過鏈親和素將生物素化DNA與生物素化二抗結(jié)合，將蛋白信號轉(zhuǎn)化成核酸信號，然后進行Real-timePCR擴增放大信號，通過實時熒光定量免疫PCR定量血清中胃癌相關(guān)抗原MG7Ag。但是，上述方法仍存在一定的缺陷，抗原抗體反應捕捉血清中的MG7-Ag時血清中大量的非特異性物質(zhì)會影響胃癌腫瘤相關(guān)抗原包被效率；在此基礎上經(jīng)過多次的信號轉(zhuǎn)換并最后經(jīng)PCR放大，每一環(huán)節(jié)都會直接影響方法的特異性和穩(wěn)定性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種基于雙抗體識別的血清中MG7-Ag的定量檢測方法，提高血清中的痕量的與胃癌相關(guān)的MG7-Ag定量檢測的特異性和準確性。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)1)包被用包被緩沖液將單克隆抗體MGb2濃度稀釋至10iig/ml，然后加入到realtime-PCR反應管中，每個反應管加入50iU，37。C孵育lh后用PBS-T液洗滌；2)封閉每個反應管加入5mg/mlBSA作為封閉液，37。C孵育lh后用PBS-T液洗滌；43)抗原抗體反應封閉完成后，相應的反應管中加入50ml的標準品或檢測樣品，4"C過夜，棄去液體，然后用PBS-T液洗滌；所述的標準品為梯度濃度稀釋的MG7-Ag標準品；所述的檢測樣品為待測血清；4)生物素化的MG7抗體結(jié)合抗原抗體反應完成后，每個反應管加入50ml生物素化的MG7抗體，37t:孵育lh后用PBS-T液洗滌；5)鏈親和素結(jié)合生物素化的MG7抗體結(jié)合完成后，每個反應管加入50ml的鏈親和素，37。C孵育30min，PBS-T液洗滌；6)生物素化的DNA報告分子結(jié)合鏈親和素結(jié)合完成后，每個反應管加入50ml的生物素化DNA，37t:孵育30min后用PBS-T液洗滌；7)實時熒光定量PCR反應以洗滌完成后每個反應管所得生物素化DNA為模板分別進行實時熒光定量PCR反應；PCR反應條件為94。C預變性5min，94。C變性45s，60。C退火30s，72。C延伸30s;3540個循環(huán)結(jié)束后于72t:延伸10分鐘；以PCR擴增生物素化DNA的延伸溫度72。C處讀取熒光檢測量，得到每孔對應的PCR擴增曲線；8)繪制標準曲線根據(jù)標準品管對應的一組PCR擴增曲線，設定熒光檢測閾值，得到該熒光檢測閾值處的對應標準品管的一組循環(huán)數(shù)；根據(jù)每個標準品管的標準品濃度和其達到熒光檢測閾值的循環(huán)數(shù)的對應關(guān)系，建立標準曲線；9)確定檢測樣品的循環(huán)數(shù)根據(jù)檢測樣品管對應的一組PCR擴增曲線，得到每孔檢測樣品達到熒光檢測閾值處的循環(huán)數(shù)；10)確定檢測樣品的MG7-Ag含量根據(jù)標準曲線，按照每孔檢測樣品的循環(huán)數(shù)確定其MG7-Ag含量。所述的生物素化DNA是生物素標記的非特異性序列DNA。所設定的熒光檢測閾值處于PCR擴增曲線的指數(shù)階段。所述標準品為純化的MG7-Ag。所述標準品為表面表達MG7-Ag的胃癌細胞的裂解液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益的技術(shù)效果1、本發(fā)明提供的基于雙抗體識別的血清中MG7-Ag的定量檢測方法，所述的雙抗體是采用雙抗體夾心法來特異性的捕捉MG7-Ag，雙抗體之一是在包被階段的MGb2單克隆抗體，之二是生物素化的MG7抗體；雙抗體識別的主要特點是對抗原的二重識別，提高抗原抗體反應的特異性，保證后續(xù)擴大信號的特異性和敏感性；本發(fā)明利用連接于固相載體(realtime-PCR反應管)上的MGb2抗體和生物素化的MG7抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體_抗原_酶標抗體免疫復合物；由于反應系統(tǒng)中固相抗體和酶標抗體的量相對于待測抗原是過量的，因此復合物的形成量與待測抗原的含量成正比，即可確定待測抗原含量；在形成免疫復合物的基礎上通過鏈親和素與生物素化的DNA報告分子結(jié)合，將抗原含量信號轉(zhuǎn)化為可進入指數(shù)擴增的DNA原始拷貝數(shù)；再通過可精確檢測原始拷貝數(shù)的實時熒光定量PCR檢測，以標準品擴增的標準曲線作為參照，精確的測量血清中的MG7-Ag;因此，本發(fā)明的免疫反應的設計保證了抗原捕捉的特異性，巧妙的對抗原信號進行轉(zhuǎn)換保證了檢測的敏感性和特異性。2、本發(fā)明對于雙抗體的選擇是基于對MG7-Ag的特異性識別和抗體的純度的考慮，具體選擇包被MGb2單克隆抗體捕捉胃癌相關(guān)抗原，生物素化的MG7抗體遞呈MG7-Ag含量信號；與采用MG7與MG7-Ag構(gòu)成的抗原抗體免疫復合物作為遞呈MG7_Ag含量信號的基礎相比，本發(fā)明生物素化的MG7抗體遞呈抗原含量信號的基礎是MGb2單克隆抗體捕捉胃癌相關(guān)抗原，很大程度上排除掉了非特異性的物質(zhì)與MG7-Ag的競爭包被，以及MG7抗體與非特異性物質(zhì)可能存在的交叉免疫反應；由于目前臨床用于檢測腫瘤標志物的抗體尚沒有較好的胃癌特異性抗體；而申請人經(jīng)過多年實驗證實MGb2和MG7是兩株高特異性的胃癌相關(guān)抗體，由本發(fā)明實際檢測說明它們的配對組合保證了該實驗方法的高敏感性和高特異性；而且MGb2和MG7都是單克隆抗體，這樣能夠保證其質(zhì)量和純度，并且有利于MG7-Ag檢測的標準化；MGb2單克隆抗體具體參見(l)ZhangF，RenG，LuY，F(xiàn)anD.IdentificationofTRAK1(Traffickingprotein，kinesin-bindingl)asMGb2-Ag:anovelcancerbiomarker.CancerLett.200918;274(2):250-8.;(2)LiS，ZhangXY，ChenXT，F(xiàn)anDM，ZhanSY，ChenLJ，ShuYH，Zhang幾.SpecifictargetingofmitomycinCtotumorsbyanti_gastriccancermonoclonalantibody.ChinMedJ(Engl).1991;104(5):358-62;此外，本發(fā)明提供的檢測方法能夠精確檢測MG7-Ag，其具體操作的步驟的改進具有以下有益的效果3、由于本發(fā)明待檢測的抗原是血清中含量甚微的胃癌腫瘤相關(guān)抗原MG7-Ag，如果直接采用待測血清直接包被，實際上附著的包被成分大部分是非特異物質(zhì)，大量的非特異性物質(zhì)甚至會競爭掉微量胃癌相關(guān)抗原包被位點，從而影響了檢測方法的敏感性和特異性；而且血清標本中非特異成分的不同也直接影響樣本檢測結(jié)果，給實驗結(jié)果帶來了不確定性；與采用抗原(待測血清)直接包被的方法相比，本發(fā)明采用單克隆抗體MGb2直接包被realtime-PCR反應管，這樣胃癌相關(guān)抗原與附著的MGb2單抗會特異性的識別，經(jīng)洗滌之后排除掉非特異性物質(zhì)，避免了其與之后的生物素化的MG7非特異性結(jié)合而造成的抗原檢測量的誤差；另外，如果在進行realtime-PCR擴增前需要將抗原抗體免疫反應物轉(zhuǎn)入PCR管中進行后續(xù)檢測，此步驟受操作儀器及操作者的影響很大，會使檢測方法產(chǎn)生誤差，而PCR方法非常敏感，微小誤差將導致結(jié)果的很大差異；本發(fā)明直接將MGb2單抗包被在realtime-PCR管壁，使后續(xù)反應在管中依次完成，避免了人為誤差，大大提高了方法的穩(wěn)定性及可重復性。4、由蛋白分子信號轉(zhuǎn)化為DNA分子信號后進入PCR擴展途徑是采用realtime-PCR檢測當中非常重要的信號轉(zhuǎn)化步驟；與采用生物素化二抗作為結(jié)合MG7和鏈親和素的橋梁相比，由于生物素化二抗一般是多克隆抗體，其特異性和敏感性都遠不如單克隆抗體，盡管MG7單抗敏感性和特異性高，但由于二抗特異性及效價不高等原因，會降低整個實驗的敏感性和特異性；而采用生物素化MG7抗體與胃癌相關(guān)抗原結(jié)合，減少生物素化二抗結(jié)合步驟這一環(huán)節(jié)，克服了由于二抗性質(zhì)對本實驗結(jié)果產(chǎn)生的影響，同時也簡化了實驗操作步驟。5、基于雙抗體識別的血清中MG7-Ag的定量檢測方法不僅具有高特異性和高敏感性而且提高了實驗的穩(wěn)定性和重復性；由于捕捉抗原的抗體設計和操作步驟的簡化使得實際檢測當中多次檢查的穩(wěn)定性和重復性都得到了提高，能夠監(jiān)測MG7-Ag在胃癌術(shù)前、術(shù)后，癌前病變及查體人群中的表達量不同；檢測結(jié)果表明癌癥患者血清中的Mg7-Ag含量比正常人群平均值高出IO倍以上。6、與抗原直接包被的檢測方法相比，由于其需要直接包被待測血樣，因為待檢樣本不同，必須由使用單位自己完成；而本發(fā)明采用包被的單克隆抗體及封閉步驟可以由生產(chǎn)部門標準化完成，進一步提高了實驗方法的通用性和可重復性，不同單位檢測結(jié)果可比性更強；同時，減少了用戶操作步驟，可操作性更強，利于檢測方法的推廣使用。圖1是實時熒光定量免疫PCR反應流程示意圖；圖2是標準品的實時熒光PCR擴增曲線圖；圖3是根據(jù)標準品的濃度和擴增的Ct值繪制的標準曲線；圖4是待測品的實時熒光PCR擴增曲線圖。具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明做進一步詳細說明。本發(fā)明通過雙抗體對MG7-Ag的識別、捕捉，在抗原信號轉(zhuǎn)換的基礎上結(jié)合實時熒光定量免疫PCR檢測方法來實現(xiàn)精確定量檢測血清中痕量抗原MG7-Ag含量。將實時熒光定量PCR技術(shù)與特異性的抗原抗體反應系統(tǒng)相結(jié)合，建立實時熒光定量免疫PCR技術(shù)。此項技術(shù)通過雙抗體特異性的識別血清中MG7-Ag，然后用鏈親和素分別結(jié)合生物素化MG7和生物素化的DNA，將血清中的MG7-Ag含量的信號轉(zhuǎn)化為核酸信號后，進入實時熒光定量PCR擴展途徑，從而精確檢測血清中痕量抗原MG7-Ag，其反應流程如圖1所示。根據(jù)不同濃度的標準品與達到設定熒光檢測閾值的循環(huán)數(shù)(Ct值)的對應關(guān)系，建立標準曲線，然后根據(jù)待檢測樣品的Ct值，在標準曲線上確定待檢測樣品的MG7-Ag的含建立的定量檢測方法所需材料主要包括封閉液、MGb2單克隆抗體、生物素化的MG7抗體、鏈親和素、生物素標記DNA、realtime-PCR試劑盒。具體為包被緩沖液pH9.6、0.05M碳酸鹽緩沖液；封閉液5mg/ml牛血清白蛋白(BSA);稀釋液含lmg/mlBSA的0.15MPBS緩沖液;洗滌緩沖液含0.05%Tween-20的pH7.4、0.15M磷酸鹽緩沖液(PBS-T液);MGb2單克隆抗體為鼠源性單克隆抗體，公開文獻LiS，ZhangXY，ZhangSY，ChenXT，ChenLJ，ShuYH，Zhang幾，F(xiàn)anDM.PreparationofantigastriccancermonoclonalantibodyMGb2—mitomycinCconjugatewithimprovedantitumoractivity.BioconjugChem.1990;1(4):245-50;實驗室純化制備;MG7抗體為鼠源性單克隆抗體，公開文獻FanDM，ZhangXY，ChenXTetal.JournalofGastroe證ologyandH印atology.2005;20(3):360-365，實驗室純化制備；生物素化MG7抗體采用光敏生物素法標記MG7抗體，并用除鹽小柱純化，然后采用紫外分光光度計定量并計算標記抗體濃度；鏈親和素、realtime-PCR試劑盒，均商購可得。其中，本實施例采用的鏈親和素，商購于Thermo公司；realtime-PCR試劑盒，商購于TaKaRa公司；生物素標記DNA:所述DNA序列為非特異性序列，按照常規(guī)技術(shù)手段進行生物素標記。本實施例采用光敏生物素法標記DNA，并用乙醇沉淀法純化；采用紫外分光光度計定量并計算標記DNA摩爾數(shù)。所述標準品采用確定含量的MG7-Ag:比如濃度確定的純化的MG7_Ag;或者表面表達MG7-Ag的胃癌細胞的裂解液，如胃癌細胞SGC7901，MKN45，KAT0in細胞系等；或者其他含有MG7-Ag的組織、體液、細胞等制備的標準品。以純化的MG7-Ag作為標準品，定量檢測血清中痕量抗原MG7-Ag的濃度含量；以胃癌細胞SGC7901作為標準品，定量檢測血清中痕量抗原MG7-Ag的含量可以用胃癌細胞SGC7901的細胞數(shù)表示。實施例采用梯度濃度稀釋的純化的MG7-Ag的標準品時，其純化方法如下1)組織勻漿的制備新鮮胃癌組織在4t:水浴或冰浴中用生理鹽水洗去血跡及污物，去除包膜或結(jié)締組織，將洗凈的組織剪成0.30.5cm3小塊，加入適量生理鹽水，裝入搗碎機筒內(nèi)制成組織勻漿。組織勻漿經(jīng)3000r/min離心10min后，去除細胞及組織碎片，上清液存留待用?；蛘呒毎扑槭占赴┘毎闟GC7901或MKN45，細胞計數(shù)后，將細胞置液氮中10分鐘，然后取出在37t:融化，反復操作三次凍融細胞；去除細胞碎片，經(jīng)3000r/min離心10min后，上清液存留待用。2)MG7-Ag粗提飽和硫酸銨鹽析組織勻槳或細胞裂解上清液，使硫酸銨飽和度達50%，沉淀4。C過夜，用pH7.2，0.15mol/LPBS透析三次，過DEAE凝膠柱粗提，對MG7-Ag進行初步純化。3)親和層析純化MG7-Ag:制備MG7親和層析柱，將MG7-Ag粗提物用pH7.2，0.15mol/LPBS透析過夜，上樣后經(jīng)pH7.2，0.15mol/LPBS平衡的MG7親和層析柱，流速0.5ml/分鐘；然后用0.15mol/LPBS流洗至洗脫液0D280《0.02，再用pH2.4、0.lmol/L甘氨酸-HCl洗脫，洗脫液立即轉(zhuǎn)至pH7.2，0.15mol/LPBS中透析過夜即得，并測定其蛋白濃度、純度和活性。實施例以腫瘤細胞裂解物作為標準品，定量檢測的待測血清中的MG7-Ag含量，具體包括以下步驟1)包被用包被緩沖液將單克隆抗體MGb2濃度稀釋至10iig/ml，然后加入8realtime-PCR反應管中，每管加入50iU，37。C孵育lh，PBS-T液洗滌；2)封閉每管加入5mg/mlBSA作為封閉液，37。C孵育lh，PBS-T液洗滌；3)抗原抗體反應封閉完成后，標準品反應管中加入50ii1的標準品，作為檢測待測血清的標準對照，具體以胃癌細胞MKN45裂解物作為標準品將MKN45細胞計數(shù)后將細胞破碎制備細胞裂解物，然后以5X106、5X105、5X104、5X103、5X102、5X101、5、0的梯度濃度稀釋，各個濃度對應不同標號的反應管加入50yl細胞裂解物，作為標準品對照；待測血清分別加入不同標號的待測血清反應管中，每管50iU;檢測樣品為制備的待測血清抽取2ml血液，室溫靜置30分鐘，3000rpm離心20分鐘，吸取上清置4。C待用；每管加入50i！1制備的待測血清；反應管中加入標準品或者待測血清后fC過夜，棄去液體，PBS-T液洗滌；4)生物素化的MG7抗體結(jié)合抗原抗體反應完成后，每管均加入50y1生物素化的MG7抗體，37。C孵育lh，PBS-T液洗滌;5)鏈親和素結(jié)合生物素化的MG7抗體結(jié)合完成后，每個realtime-PCR反應管均加入50ii1的鏈親和素，37。C孵育30min，PBS-T液洗滌;6)生物素化的DNA報告分子結(jié)合每個realtime-PCR反應管均加入50ii1的生物素化DNA，37。C孵育30min，PBS-T液洗滌；具體為以R0B01基因(NM_002941)的cDNA作為DNA報告分子，對其進行生物素化后加入到realtime-PCR反應管中；其進行PCR擴增得到248bp大小的片段，擴增的引物對為正向弓l物P:gctctagagcatccctgtcttaactg26;反向弓l物R:gctctagagcaaacgcttctcaacat26;7)實時熒光定量PCR反應以所得生物素化DNA為模板分別進行實時熒光定量PCR反應，其中PCR反應條件為94t:預變性5min，94t:變性45s，6(TC退火30s，72。C延伸30s;38個循環(huán)結(jié)束后于72t:延伸10分鐘，以PCR擴增生物素化DNA的延伸溫度72。C處讀取熒光檢測量，得到每孔對應的PCR擴增曲線。8)繪制標準曲線根據(jù)標準品對應的一組PCR擴增曲線，設定熒光檢測閾值，得到該熒光檢測閾值處的對應標準品的一組循環(huán)數(shù)；根據(jù)每個標準品管的標準品濃度和其達到熒光檢測閾值的循環(huán)數(shù)的對應關(guān)系，建立標準曲線；9)確定檢測樣品的循環(huán)數(shù)根據(jù)檢測樣品對應的一組PCR擴增曲線，得到每孔檢測樣品達到所述熒光檢測閾值處的循環(huán)數(shù)；10)確定檢測樣品的MG7-Ag含量根據(jù)標準曲線，按照每孔檢測樣品的循環(huán)數(shù)確定其MG7-Ag含量。按照上述步驟8)、9)、10)，本實施例得到如圖2所示的標準品組擴增曲線熒光檢測閾值設定，使得其對應的擴增曲線處于指數(shù)擴增階段；本實施例具體設定的熒光檢測閾值為0.020;圖3為根據(jù)標準品的檢測結(jié)果繪制的標準曲線，標準品的檢測數(shù)值如表1所示；如圖4所示的檢測樣品組的擴增曲線；根據(jù)標準曲線得到檢測樣品組的檢測值如表2所示。從標準品組擴增曲線得到不同濃度的標準品達到設定熒光檢測閾值的循環(huán)數(shù)(Ct值)；標準品的MG7-Ag的濃度的對數(shù)值與Ct值成線性關(guān)系，如圖3所示的標準曲線，橫坐標是Ct值、縱坐標是抗原MG7-Ag的濃度含量的對數(shù)值。從檢測樣品的一組擴增曲線得到不同濃度的檢測樣品達到設定熒光檢測閾值的循環(huán)數(shù)(Ct值)；根據(jù)標準曲線，按照待檢測樣品所得Ct值確定待測樣品的MG7-Ag的濃度含量。表1MG7-Ag標準品組的實時熒光PCR檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其中，MG7-Ag標準品是以腫瘤細胞計數(shù)后的裂解液來表示。根據(jù)標準曲線，結(jié)合其Ct值得到待測血清的抗原含量如表2所示表2癌癥確診組和健康人群組的血清中MG7-Ag實時熒光PCR檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>其中，MG7-Ag的結(jié)果表示為與待測血清中包含的MG7-Ag含量相當?shù)奈赴㎝KN45細胞數(shù)；A、B組為癌癥確診組，F(xiàn)、G組為健康人群組，以檢測所得的MG7-Ag含量可以很明顯的區(qū)分出癌癥確診組和健康人群，癌癥患者血清中的Mg7-Ag含量比正常人群平均值高出IO倍以上；本發(fā)明作為微量抗原MG7-Ag的定量檢測是具有敏感性和特異性的；而且比較A、B組的MG7-Ag檢測結(jié)果，還可以看出本發(fā)明的檢測方法得到血清中MG7的結(jié)果跟蹤到了與胃癌的分期、分級有關(guān)相關(guān)的抗原含量的變化在低分化伴轉(zhuǎn)移的癌癥患者血清中MG7Ag含量很高，高分化癌、未見轉(zhuǎn)移的患者血清中MG7Ag含量稍低，但也高出正常；部分癌前期病變患者檢測值較高的需要隨訪觀察；表明該方法檢測MG7Ag含量具臨床診斷所要求的精確性，可用于胃癌的診斷與高危人群的篩查，而且檢測結(jié)果經(jīng)過申請人的多次檢測顯示具有穩(wěn)定性及可重復性。權(quán)利要求一種基于雙抗體識別的血清中MG7-Ag的定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟1)包被用包被緩沖液將單克隆抗體MGb2濃度稀釋至10μg/ml，然后加入到realtime-PCR反應管中，每個反應管加入50μl，37℃孵育1h后用PBS-T液洗滌；2)封閉每個反應管加入5mg/mlBSA作為封閉液，37℃孵育1h后用PBS-T液洗滌；3)抗原抗體反應封閉完成后，相應的反應管中加入50μl的標準品或檢測樣品，4℃過夜，棄去液體，然后用PBS-T液洗滌；所述的標準品為梯度濃度稀釋的MG7-Ag標準品；所述的檢測樣品為待測血清；4)生物素化的MG7抗體結(jié)合抗原抗體反應完成后，每個反應管加入50μl生物素化的MG7抗體，37℃孵育1h后用PBS-T液洗滌；5)鏈親和素結(jié)合生物素化的MG7抗體結(jié)合完成后，每個反應管加入50μl的鏈親和素，37℃孵育30min，PBS-T液洗滌；6)生物素化的DNA報告分子結(jié)合鏈親和素結(jié)合完成后，每個反應管加入50μl的生物素化DNA，37℃孵育30min后用PBS-T液洗滌；7)實時熒光定量PCR反應以洗滌完成后每個反應管所得生物素化DNA為模板分別進行實時熒光定量PCR反應；PCR反應條件為94℃預變性5min，94℃變性45s，60℃退火30s，72℃延伸30s；35～40個循環(huán)結(jié)束后于72℃延伸10分鐘；以PCR擴增生物素化DNA的延伸溫度72℃處讀取熒光檢測量，得到每孔對應的PCR擴增曲線；8)繪制標準曲線根據(jù)標準品管對應的一組PCR擴增曲線，設定熒光檢測閾值，得到該熒光檢測閾值處的對應標準品管的一組循環(huán)數(shù)；根據(jù)每個標準品管的標準品濃度和其達到熒光檢測閾值的循環(huán)數(shù)的對應關(guān)系，建立標準曲線；9)確定檢測樣品的循環(huán)數(shù)根據(jù)檢測樣品管對應的一組PCR擴增曲線，得到每孔檢測樣品達到熒光檢測閾值處的循環(huán)數(shù)；10)確定檢測樣品的MG7-Ag含量根據(jù)標準曲線，按照每孔檢測樣品的循環(huán)數(shù)確定其MG7-Ag含量。2.如權(quán)利要求1所述的一種基于雙抗體識別的血清中MG7-Ag的定量檢測方法，其特征在于，所述的生物素化DNA是生物素標記的非特異性序列DNA。3.如權(quán)利要求1所述的一種基于雙抗體識別的血清中MG7-Ag的定量檢測方法，其特征在于，所設定的熒光檢測閾值處于PCR擴增曲線的指數(shù)階段。4.如權(quán)利要求1所述的一種基于雙抗體識別的血清中MG7-Ag的定量檢測方法，其特征在于，所述標準品為純化的MG7-Ag。5.如權(quán)利要求1所述的一種基于雙抗體識別的血清中MG7-Ag的定量檢測方法，其特征在于，所述標準品為表面表達MG7-Ag的胃癌細胞的懸浮液。全文摘要本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及血清中MG7-Ag的檢測方法，通過雙抗體對MG7-Ag的識別、捕捉，在抗原信號轉(zhuǎn)換的基礎上結(jié)合實時熒光定量免疫PCR檢測方法來實現(xiàn)精確定量檢測血清中痕量抗原MG7-Ag含量。將實時熒光定量PCR技術(shù)與特異性的抗原抗體反應系統(tǒng)相結(jié)合，建立實時熒光定量免疫PCR技術(shù)。此項技術(shù)通過雙抗體特異性的識別血清中MG7-Ag，然后用鏈親和素分別結(jié)合生物素化MG7和生物素化的DNA，將血清中的MG7-Ag含量的信號轉(zhuǎn)化為核酸信號后，進入實時熒光定量PCR擴展途徑，從而精確檢測血清中痕量抗原MG7-Ag。文檔編號G01N33/577GK101726601SQ20091021945公開日2010年6月9日申請日期2009年12月11日優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日發(fā)明者喬泰東,吳開春,李泉江,樊代明,聶勇戰(zhàn),陳崢申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學