專利名稱：奶牛乳汁孕酮檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種奶牛乳汁孕酮檢測試劑盒，用于檢測奶牛乳汁孕酮水平。
背景技術(shù)：
目前我國奶牛的飼養(yǎng)規(guī)模不斷的擴(kuò)大，現(xiàn)在已經(jīng)成為畜牧業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)，為了縮 短奶牛的產(chǎn)犢間隔提高奶牛的利用率，能使奶牛多產(chǎn)奶和多繁殖犢牛，要經(jīng)常對(duì)產(chǎn)犢后空 懷泌乳母牛進(jìn)行卵巢孕酮檢查，目前在養(yǎng)殖現(xiàn)場進(jìn)行卵巢孕酮檢查常用的有直腸檢查與采 血檢查這兩種方法，直腸檢查法對(duì)牛的直腸粘膜卵巢等易造成機(jī)械性刺激易引起粘膜損傷 和造成出血對(duì)奶牛卵巢造成損傷，需要檢查人員直檢水平較高，但檢查結(jié)果也不很準(zhǔn)確；采 血檢查法須將奶牛保定易造成應(yīng)激有礙奶牛健康，奶牛乳汁孕酮的變化與血漿孕酮的含量 同步。所以，根據(jù)乳汁中孕酮含量可以描述出母牛生殖過程所發(fā)生的生理變化，包括黃體 的形成及其分泌活動(dòng)的連續(xù)或結(jié)束等生理狀態(tài)。因此，根據(jù)乳汁中孕酮含量的變化可檢查 母牛的發(fā)情、妊娠診斷、產(chǎn)后卵巢機(jī)能活動(dòng)、以及一些繁殖疾病的診斷及其治療效果的監(jiān)測 等。乳汁中孕酮含量的測定，取樣方便，不損害家畜健康，不影響生產(chǎn)，比血漿孕酮的測定更 具有實(shí)用性。因此，采取奶牛乳汁孕酮檢查法是奶牛機(jī)體孕酮含量測定的有效途徑，尋求一 種奶牛乳汁孕酮試劑盒成為廣大奶牛養(yǎng)殖場、戶和獸醫(yī)的祈盼。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有的技術(shù)不足，提供一種取樣方便，不損害家畜健康， 不影響生產(chǎn)，比血漿孕酮的測定更具有實(shí)用性的乳汁孕酮檢測試劑盒。( 二 )技術(shù)方案為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明在于提供一種試劑盒，系板式直接競爭ELISA法。本發(fā)明的目的可通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明是通過抗原-抗體特異性反 應(yīng)，將抗體、抗原或酶標(biāo)抗原固定于固相酶標(biāo)板上。以酶免疫技術(shù)為基礎(chǔ)，建立直接競爭 ELISA法定量檢測奶牛乳汁孕酮，可供奶牛早期妊娠診斷、發(fā)情鑒定以及相關(guān)疾病的診斷的 確診使用，可以通過連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測孕酮判斷奶牛機(jī)體的生殖狀態(tài)。在上述技術(shù)方案基礎(chǔ)上，采用抗孕酮單克隆抗體固相于酶標(biāo)板，辣根過氧化物酶 標(biāo)記孕酮抗原，建立直接競爭ELISA法。本發(fā)明中，抗孕酮單克隆抗體直接固相于酶標(biāo)板，單克隆抗體經(jīng)O.Olmmol/LPBS 稀釋后，置于4°C過夜包被酶標(biāo)板，后用酪蛋白封閉，再經(jīng)過30°C干燥箱處理2h，置于 4°C保存。應(yīng)用該方法制備的酶標(biāo)板具有穩(wěn)定性好、操作及處理簡便等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)抗孕酮單 克隆抗體的特異性強(qiáng)，降低陰性成本底，提高了試劑盒的靈敏度，應(yīng)用于孕酮的檢測，能夠 達(dá)到檢測乳汁中孕酮含量的要求。辣根過氧化物酶標(biāo)記孕酮抗原的制備，采用常用的碳化二亞胺法。標(biāo)記結(jié)合物分別加30-40%的甘油，-20°C可保存數(shù)年。(三)有益效果本發(fā)明優(yōu)越性在于板式直接競爭ELISA定量檢測奶牛乳汁孕酮的方法具有簡 便、快速、低陰性本底和低成本。方法學(xué)考核表明本發(fā)明方法的最低檢測限可達(dá)0. 14ng/mL, 批內(nèi)平均差異4. 11%，批間平均差異6. 26%。用本發(fā)明方法對(duì)配種奶牛19-23天乳汁孕酮 檢測，確定妊娠與未妊娠的診斷準(zhǔn)確率為93. 3%和95. 8%。說明本方法對(duì)檢測奶牛乳汁孕 酮來改善奶牛繁殖具有重要的商業(yè)開發(fā)價(jià)值。


圖1是發(fā)明創(chuàng)建的板式直接競爭ELISA法定量檢測奶牛乳汁孕酮的操作流程圖。圖2是本發(fā)明板式直接競爭ELISA法定量檢測奶牛乳汁孕酮的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明所述奶牛乳汁孕酮檢測試劑盒的具體實(shí)施 方式，但不用來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例一通過抗原-抗體反應(yīng)，將抗體、抗原或酶標(biāo)抗原固定于固相酶標(biāo)板上，建立板式直 接競爭ELISA法。其中所述的固相直接競爭ELISA法是用抗孕酮單克隆抗體包被酶標(biāo)板， 辣根過氧化物酶標(biāo)記孕酮抗原。抗孕酮單克隆抗體固相酶標(biāo)板的制備抗孕酮單克隆抗體經(jīng)0. Olmmol/ LPBSpH7. 2稀釋后，IOOul/孔加入酶標(biāo)板，置于4°C過夜，后用酪蛋白(用0. Olmmol/ LPBSpH7. 2稀釋)封閉，再經(jīng)過30°C干燥箱處理2h，避光、真空包裝置于4°C保存，備用。酶標(biāo)記孕酮抗原的制備采用碳化二亞胺法，具體步驟如下(1)稱取11 α-羥孕 酮半琥珀酸酯(11 α -OH-P4-HS) 2. 6mg, N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 0. 9mg和二環(huán)己基羰二亞 胺(DCC) 1. 3mg置5mL三角燒杯中，滴加0. 15mL二甲基甲酰胺(DMF)，混勻后于4°C過夜；⑵ 次日可發(fā)現(xiàn)有尿素衍生物結(jié)晶析出，說明已有孕酮衍生物的N-羥基琥珀酰亞胺活化酯形 成；(3)取辣根過氧化物酶(HRP) 2mg，用2mL0. IMNaHCO3液溶解，室溫?cái)嚢柘录踊罨?uL， 以后每10秒2uL，共加10uL。室溫下繼續(xù)攪拌8h，然后應(yīng)用0. 04MpH7. 2的PBSlOOOmL攪拌 透析24h，期間換液三次。初步透析的偶聯(lián)物上S印hadexG-25柱(GE)，用PBS洗脫，流速為 1滴/6s。加入30-40%甘油-20°C保存。實(shí)施例二直接競爭ELISA法定量檢測奶牛乳汁孕酮方法。如圖1是本發(fā)明創(chuàng)建的板式直接競爭ELISA法定量檢測奶牛乳汁孕酮的操作流 程圖所示，抗孕酮單克隆抗體預(yù)包被酶標(biāo)板的每孔加入IOOul樣本、標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)抗原工 作液等比例混合的試劑，37°C反應(yīng)50min，洗滌。加四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物液，室溫避光 15min,加2mol/L硫酸終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上測450nm處的吸光值(0D值)。B0為零孕酮濃度 (Ong/mL)抑制時(shí)的 OD 值，B 為不同孕酮濃度(40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/ mL、l. 25ng/mL、0. 625ng/mL)抑制時(shí)的 OD 值，代入公式 Logit (B/BQ) = Ln [ (B/B0) / (1_B/ B。)]，以Lg[P]為橫坐標(biāo)，Logit (B/Bq)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用Microsoft Excel擬合曲線方程。將所得BZiBci值代入曲線方程求出乳汁樣品中的孕酮含量。最低檢測量選用8個(gè)不同濃度的孕酮乳樣標(biāo)準(zhǔn)品，且每個(gè)做4個(gè)水平重復(fù)，以孕 酮濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以各個(gè)濃度的B/X值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立曲線方程的同 時(shí)，計(jì)算無孕酮抑制的Btl值均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。以BtlISD的值再回歸曲線上所對(duì)應(yīng)的孕 酮濃度為試劑盒的最小檢出量。計(jì)算平均吸光值為1.241，標(biāo)準(zhǔn)差為0.0212。所以最低檢 測限是 0. 14ng/mL。精密度應(yīng)用同一批次組裝的孕酮乳汁檢測試劑盒，連續(xù)8天，每天檢測一個(gè)標(biāo)準(zhǔn) 品，并做三個(gè)水平重復(fù)，測出0D450nm值，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)；8個(gè)批次的孕酮乳汁試劑盒， 在同一時(shí)間檢測三個(gè)水平的孕酮標(biāo)準(zhǔn)品，并做三個(gè)水平重復(fù)，測定OD45tlnm值，計(jì)算批間變異 系數(shù)。結(jié)果平均批內(nèi)變異系數(shù)為4. 11%，平均批間變異系數(shù)為6. 26%。初步臨床應(yīng)用試驗(yàn)通過對(duì)發(fā)情和妊娠奶牛乳樣各5份的測定發(fā)情奶牛乳汁的 孕酮濃度均小于0. 5ng/mL ；妊娠母牛平均為4. 48ng/mL。奶牛妊娠乳汁孕酮臨界值的確定
ng/mL) 0.42，0.38, 0.15, 0.27，0.34 2.81, 3.86, 4.75, 4.62, 6.38 平均值0.314.48牛場采取奶牛配種后19 23天奶牛乳樣54份，按試劑盒操作檢測待測樣本，并 以2. 5ng/mL和0. 625ng/mL做為半定量區(qū)分妊娠與否。經(jīng)測定乳汁中孕酮含量判定30頭妊娠，24頭為未孕。經(jīng)配種后為期60天觀察，并 經(jīng)直腸檢查核對(duì)，未孕的診斷準(zhǔn)確率為95. 8% (23/24)，妊娠準(zhǔn)確率為93. 3% (28/30)。以上為本發(fā)明的最佳實(shí)施方式，依據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 能夠顯而易見地想到的一些雷同、代替方案，均應(yīng)落入本發(fā)明保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
奶牛乳汁孕酮檢測試劑盒，其特征在于通過抗原 抗體反應(yīng)，將抗體、抗原或酶標(biāo)抗原固定于固相酶標(biāo)板上，建立板式直接競爭ELISA法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的奶牛乳汁孕酮檢測試劑盒，其特征在于所述的板式抗孕酮 單克隆抗體包被酶標(biāo)板，辣根過氧化物酶標(biāo)記孕酮抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的奶牛乳汁孕酮檢測試劑盒，其特征在于用板式直接競 爭ELISA法定量檢測奶牛乳汁孕酮。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的奶牛乳汁孕酮檢測試劑盒，其特征在于制備方法是 板式之際競爭ELISA法的制備方法，第一，抗孕酮單克隆抗體固相酶標(biāo)板制備抗孕酮單 克隆抗體腹水采用辛酸-硫酸銨法和HiTrap Protein G HP層析柱純化，用0. Olmmol/ LPBSl 8000稀釋抗體包被酶標(biāo)板4°C過夜，并用酪蛋白封閉，后置于30°C干燥箱處 理，處理后置于4°C待用。第二，酶標(biāo)記孕酮抗原的制備(1)稱取Ila-羥孕酮半琥珀酸 酯2. 6mg, N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 0. 9mg和二環(huán)己基羰二亞胺(DCC) 1. 3mg置5mL三角燒 杯中，滴加0.15mL 二甲基甲酰胺(DMF)，混勻后于4°C過夜；(2)次日可發(fā)現(xiàn)有尿素衍生物 結(jié)晶析出，說明已有孕酮衍生物的N-羥基琥珀酰亞胺活化酯形成；(3)取辣根過氧化物酶 (HRP) 2mg,用2mL0. IMNaHCO3液溶解，室溫?cái)嚢柘录踊罨?uL，以后每10秒2uL，共加10uL。 室溫下繼續(xù)攪拌8h，然后應(yīng)用0. 04MpH7. 2的PBSlOOOmL攪拌透析24h，期間換液三次。初 步透析的偶聯(lián)物上S印hadexG-25柱(GE)，用PBS洗脫，流速為1滴/6s。加穩(wěn)定劑在_20°C 保存。第三，標(biāo)準(zhǔn)品的制備以5. Og活性炭和0. 5g葡聚糖(G25)溶于250mL不含BSA的測 定緩沖液，磁力攪拌器攪拌30min，成為用葡聚糖包被的活性炭(DCC)，棄上清取沉淀，加入 50mL奶牛乳樣，磁力攪拌器攪拌30min，置冰箱中過夜，2000rpm離心lh，取上清液同法再離 心一次，收集上清即為去激素率98%的脫激素乳。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的奶牛乳汁孕酮檢測試劑盒，其特征在于試劑盒的使用方法 (1)將試劑盒取出，將各種試劑恢復(fù)到室溫；(2)洗滌用洗滌液洗滌酶標(biāo)板，3min/次，洗2 次；(3)標(biāo)準(zhǔn)品配制用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品成8個(gè)濃度(40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、 5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/mL、0. 625ng/mL、0ng/mL) ； (4)加樣將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品和待測 乳樣各lOOuL，分別加入IOOuL酶標(biāo)孕酮工作液混勻后加入各孔，IOOuL/孔，并做重復(fù)孔。置 于37°C反應(yīng)50min ;(5)洗滌同2，洗3次；(6)顯色加入顯色劑(由顯色B液對(duì)顯色A液 100倍稀釋)100，室溫避光15min ； (7)終止加入終止液50uL/孔；(8)酶標(biāo)儀測定OD450nm 值。其中BO是無孕酮抑制時(shí)Ong/mL的OD值，B為各個(gè)孕酮濃度抑制時(shí)的40ng/mL、20ng/mL、 10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/mL、0. 625ng/mL OD值，代入公式 Logit (B/B。)= Ln [ (B/ B。)/(l-B/B。)]，以Lg[P]為橫坐標(biāo)，Logit (B/B0)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用Microsoft Excel擬合曲線方程。將所得B/X值代入曲線方程求出乳汁樣品中的孕酮含量。試劑盒的 最低檢測限為0. 14ng/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種奶牛乳汁孕酮檢測試劑盒，涉及生物技術(shù)，尤其是一種可用于酶標(biāo)記免疫檢測技術(shù)，建立了直接競爭ELISA法的定量酶免疫吸附試驗(yàn)，用于檢測奶牛乳汁中孕酮水平。應(yīng)用ELISA方法，通過抗原-抗體的特異性結(jié)合，將抗孕酮單克隆抗體、孕酮或酶標(biāo)孕酮復(fù)合物間接地固定于固相酶標(biāo)板上，建立了直接競爭ELISA法定量檢測奶牛乳汁中孕酮。用抗孕酮單克隆抗體包被酶標(biāo)板，辣根過氧化物酶標(biāo)記孕酮抗原。具有簡便、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，用于檢測奶牛乳汁孕酮有良好的開發(fā)使用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101923094SQ20091021743
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2009年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月28日
發(fā)明者劉騫, 夏成, 張洪友, 曾文淵, 高維明, 黃海波 申請(qǐng)人:張洪友