專利名稱：：一種檢測水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物工程
技術領域：
，涉及一種檢測水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術：
：環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)又稱環(huán)丙氟哌酸，是第三代氟喹諾酮類藥物。該藥殺菌能力強、抗菌譜廣曾被普遍的應用在水產(chǎn)動物的疾病治療中。然而人類長期食用含環(huán)丙沙星殘留的水產(chǎn)品會對健康造成損害，引發(fā)食源性疾病。目前，環(huán)丙沙星已經(jīng)被歐盟、中國等列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物。目前，環(huán)丙沙星的檢測方法主要包括微生物法、高效液相色譜法、毛細管電泳法等。這些檢測方法不僅需要以實驗室平臺為依托，還需要有專門的實驗人員進行操作。其中微生物法雖然要求不高，但是檢測的靈敏度達不到國家標準。高效液相色譜法、毛細管電泳法雖然靈敏度高，能夠進行大規(guī)模檢測，但是所花費的時間長、購買儀器的費用也非常的高一般在30萬元以上。酶聯(lián)免疫競爭法(ELISA)具有靈敏度高、操作簡單、成本低、檢測速度快等特點，因此利用酶聯(lián)免疫競爭法(ELISA)建立靈敏度高、操作簡單、能快速檢測水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星的試劑盒將有著十分廣泛的應用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、價格低廉、靈敏快速的用于檢測水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒包括包被有環(huán)丙沙星-雞卵血清白蛋白偶聯(lián)物(CIP-0VA)的酶標板、環(huán)丙沙星單克隆抗體、環(huán)丙沙星(CIP)標準品溶液、酶標二抗、底物顯色液、洗液、終止液。所述包被酶標板的包被原CIP-OVA，為環(huán)丙沙星與雞卵血清白蛋白偶聯(lián)物，制備過程如下(1)先將雞卵血清白蛋白水溶液、環(huán)丙沙星水溶液、1_乙基_(3-甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽水溶液以摩爾比為1:340:7043混合，在室溫下反應2小時；(2)將反應后的液體裝入透析袋內(nèi)，再放入1L磷酸緩沖液中透析48小時，每24小時換液一次；所述的磷酸緩沖液PH為5.0，濃度為0.01mol/L;所述的透析袋半周長為22mm，截留分子量為14000;(3)收集透析袋內(nèi)的液體，在_201:預冷凍2小時，然后在-S(TC下冷凍干燥，制成環(huán)丙沙星包被原白色固體粉末。其中所述包被有環(huán)丙沙星-雞卵血清白蛋白偶聯(lián)物的酶標板，是將環(huán)丙沙星-雞卵血清白蛋白偶聯(lián)物用包被緩沖液(pH9.6，0.lmol/L的碳酸鹽緩沖液)稀釋到一定濃度后，加入酶標板37°C，lh，再用PBST(0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液加入0.5%的吐溫20)洗滌，最后加入1%牛血清白蛋白溶液封閉過夜制得。其中所述的環(huán)丙沙星單克隆抗體是由雜交瘤細胞株JY-1(CCTCCNO.C200947)分泌獲得。所述的環(huán)丙沙星(CIP)標準品溶液的濃度為0.lng/mL、lng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL。所述的底物顯色液包括O.03%過氧化氫，1.5mg/mL的四甲基聯(lián)苯胺和pH5.3的醋酸鈉緩沖液。其中所述的洗液為含有0.5%吐溫20的磷酸緩沖液。其中所述的終止液為2mol/L的硫酸。所述的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星殘留的免疫學方法，其特征在于包括以下步驟(1)樣品前處理取均質(zhì)過的樣品，加入乙腈作為提取液，搗碎勻漿，振蕩離心后取上清液；往殘渣中加入提取溶劑乙腈，重復上述操作1次，合并上清液，取一定量的上清液做分析；(2)樣品檢測將處理過的樣品上清液和環(huán)丙沙星標準溶液分別加入酶標板，同時加入權利要求3所述的環(huán)丙沙星單克隆抗體標準溶液；溫育后洗滌拍干，加入酶標抗抗體；溫育后洗滌拍干，加入顯色液；溫育后加入終止液，用酶標儀測定吸光度值；(3)結果分析以標準溶液的抑制率B/B。為縱坐標，以不同濃度環(huán)丙沙星的對數(shù)值為橫坐標，繪制標準抑制曲線，根據(jù)標準曲線計算得出樣品中的環(huán)丙沙星濃度。本發(fā)明的又一目的是提供一種能夠用于檢測水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星殘留的免疫學方法，它包括以下步驟1、樣品前處理；2、樣品檢測；3、結果分析。(1)樣品前處理(鯽魚、艫魚、鮭魚、螃蟹、羅氏沼蟲下)取均質(zhì)過的樣品，加入乙腈作為提取液，高速組織搗碎機勻漿，充分振蕩離心后取上清液。往殘渣中加入提取溶劑，重復上述操作l次，合并上清液，取一定量的上清液做分析。(2)樣品檢測將處理過的樣品上清液和環(huán)丙沙星標準溶液分別加入酶標板，同時加入環(huán)丙沙星單克隆抗體標準溶液；溫育后洗滌拍干，加入酶標抗抗體；溫育后洗滌拍干，加入顯色液；溫育后加入終止液，用酶標儀測定吸光度值。(3)結果分析以標準溶液的抑制率B/B。為縱坐標(B是環(huán)丙沙星不同標準濃度的0D45。值，B。是環(huán)丙沙星濃度為0時的0D45。值)，以不同濃度環(huán)丙沙星的對數(shù)值為橫坐標，繪制標準抑制曲線，樣品中的環(huán)丙沙星濃度可以根據(jù)標準曲線計算得出。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(1)本發(fā)明的試劑盒靈敏度高，最低檢測限能夠達到1.02ng/mL，與以往試劑盒比較靈敏度提高i-io倍。(2)本發(fā)明的試劑盒特異性強，僅有恩諾沙星存在交叉反應，對其它氟喹諾酮類藥物不存在交叉反應。(3)本發(fā)明的試劑盒所使用的單克隆抗體能夠稀釋30000-200000倍使用，與以往試劑盒所使用單克隆抗體的稀釋倍數(shù)比較，提高了io倍以上，從而節(jié)約了成本。(4)本發(fā)明中的前處理方法，操作簡單易于實施。圖1為環(huán)丙沙星偶聯(lián)物紫外掃描圖。圖2為試劑盒標準抑制曲線。具體實施例方式(1)本發(fā)明所用試劑環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、培氟沙星，含量^98.5%，購自浙江國邦藥業(yè)有限公司；牛血清蛋白(BSA)、雞卵血清白蛋白(0VA)、酶標板、HRP羊抗鼠抗抗體、四甲基聯(lián)苯胺、吐溫20購于鼎國生物公司；乙基碳二亞胺(EDC)，純度^99.3X，購自上海延長生化科技發(fā)展有限公司；1640培養(yǎng)基(購自GIBCO公司)；胎牛血清(購自HYCLONE公司)；HAT(購自GIBCO公司)；小牛血清(購自HYCLONE公司)；二甲亞砜(購自SIGMA公司)，其它化學試劑購于上海國藥有限公司。(2)Balb/c小鼠，購自上海實驗動物中心；SP2/0骨髓瘤細胞，購自中科院細胞庫。實施例一免疫原——環(huán)丙沙星與牛血清白蛋白偶聯(lián)物(CIP-BSA)的制備1、稱取8.5g的氯化鈉、2.85g磷酸氫二鈉、0.2g氯化鉀，O.27g磷酸二氫鉀加入950mL的蒸餾水，滴加鹽酸調(diào)節(jié)pH(酸堿度)至5.0，再加入50mL的蒸餾水，配置成1000mL，濃度為0.Olmol/L的磷酸緩沖液。2、稱取40mg的牛血清白蛋白加入5mL的磷酸緩沖液(pH為5.0，含量為0.01mo1/L)制成8mg/mL(0.12iimol/L)的牛血清白蛋白水溶液。3、稱取100mg的環(huán)丙沙星加入5mL的磷酸緩沖液(pH為5.0，含量為0.Olmol/L)制成20mg/mL(60.4ymol/L)的環(huán)丙沙星水溶液。4、稱取960mg碳二亞胺加入4mL磷酸緩沖液(pH為5.0，含量為0.Olmol/L)制成240mg/mL(1251.9iimol/L)的水溶液。5、在1.5mL的離心管中分別加入8mg/mL(0.12ymol/L)的牛血清白蛋白水溶液、20mg/mL(60.4ymol/L)的環(huán)丙沙星水溶液、240mg/mL(1251.9ymol/L)的碳二亞胺水溶液各0.25mL，再加入0.25mL的磷酸緩沖液(pH為5.0，含量為0.Olmol/L)，在室溫下反應2小時。6、將反應好的液體加入透析袋(半周長22mm，截留分子量14000)中再放入裝有1L磷酸緩沖液(pH為5.0，含量為0.0lmo1/L)的燒杯中，透析48小時，每24小時換液一次。7、將透析好的液體，在_201:預冷凍2小時，然后在-S(TC下冷凍干燥，制成免疫原白色固體粉末。實施例二包被原——環(huán)丙沙星與雞卵血清白蛋白偶聯(lián)物(CIP-OVA)的制備1、稱取8.5g的氯化鈉、2.85g磷酸氫二鈉、0.2g氯化鉀，O.27g磷酸二氫鉀加入950mL的蒸餾水，滴加鹽酸調(diào)節(jié)pH(酸堿度)至5.0，再加入50mL的蒸餾水，配置成1000mL，濃度為0.Olmol/L的磷酸緩沖液。2、稱取40mg的雞卵血清白蛋白加入5mL的磷酸緩沖液(pH為5.0，含量為0.Olmol/L)制成8mg/mL(0.178iimol/L)的雞卵血清白蛋白水溶液。3、稱取lOOmg的環(huán)丙沙星加入5mL的磷酸緩沖液(pH為5.0，含量為0.Olmol/L)制成20mg/mL(60.4ymol/L)的環(huán)丙沙星水溶液。4、稱取960mg碳二亞胺加入4mL磷酸緩沖液(pH為5.O，含量為0.Olmol/L)制成240mg/mL(1251.9iimol/L)的水溶液。5、在1.5mL的離心管中分別加入8mg/mL(0.178ymol/L)的雞卵血清白蛋白水溶液、20mg/mL(60.4iimol/L)的環(huán)丙沙星水溶液、240mg/mL(1251.9ymol/L)的碳二亞胺水溶液各0.25mL，再加入0.25mL的磷酸緩沖液(pH為5.0，含量為0.Olmol/L)，在室溫下反應2小時。6、將反應好的液體加入透析袋(半周長22mm，截留分子量14000)中再放入裝有1L磷酸緩沖液(pH為5.0，含量為0.0lmo1/L)的燒杯中，透析48小時，每24小時換液一次。7、將透析好的液體，在-2(TC預冷凍2小時，然后在-5(TC下冷凍干燥，制成包被原白色固體粉末。實施例三環(huán)丙沙星單克隆抗體的制備—、免疫將環(huán)丙沙星-牛血清白蛋白粉末用磷酸緩沖液(pH為5.O，含量為0.01mol/L)稀釋成為2mg/mL免疫原溶液，取100yL免疫原溶液(2mg/mL)加入100yL福氏完全佐劑，充分混勻后，取4周齡的Balb/c小鼠，采用腹部注射，進行免疫。免疫兩周后，取100iiL免疫原溶液(2mg/mL)加入100yL福氏不完全佐劑，充分混勻后，采用腹部注射，進行免疫?！芎?，取100iiL免疫原溶液(2mg/mL)進行尾靜脈加強免疫。十天后，取50iiL免疫原溶液(2mg/mL)進行尾靜脈注射，進行加強免疫。二、細胞融合及篩選1、骨髓瘤細胞的復蘇及培養(yǎng)融合前10天，將冷凍的SP2/0骨髓瘤細胞從-70°〇冰箱中取出，立即放入37。C水浴融化，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，加入1640(含10%胎牛血清)培養(yǎng)液，置4.5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。處于對數(shù)生長期的瘤細胞渾圓，透亮，大小均一，排列整齊，呈半致密分布，取處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞供細胞融合用。2、融合(1)在Balb/c小鼠最后一次免疫的第三天，無菌取脾臟過100目網(wǎng)篩，用RPMI1640(-)吹下形成單細胞懸液，用于細胞融合。(2)Balb/c小鼠，無菌取出胸腺后，過100目網(wǎng)篩，用RPMI1640(-)吹下形成單細胞懸液。(3)將脾細胞懸液和胸腺細胞懸液分別離心3分鐘，1000轉(zhuǎn)/分鐘，棄去上清液，脾細胞沉淀用預熱到37t:的RPMI1640(-)重懸，胸腺細胞沉淀用少量預熱到37t:的含1%HAT的1640(含10%胎牛血清)選擇性細胞培養(yǎng)液重懸。(4)取3Xl(f個處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，去上清液后，沉淀用RPMI1640(-)重懸。(5)將脾細胞懸液與瘤細胞懸液混合均勻后，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，完全吸去上清液，輕彈離心管底，使兩種細胞沉淀充分混勻。(6)將離心管置于37t:水浴中預熱的盛水燒杯中，用吸管吸已經(jīng)預熱到37t:的聚乙二醇溶液lmL，將管尖插入管底，輕輕攪動細胞沉淀，并緩緩滴加聚乙二醇，在1分鐘內(nèi)加完。然后在37t:水浴中靜置5分鐘。(7)滴加已經(jīng)預熱到37。C的RPMI1640(-)液40mL，前緩后快，然后1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄去上清液。(8)將細胞沉淀用3mL預熱到37°C的1640(含10%胎牛血清)細胞培養(yǎng)液重懸，取2mL凍存于-70°C(9份1640(含10%胎牛血清)+1份二甲亞砜)，余細胞懸液里補加含有1%HAT的1640(含10%胎牛血清)選擇性細胞培養(yǎng)液和小鼠胸腺細胞40mL，混合均勻后每孔100iiL滴加到4個96孔板內(nèi)。培養(yǎng)于C02濃度為4.5%和37。C恒溫恒濕條件下的(A培養(yǎng)箱中。(9)細胞融合2周后，雜交瘤細胞群落長到占96孔培養(yǎng)板的孔底1/3時開始用間接酶聯(lián)免疫法檢測。選取陽性值大于陰性值2倍，且陽性值大于0.5以上的細胞孔進行克隆，采用有限稀釋法對檢測出的陽性雜交瘤細胞進行克隆，直到獲得穩(wěn)定分泌環(huán)丙沙星單克隆抗體的細胞株。選取其中一株細胞株命名為JY-1保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CCTCCNO.200947。三、單克隆抗體的產(chǎn)生與純化(原腹水制備)取7周的Balb/c小鼠，每只注射0.5mL的降植烷。一周后腹腔接種用無血清培養(yǎng)基稀釋處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞，每只注射細胞數(shù)為5X106個，間隔4天后，觀察小鼠腹水情況，待小鼠腹部膨大，精神變差，瀕臨死亡時，采集腹水。將腹水離心，取上清液，測定效價，分裝保存在_7(TC。用硫酸銨沉淀法進行純化，得到環(huán)丙沙星單克隆抗體。實施例四檢測水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒的組裝1、試劑盒試劑的配制(1)磷酸緩沖液(PBS)緩沖液稱取8.5g的氯化鈉、2.85g磷酸氫二鈉、0.2g氯化鉀，0.27g磷酸二氫鉀加入950mL的蒸餾水，滴加鹽酸調(diào)節(jié)pH(酸堿度)至7.4，再加入50mL的蒸餾水，配置成1000mL，濃度為0.Olmol/L的磷酸緩沖液。(2)抗原包被液(CBS)碳酸鹽緩沖液稱取1.59g的碳酸鈉，2.93g的磷酸氫鈉，加入蒸餾水950mL，調(diào)節(jié)pH(酸堿度)至9.6加蒸餾水至1000mL。4度保存。(3)封閉液稱取lg牛血清白蛋白，溶解于100mL的PBS中，混勻4"保存?zhèn)溆谩?4)洗滌液將0.5mL吐溫20加入1L的PBS中，混勻，室溫保存?zhèn)溆谩?5)顯色液①四甲基聯(lián)苯胺(TMB)貯存液稱150mg的TMB粉末，加入100mL的二甲基亞砜配成1.5mg/mL的TMB貯存液，一2(TC分裝保存。②醋酸鈉(NaAc)緩沖液稱取16.4g的醋酸鈉加入950mL的蒸餾水，用醋酸調(diào)節(jié)pH至5.3，加蒸餾水至1000mL。③0.03%雙氧水吸取lmL的30%的雙氧水加入1L的蒸餾水。④使用時顯色液配方TMB貯存液醋酸鈉緩沖液0.03%雙氧水的體積比為i:4:5。(6)終止液(2M硫酸)將100mL濃硫酸緩慢加入900mL蒸餾水中，室溫保存?zhèn)溆谩?、包被有環(huán)丙沙星-雞卵血清白蛋白偶聯(lián)物的酶標板的制備(1)將環(huán)丙沙星-雞卵血清白蛋白偶聯(lián)物用包被碳酸鹽緩沖液稀釋到100ng/mL。(2)將稀釋后的環(huán)丙沙星-雞卵血清白蛋白偶聯(lián)物加入酶標板(100iiL/孔)37t:孵育1小時后，倒去包被液并用洗滌液洗滌3次，每次3min，最后加入封閉液(200yL/孔)封閉過夜。(3)倒去封閉液并用洗液洗滌3次，每次3min，干燥后用鋁膜真空密封保存。3、組建的環(huán)丙沙星檢測試劑盒由下述部分組成(1)包被有環(huán)丙沙星-雞卵血清白蛋白偶聯(lián)物的酶標板；(2)環(huán)丙沙星單克隆抗體；(3)用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體；(4)環(huán)丙沙星標準品溶液5瓶，濃度分別為0.lng/mL、lng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL;(5)顯色A液0.03X過氧化氫，顯色B液1.5mg/mL的四甲基聯(lián)苯胺，顯色C液醋酸鈉緩沖液；(6)洗滌液；(7)終止液。實施例五樣品中環(huán)丙沙星殘留的檢測1、樣品前處理(鯽魚、艫魚、鮭魚、螃蟹、羅氏沼蟲下)取5g的樣品，加入30mL的乙腈作為提取液，高速組織搗碎機勻漿，充分振蕩15min，4500r/min離心15min，取上清液。往殘渣中加入提取溶劑30mL，重復上述操作1次，合并上清液，取50iiL做分析。2、用試劑盒檢測(1)取50iiL的樣品和50iiL的標準品溶液分別加入包被有環(huán)丙沙星_雞卵血清白蛋白偶聯(lián)物的酶標板中，然后加入環(huán)丙沙星單克隆抗體工作液50iiL，37t:孵育1小時。(2)倒出孔中液體，加入洗液(200iiL/孔)洗滌3次，每次3min，拍干。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體工作液(100yL/孔)，37t:孵育0.5小時。(3)倒出孔中液體，加入洗液(200iiL/孔)洗滌3次，每次3min，拍干。每孔加入顯色A液50iiL，顯色B液10iiL，顯色C液40iiL，37。C避光孵育10分鐘。(4)每孔加入50iiL終止液，用酶標儀在450nm處讀數(shù)(OD)。結果分析以標準溶液的抑制率B/B。為縱坐標(B是環(huán)丙沙星不同標準濃度的0D45。值，B。是環(huán)丙沙星濃度為0時的0D45。值)，以不同濃度環(huán)丙沙星的對數(shù)值為橫坐標，繪制標準抑制曲線。樣品中的環(huán)丙沙星濃度可以根據(jù)標準曲線計算得出。根據(jù)酶標板上的樣品顏色的深淺，與系列濃度的標準溶液顏色的比較可判斷樣品中環(huán)丙沙星的濃度范圍。實施例六特性鑒定為了驗證本發(fā)明的有效性，進行了以下測定?！?、免疫原、包被原的偶聯(lián)鑒定通過紫外分光光度法對免疫原(CIP-BSA)及包被原(CIP-OVA)進行鑒定。在250nm-350nm間對CIP、BSA、CIP-BSA、OVA、CIP-OVA進行紫外掃描。結果發(fā)現(xiàn)CIP的峰值在270nm，BSA的峰值在279nm，CIP-BSA的峰值出現(xiàn)在275nm，0VA的峰值出現(xiàn)在278nm，CIP-OVA的峰值出現(xiàn)在274nm，通過對比發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)物的峰值發(fā)生了遷移，從而證明了偶聯(lián)的成功。見圖l為環(huán)丙沙星偶聯(lián)物紫外掃描圖。二、試劑盒競爭抑制曲線測定將環(huán)丙沙星標準品(0.lng/mL、lng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL)和環(huán)丙沙星單克隆抗體工作液各50iiL加入酶標板，37°C，1小時，洗板三次。加入酶標二抗100iiL，37°C，0.5小時，洗板三次。加入顯色液，顯色10分鐘，酶標儀D頓nm讀數(shù)。結果見圖2，得到線性方程為y=-23.lx+80.3，R2=0.9811。通過計算得到的最低檢測限為1.02ng/mL。三、試劑盒特異性鑒定系列稀釋環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、培氟沙星，檢測試劑盒的特異性。在試劑盒中加入檢測藥物、環(huán)丙沙星單克隆抗體工作液各50uL，37t:，1小時，洗板三次。加入酶標二抗100yL，37。C，0.5小時，洗板三次。加入顯色液，顯色IO分鐘，加入濃硫酸終止反應，酶標儀D45。nm讀數(shù)。分別作抑制曲線，根據(jù)擬合曲線計算半數(shù)抑制濃度。依據(jù)公式計算交叉反應率=IC5。環(huán)丙沙星/IC5。被測組藥物X100%結果表明恩諾沙星與環(huán)丙沙星存在90%的交叉反應，而諾氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、培氟沙星與環(huán)丙沙星均無交叉反應。表1與其它藥物的交叉反應表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>四、試劑盒的準確度實驗取兩個濃度的環(huán)丙沙星標準樣，對樣品進行添加回收試驗，每個濃度做4個平行，分別計算回收率。表2試劑盒回收率測定<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結果表明鯽魚肌肉樣品的添加回收率為86.3%103.3%，蝦肌肉樣品的添加回收率為86.2%117.5%。五、試劑盒精密度試驗從4批試劑盒中各取10個試劑盒，每個試劑盒抽取20個微孔，測定10ng/mL標準溶液的吸光度值(OD值)，計算變異系數(shù)。測定結果見表3表3試劑盒精密度試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>[O130]結果測定范圍在4.79.8%之間，確定精密度的變異性系數(shù)范圍《10%。權利要求一種用于檢測水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于它包括下列組分(1)包被有環(huán)丙沙星-雞卵血清白蛋白偶聯(lián)物(CIP-OVA)的酶標板；(2)環(huán)丙沙星單克隆抗體；(3)環(huán)丙沙星(CIP)標準品溶液；(4)酶標二抗；(5)底物顯色液；(6)洗液；(7)終止液。2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述包被酶標板的包被原CIP-OVA，為環(huán)丙沙星與雞卵血清白蛋白偶聯(lián)物，其制備過程如下(1)先將雞卵血清白蛋白水溶液、環(huán)丙沙星水溶液、1_乙基_(3-甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽水溶液以摩爾比為1:340:7043混合，在室溫下反應2小時；(2)將反應后的液體裝入透析袋內(nèi)，再放入1L磷酸緩沖液中透析48小時，每24小時換液一次；所述的磷酸緩沖液pH為5.0，濃度為0.Olmol/L;所述的透析袋半周長為22mm，截留分子量為14000;(3)收集透析袋內(nèi)的液體，在_201:預冷凍2小時，然后在_501:下冷凍干燥，制成環(huán)丙沙星包被原白色固體粉末。3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的環(huán)丙沙星單克隆抗體是由雜交瘤細胞株JY-1(CCTCCNO.C200947)分泌獲得。4.如權利要求l所述的試劑盒，其特征在于所述的環(huán)丙沙星(CIP)標準品溶液的濃度為0.lng/mL、lng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL。5.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的底物顯色液包括0.03%過氧化氫，1.5mg/mL的四甲基聯(lián)苯胺和pH5.3的醋酸鈉緩沖液。6.—種應用如權利要求1至5中任一所述的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星殘留的免疫學方法，其特征在于包括以下步驟(1)樣品前處理取均質(zhì)過的樣品，加入乙腈作為提取液，搗碎勻漿，振蕩離心后取上清液；往殘渣中加入提取溶劑乙腈，重復上述操作1次，合并上清液，取一定量的上清液做分析；(2)樣品檢測將處理過的樣品上清液和環(huán)丙沙星標準溶液分別加入酶標板，同時加入權利要求3所述的環(huán)丙沙星單克隆抗體標準溶液；溫育后洗滌拍干，加入酶標抗抗體；溫育后洗滌拍干，加入顯色液；溫育后加入終止液，用酶標儀測定吸光度值；(3)結果分析以標準溶液的抑制率B/B。為縱坐標，以不同濃度環(huán)丙沙星的對數(shù)值為橫坐標，繪制標準抑制曲線，根據(jù)標準曲線計算得出樣品中的環(huán)丙沙星濃度。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒，該試劑盒主要包括包被有環(huán)丙沙星-雞卵血清白蛋白偶聯(lián)物(CIP-OVA)的酶標板、環(huán)丙沙星單克隆抗體、環(huán)丙沙星(CIP)標準品溶液、酶標二抗、底物顯色液、洗液、終止液。本發(fā)明還公開了一種利用上述試劑盒檢測水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星殘留的方法，它包括以下步驟首先對樣品進行前處理，然后利用試劑盒檢測，最后分析實驗結果。本發(fā)明提供的試劑盒操作簡便、靈敏度高、特異性強，適合大規(guī)模的樣品檢測。文檔編號G01N33/577GK101710124SQ200910200078公開日2010年5月19日申請日期2009年12月8日優(yōu)先權日2009年12月8日發(fā)明者付喬芳,喻文娟,姜有聲,楊先樂,胡鯤,陳力,黃宣運申請人:上海海洋大學