專利名稱：：一種測定磷酸化多糖中磷含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種測定磷含量的方法，具體涉及一種測定磷酸化多糖中磷含量的方法。
背景技術(shù)：
：多糖廣泛參與細胞的各種生命活動且具有多種生物學(xué)功能，如增強免疫特性、抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、延緩衰老等，因而受到人們的普遍重視，得到相應(yīng)的研究和開發(fā)。但多糖的活性直接或間接地受其結(jié)構(gòu)的制約，因此，采取一定的方法對多糖結(jié)構(gòu)進行適當修飾是有必要的。磷是人體內(nèi)含量較多的元素，不僅參與構(gòu)成骨骼、牙齒以及神經(jīng)組織等軟組織，還參與體內(nèi)的一些重要代謝過程。核酸、磷蛋白、磷脂酶以及細胞內(nèi)第二信使環(huán)腺苷酸、環(huán)鳥苷酸等是含磷基的化合物。高能磷酸化合物的合成、分解是機體利用、儲存能量的主要方式，體內(nèi)所有能量的產(chǎn)生，儲存都取決于適量的磷供給。磷缺乏會出現(xiàn)低磷血癥，表現(xiàn)為貧血、肌無力、骨痛、骨軟化、全身虛弱，以致神經(jīng)、精神異常。磷酸化多糖是磷元素以磷酸根的形式取代多糖上的羥基。磷酸化多糖保持了多糖的基本構(gòu)型，同時使一些本無活性的糖類化合物具有了活性，或顯著提高某些多糖的生物活性。研究表明，磷酸化多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌和免疫調(diào)節(jié)劑等生物活性，其活性普遍高于多糖，且更易于為機體吸收和利用?，F(xiàn)有測定磷含量的方法有中子活化分析法(INAA)、原子發(fā)射光譜法(AES)、原子吸收光譜法(AAS)、電感耦合等離子體-質(zhì)譜法(ICP-MS)、紫外分光光度法和熒光分光光度法、電化學(xué)分析法等。中國專利CN101251489A于2008年8月27日公開了"一種測定沉積物中總磷含量的快速預(yù)處理方法"，將土樣消解后加入顯色劑，在700nm處進行測定。中國專利CN1991339A于2007年7月4日公開了"一種分析樣品中總磷含量的方法"，將待測樣品與一種分解劑混合，再用一種酸性溶液完全溶解，還原成磷鉬藍，利用磷鉬藍在710nm處有最大光吸收值進行測定，測得的吸光度值范圍為0.30.7。中國專利CN1296173A于2001年5月23日公開了"含磷抗靜電劑中無機磷含量的測定方法"，將抗靜電劑中的無機磷用飽和硝酸鈉萃取，消解后用磷鉬黃在420nm處進行比色測定。以上方法中，樣品的處理方法只是適合于所針對的樣品，適用范圍小，未明確測定的檢出限和線性范圍，從而導(dǎo)致其應(yīng)用范圍窄。文獻"香菇多糖磷酸化修飾工藝條件的研究"(《食品與發(fā)酵工業(yè)》，2007，33(12)，6467)2007年在《食品與發(fā)酵工業(yè)》第12期報道了測定香菇多糖磷酸酯中磷含量的方法，樣品處理采用灰化法，處理時間長，過程繁瑣，灰化成分溶解性不好，整個過程以主觀判斷為主，易導(dǎo)致測定結(jié)果不準確。中國專利CN1635366A于2005年7月6日公開了"一種利用低分辨率電感耦合等離子體質(zhì)譜儀檢測磷的方法"，此方法通過測定磷的氧化物濃度來間接測量磷的濃度，但測試成本太高而難以普及。對于測定磷酸化多糖中磷含量的方法，人們期望有一種準確度高、重復(fù)性好、成本低且易于推廣的測定方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種重復(fù)性好、準確度高的測定磷酸化多糖中磷含量的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明一種測定磷酸化多糖中磷含量的方法，包括如下步驟(1)繪制標準曲線并建立回歸方程取一定質(zhì)量的NaH2P04定容于容量瓶中制備磷酸根(P043—)濃度為10ug/ml的母液，再依次稀釋制備0.2、0.5、1、2、3、4、5、7、9、10ug/ml的磷酸根梯度標準溶液，分別取上述梯度標準溶液35ml，加入1.83mlpH值為7.0的Tris緩沖液，搖勻后加入1.22ml濃度為125mg/ml的抗壞血酸水溶液，靜置12min之后依次加入1.83ml濃度為lmol/L的H2S04和0.6lml濃度為30mg/ml的鉬酸銨溶液，混合均勻后在3045"C的恒溫水浴鍋中保溫2030min，以蒸餾水代替所述標準溶液作為空白對照按同樣條件處理，然后分別在824nm處測定光吸收值(即OD值，opticaldensity),以磷酸根濃度為橫坐標(X)，光吸收值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線并建立回歸方程；(2)樣品的處理在恒溫箱中將磷酸化多糖待測樣品在506(TC下處理30~45min除去殘余水分，稱取一定質(zhì)量上述干物質(zhì)樣品，加入混酸，其中樣品與混酸的比例為，重量體積-l2.5mg:lml，所述混酸中各成分的體積份數(shù)比為HN03:HC104=4:1，靜止過夜后在120。C中消解12小時至溶液澄清，得消解液A;(3)磷含量的測定將消解液A在4060。C、0.060.08MPa下減壓濃縮蒸干得到干物質(zhì)B，將干物質(zhì)B定容在容量瓶中制備成B溶液，使其磷酸根濃度在0.210ug/ml范圍內(nèi)，取與步驟(l)中梯度標準溶液相同體積的所述B溶液并按照與與步驟(1)中相同的條件處理，即取B溶液35ml，加入到1.83mlpH值為7.0的Tris緩沖液中，搖勻后加入1.22ml濃度為125mg/ml的抗壞血酸水溶液，靜置l2min之后依次加入1.83ml濃度為lmol/L的H2SOjD0.6lml濃度為30mg/ml的鉬酸銨溶液，混合均勻之后在3045。C的恒溫水浴鍋中保溫2030min，以蒸餾水代替所述B溶液作為空白對照按同樣條件處理，然后在824nm處測定光吸收值，每個樣品測定三次光吸收值，取其平均值代入歩驟(1)中所建立的回歸方程，算出定容后樣品溶液的磷酸根濃度(ug/ml);然后，根據(jù)所定容的樣品溶液的體積(ml)算出所定容樣品B溶液中磷酸根含量(ug)，再根據(jù)所用磷酸化多糖干物質(zhì)樣品的重量(mg)算出所測磷酸化多糖干物質(zhì)中磷酸根的含量(ug/mg)，最后，根據(jù)磷在磷酸根中的含量算出所測磷酸化多糖的磷含量(ug/mg)。表1為實施例13標準曲線的數(shù)據(jù)，圖13為實施例13中光吸收(OD)值(Y)對梯度磷酸根標準溶液濃度(X)繪制的標準曲線，根據(jù)實施例13繪制標準曲線的數(shù)據(jù)分別建立其對應(yīng)的回歸方程，其相關(guān)系數(shù)RM直均非常接近于1，說明其對應(yīng)的回歸方程都具有極顯著的線性關(guān)系。表1實施例13中各梯度磷酸根標準溶液所對應(yīng)的光吸收(OD)值<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>30.38110.38100.381140.49630.49620.49630.62850.62850.628870.89000.88990.890191.13711.13721.1376101.26581.26571.2667R20.99990.99990.9999表2給出了針對同樣的樣品本發(fā)明實施例測定的磷含量與ICP(電感耦合等離子體發(fā)射光譜法)測定的磷含量數(shù)據(jù)的比較；此處的ICP測定是在其他測試機構(gòu)測定的，ICP測定是目前比較準確、可靠的測定方法，但因測試費用較高而難以普及。本發(fā)明實施例的測定結(jié)果與ICP測定結(jié)果基本一致，說明本發(fā)明的測定結(jié)果是準確、可靠的。表2本發(fā)明實施例測定與ICP測定的對應(yīng)磷酸化多糖干物質(zhì)樣品的磷含量(ug/mg)結(jié)果比較實施例樣品本方法測定樣品的磷含量(ug/mg)ICP測定樣品的磷含量(ug/mg)實施例1樣品15.5014.98實施例2樣品74.0771.10實施例3樣品114.86120.60本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明一種測定磷酸化多糖中磷含量的方法，不包括樣品消解預(yù)處理的時間，樣品一次測定的時間僅為30分鐘左右且重復(fù)測定誤差小，測定的線性范圍為0.210ug/ml，檢出限為0.05ug/ml，克服了以往測定磷含量方法中樣品適用范圍小、限制性大、成本高，以及測定結(jié)果不準確、重復(fù)性差等缺點。本發(fā)明的方法檢測結(jié)果準確可靠，重復(fù)性好，測定成本低，易于推廣實施。下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細說明圖1為根據(jù)實施例1中數(shù)據(jù)制作的標準曲線；圖2為根據(jù)實施例2中數(shù)據(jù)制作的標準曲線；圖3為根據(jù)實施例3中數(shù)據(jù)制作的標準曲線。具體實施方式實施例l本發(fā)明提供了一種測定磷酸化多糖中磷含量的方法，具體步驟如下(1)繪制標準曲線并建立回歸方程取12.63mgNaH2P04定容于1000ml容量瓶中制備磷酸根濃度為10ug/ml的母液，再依次稀釋制備0.2、0.5、1、2、3、4、5、7、9、10ug/ml的磷酸根梯度標準溶液，分別量取上述標準溶液3ml，加入1.8mlpH值為7.0的Tris緩沖液，搖勻后加入1.2ml濃度為125mg/ml的抗壞血酸水溶液，靜置2min之后依次加入1.8ml濃度為lmol/L的H2S04和0.6ml濃度為30mg/ml的鉬酸銨溶液，混合均勻后在30°C的恒溫水浴鍋中保溫30min，以蒸餾水代替所述標準溶液作為空白對照按同樣條件處理，然后分別在824nm處測定光吸收(OD)值(結(jié)果如表1所示)，以磷酸根濃度為橫坐標(X)、光吸收值為縱坐標(Y)繪制標準曲線(如圖1)，得到回歸方程Y=0.1264X+0.0002，R=0.9999;(2)樣品的處理在恒溫箱中將待測樣品在6CTC下處理30min除去殘余水分，稱取2mg上述樣品，加入混酸2ml，所述混酸中各成分的體積份數(shù)比為HN03:HC104=4:1，靜止過夜后在120°C中消解2小時至溶液澄清，得消解液A;(3)磷含量的測定將消解液A在4(TC、0.08MPa下減壓濃縮蒸干得到干物質(zhì)B，將干物質(zhì)B定容在100ml容量瓶中制成B溶液，取B溶液3ml，加入1.8mlpH值為7.0的Tris緩沖液中，搖勻后加入1.2ml濃度為125mg/ml的抗壞血酸水溶液，靜置2min之后依次加入1.8ml濃度為lmol/L的H2S04和0.6ml濃度為30mg/ml的鉬酸銨溶液，混合均勻之后在30°C的恒溫水浴鍋中保溫30min，以蒸餾水代替所述B溶液作為空白對照按同樣條件處理，然后在824nm處測定光吸收值，每個樣品測定三次，將所測樣品光吸收值的平均值Y)0.1200代入步驟(1)中所建立的回歸方程(Y=0.1264X+0.0002)算出定容后樣品B溶液中磷酸根濃度(X)為0.95ug/ml，再根據(jù)所定容的樣品B溶液體積100ml算出其中的磷酸根含量95.00ug，根據(jù)干物質(zhì)磷酸化多糖的重量2mg算出所測干物質(zhì)磷酸化多糖磷酸根的含量47.50ug/mg，根據(jù)磷在磷酸根(P(V—)中的含量(約32.63%)算出磷酸化多糖的磷含量15.50ug/mg。實施例2本發(fā)明提供了一種測定磷酸化多糖中磷含量的方法，具體步驟如下(1)繪制標準曲線并建立回歸方程取12.63mgNaH2P04定容于1000ml容量瓶中制備磷酸根濃度為10ug/ml的母液，依次稀釋制備0.2、0.5、1、2、3、4、5、7、9、10ug/ml的磷酸根梯度標準溶液。分別量取上述標準溶液5ml，加入3mlpH值為7.0的Tris緩沖液，搖勻后加入2ml濃度為125mg/ml的抗壞血酸水溶液，靜置2min之后依次加入3ml濃度為lmol/L的112304和lml濃度為30mg/ml的鉬酸銨溶液，混合均勻后在3CTC的恒溫水浴鍋中保溫45min，以蒸餾水代替所述標準溶液作為空白對照按同樣條件處理，然后分別在824nm處測定光吸收(OD)值(結(jié)果如表l所示)，以磷酸根濃度為橫坐標(X)，光吸收值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線(如圖2)，得到回歸方程Y=0.1264X+3E-6，R=0.9999;(2)樣品的處理在恒溫箱中將待測樣品在50。C下處理45min除去殘余水分，稱取4mg上述樣品，加入混酸2ml，所述混酸中各成分的體積份數(shù)比為HN03:HC104=4:1，靜止過夜后在12(TC中消解1.5小時至溶液澄清，得消解液A;G)磷含量的測定將消解液A在5(TC、0.07MPa下減壓濃縮蒸干得到干物質(zhì)B，將干物質(zhì)B定容在200ml容量瓶中，量取定容后的B溶液5ml，加入3mlpH值為7.0的Tris緩沖液中，搖勻后加入2ml濃度為125mg/ml的抗壞血酸水溶液，靜置2min之后依次加入3ml濃度為lmol/L的112504和lml濃度為30mg/ml的鉬酸銨溶液，混合均勻之后在45°C的恒溫水浴鍋中保溫20min，以蒸餾水代替所述B溶液作為空白對照按同樣條件處理，然后在824nm處測定光吸收值，每個樣品測定三次，將所測樣品光吸收值的平均值(Y)0.5740代入步驟(1)中所建立的回歸方程(Y=0.1264X+3E-6)算出定容后樣品溶液中的磷酸根的濃度為4.54ug/ml，再根據(jù)所定容的樣品溶液的體積200ml算出定容樣品液中磷酸根含量908.00ug，根據(jù)干物質(zhì)磷酸化多糖的重量4mg計算出所測干物質(zhì)磷酸化多糖磷酸根的含量227.00ug/mg，根據(jù)磷在磷酸根(P043—)中的含量(約32.63%)算出磷酸化多糖的磷含量74.07ug/mg。實施例3本發(fā)明提供了一種測定磷酸化多糖中磷含量的方法，具體步驟如下(1)繪制標準曲線并建立回歸方程取12.63mgNaH2PO4定容于1000ml容量瓶中制備磷酸根濃度為10ug/ml的母液，依次稀釋制備0.2、0.5、1、2、3、4、5、7、9、10ug/ml的磷酸根梯度標準溶液。分別量取上述標準溶液4ml，加入2.4mlPH值為7.0的Tris緩沖液，搖勻后加入1.6ml濃度為125mg/ml的抗壞血酸水溶液，靜置2min之后依次加入2.4ml濃度為lmol/L的H2S04和0.8ml濃度為30mg/ml的鉬酸銨溶液，混合均勻后在40°C的恒溫水浴鍋中保溫25min，以以蒸餾水代替所述標準溶液作為空白對照按同樣條件處理，然后分別在824nm處測定光吸收(OD)值(結(jié)果如表1所示)，以磷酸根濃度為橫坐標(X)，光吸收值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線(如圖3)，得到回歸方程Y=0.1264X+0.0003，R=0.9999;(2)樣品的處理在恒溫箱中將待測樣品在55r下處理40min除去殘余水分，稱取10mg上述樣品，加入混酸4ml，所述混酸中各成分的體積份數(shù)比為HN03:HC104=4:1，靜止過夜后在12(TC中消解1小時至溶液澄清，得消解液A;(3)磷含量的測定將消解液A在60。C、0.06MPa下減壓濃縮蒸千得到干物質(zhì)B，將干物質(zhì)B定容在500ml容量瓶中，量取定容后的B溶液4ml，加入2.4mlpH值為7.0的Tris緩沖液中，搖勻后加入1.6ml濃度為125mg/ml的抗壞血酸水溶液，靜置2min之后依次加入2.4ml濃度為lmol/L的H2S04和0.8ml濃度為30mg/ml的鉬酸銨溶液，混合均勻之后在40°C的恒溫水浴鍋中保溫25min，以蒸餾水代替所述B溶液作為空白對照按同樣條件處理，然后在824nm處測定光吸收值，每個樣品測定三次，將所測樣品光吸收值的平均值(Y)0.8900代入歩驟(1)中所建立的回歸方程(Y=0.1264X+0.0003)算出定容后樣品溶液中的磷酸根濃度(X)為7.04ug/ml，再根據(jù)所定容的樣品溶液的體積500ml算出定容樣品液中磷酸根含量3520ug，根據(jù)干物質(zhì)磷酸化多糖的重量10mg計算出所測干物質(zhì)磷酸化多糖磷酸根的含量352ug/mg，根據(jù)磷在磷酸根(P043—)中的含量(約32.63%)算出磷酸化多糖的磷含量114.86ug/mg。權(quán)利要求1、一種測定磷酸化多糖中磷含量的方法，其特征在于包括以下步驟(1)繪制標準曲線并建立回歸方程取一定質(zhì)量的NaH2PO4定容于容量瓶中制備磷酸根濃度為10ug/ml的母液，再依次稀釋制備0.2、0.5、1、2、3、4、5、7、9、10ug/ml的磷酸根梯度標準溶液，分別取上述梯度標準溶液3～5ml，加入1.8～3mlpH值為7.0的Tris緩沖液，搖勻后加入1.2～2ml濃度為125mg/ml的抗壞血酸水溶液，靜置1～2min之后依次加入1.8～3ml濃度為1mol/L的H2SO4和0.6～1ml濃度為30mg/ml的鉬酸銨溶液，混合均勻后在30～45℃的恒溫水浴鍋中保溫20～30min，以蒸餾水代替所述標準溶液作為空白對照按同樣條件處理，然后在824nm處測定光吸收值，以磷酸根濃度為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線并建立回歸方程；(2)樣品的處理在恒溫箱中將磷酸化多糖待測樣品在50～60℃下處理30～45min除去殘余水分，稱取一定質(zhì)量上述干物質(zhì)樣品，加入混酸，其中樣品與混酸的比例為，重量∶體積＝1～2.5mg∶1ml，所述混酸中各成分的體積份數(shù)比為HNO3∶HClO4＝4∶1，靜止過夜后在120℃中消解1～2小時至溶液澄清，得消解液A；(3)磷含量的測定將消解液A在40～60℃、0.06～0.08MPa下減壓濃縮蒸干得到干物質(zhì)B，將干物質(zhì)B定容在容量瓶中制備成B溶液，使其磷酸根濃度在0.2～10ug/ml范圍內(nèi)，取與步驟(1)中梯度標準溶液相同體積的所述B溶液并按照與與步驟(1)中相同的條件處理，即取B溶液3～5ml，加入到1.8～3mlpH值為7.0的Tris緩沖液中，搖勻后加入1.2～2ml濃度為125mg/ml的抗壞血酸水溶液，靜置1～2min之后依次加入1.8～3ml濃度為1mol/L的H2SO4和0.6～1ml濃度為30mg/ml的鉬酸銨溶液，混合均勻之后在30～45℃的恒溫水浴鍋中保溫20～30min，以蒸餾水代替所述B溶液作為空白對照按同樣條件處理，然后在824nm處測定光吸收值，每個樣品測定三次光吸收值，取其平均值代入步驟(1)中所建立的回歸方程，算出定容后樣品溶液的磷酸根濃度；然后，根據(jù)所定容的樣品溶液的體積算出所定容樣品B溶液中磷酸根含量，再根據(jù)所用磷酸化多糖干物質(zhì)樣品的重量算出所測磷酸化多糖干物質(zhì)中磷酸根的含量，最后根據(jù)磷在磷酸根中的含量算出所測磷酸化多糖的磷含量。全文摘要本發(fā)明涉及一種測定磷酸化多糖中磷含量的方法。本發(fā)明通過配制磷酸根梯度標準溶液，以蒸餾水代替所述標準溶液作為空白對照，按同樣條件處理，然后在824nm處測光吸收值，繪制標準曲線并建立回歸方程；接著，將待測磷酸化多糖處理后先用混酸消解，再稀釋定容配制樣品溶液，取與被處理的磷酸梯度標準溶液相同體積的該樣品溶液，以同樣的條件處理并測光吸收值，根據(jù)回歸方程算出待測樣品溶液的磷酸根濃度，再進一步確定待測磷酸化多糖的含磷量。本發(fā)明方法測定時間較短、重復(fù)測定誤差小，檢測范圍較寬、結(jié)果準確可靠，測定成本低而易于推廣實施。文檔編號G01N21/31GK101625316SQ20091016200公開日2010年1月13日申請日期2009年8月5日優(yōu)先權(quán)日2009年8月5日發(fā)明者付麗娟,健姚,繼張,桑春艷,梁俊玉,王云普,王俊龍,王小芳,趙保堂,馬君義申請人:西北師范大學(xué)