專(zhuān)利名稱(chēng)：：茶樹(shù)含不同兒茶素含量及組分的細(xì)胞系篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物細(xì)胞系的篩選方法，茶樹(shù)含不同兒茶素含量及組分的細(xì)胞系篩選方法。
背景技術(shù)：
：植物類(lèi)黃酮的合成受到外界環(huán)境因素的影響，光照、溫度、營(yíng)養(yǎng)等因素均會(huì)影響到茶樹(shù)中的酚類(lèi)物質(zhì)的合成。由于利用完整的茶樹(shù)個(gè)體研究酚類(lèi)物質(zhì)的生物合成代謝有許多限制因素，無(wú)疑茶愈傷組織和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系已成為研究茶樹(shù)次生代謝的良好平臺(tái)。篩選出含不同兒茶素含量及組分的茶細(xì)胞系是這種良好平臺(tái)最終建立的前提。常見(jiàn)的含特殊物質(zhì)細(xì)胞系的篩選手段有多種，而尋找一種有效易行的特殊物檢測(cè)手段是篩選體系建立的基礎(chǔ)。對(duì)于有顏色的特殊物，通常采用直接目視法篩選高產(chǎn)細(xì)胞系[1]，如含花青素、萘醌、類(lèi)胡蘿卜素、葉綠素等物質(zhì)的愈傷組織或細(xì)胞系，其顏色的深淺表明了內(nèi)含物含量的變化。山本等在篩選具有高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)花青素細(xì)胞系過(guò)程中，利用目視法挑選顏色較深的愈傷組織繼代培養(yǎng)，這樣反復(fù)篩選了近30代，在第23代之后細(xì)胞塊的色素含量的平均值保持穩(wěn)定，并比原細(xì)胞株含量高7倍[2]。吳蘊(yùn)祺等利用二分法結(jié)合高效液相色譜分析(HPLC)，對(duì)紅豆杉愈傷組織中的紫杉醇高產(chǎn)細(xì)胞系進(jìn)行篩選，獲得了一個(gè)紫杉醇高產(chǎn)細(xì)胞系Ts-19，其紫杉醇含量達(dá)細(xì)胞干重的4.0%[3]。但茶樹(shù)兒茶素是無(wú)色的，無(wú)法通過(guò)肉眼直接進(jìn)行茶細(xì)胞系的識(shí)別篩選，只能采取間接的方法。兒茶素的含量可以通過(guò)1%香草醛鹽酸試劑顯色的分光光度法測(cè)定，兒茶素的組分可以通過(guò)高效液相色譜(HPLC)法來(lái)檢測(cè)，但其測(cè)定過(guò)程復(fù)雜、所需時(shí)間較長(zhǎng)，如從樣品的兒茶素提取分光光度法測(cè)定至少需要30分鐘，而從樣品的兒茶素提取到高效液相色譜分析完畢需要至少l小時(shí)，無(wú)法達(dá)到快速檢測(cè)的目的，從而限制了含不同兒茶素含量及組分的茶細(xì)胞系的篩選。
發(fā)明內(nèi)容為了解決茶樹(shù)愈傷組織或細(xì)胞系中兒茶素含量及組分的檢測(cè)所需時(shí)間較長(zhǎng)，操作復(fù)雜，無(wú)法達(dá)到快速檢測(cè)的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種操作簡(jiǎn)便、可實(shí)現(xiàn)快速篩選的茶樹(shù)含不同兒茶素含量及組分的細(xì)胞系篩選方法。具體技術(shù)方案如下-茶樹(shù)含不同兒茶素含量及組分的細(xì)胞系篩選方法包括茶愈傷組織誘導(dǎo)與繼代、含不同兒茶素含量的茶愈傷組織篩選、含不同兒茶素含量的茶細(xì)胞系篩選、含不同兒茶素組分的茶細(xì)胞系篩選4道操作步驟，具體操作方法如下(1)茶愈傷組織誘導(dǎo)與繼代A、誘導(dǎo)選取茶樹(shù)幼嫩莖為外植體，將外植體消毒，并接種于固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)，誘導(dǎo)條件:溫度25士rC，暗培養(yǎng)；每21天轉(zhuǎn)接繼代一次，轉(zhuǎn)接l-3次，莖段兩端即可長(zhǎng)出淺黃色的茶愈傷組織；B、繼代將淺黃色茶愈傷組織切成0.5cr^0.5cm大小，繼續(xù)在固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，每21天轉(zhuǎn)接繼代一次，至少轉(zhuǎn)接5次，繼代培養(yǎng)條件溫度25士rC，暗培養(yǎng)；繼代過(guò)程中不斷棄去褐化和長(zhǎng)勢(shì)不好的茶愈傷組織，保留生長(zhǎng)速度快的茶愈傷組織；(2)含不同兒茶素含量的茶愈傷組織篩選取茶愈傷組織在固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，21天轉(zhuǎn)接繼代一次；繼代培養(yǎng)條件溫度25土rc，暗培養(yǎng)；在第21天轉(zhuǎn)接繼代時(shí)，采取目視法對(duì)茶愈傷組織進(jìn)行篩選，即在超凈工作臺(tái)上挑選不同顏色、不同質(zhì)地的茶愈傷組織分別進(jìn)行繼代培養(yǎng)；轉(zhuǎn)接繼代半年至一年，獲得高兒茶素含量和低兒茶素含量的茶愈傷組織；所述高兒茶素含量的茶愈傷組織，顏色為黃色、生長(zhǎng)速度快、質(zhì)地疏松；所述低兒茶素含量的茶愈傷組織，顏色為白色、生長(zhǎng)速度快、質(zhì)地松散；(3)含不同兒茶素含量的茶細(xì)胞系篩選將高兒茶素含量和低兒茶素含量的茶愈傷組織分別接種到液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)21天，接著再分別接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)21天；固體培養(yǎng)條件溫度25士rC，暗培養(yǎng)；液體培養(yǎng)條件搖床轉(zhuǎn)速100rpm/min、培養(yǎng)瓶為150ml的三角錐形瓶、裝液量30ml、接種量lg，溫度25土rc、暗培養(yǎng)；在液體與固體培養(yǎng)的交替繼代接種時(shí)，在超凈工作臺(tái)上將高兒茶素含量和低兒茶素含量的茶愈傷組織逐一編號(hào)后用手術(shù)刀一分為二，取其中的一半放入事先裝有5mlW香草醛鹽酸試劑的試管中，顯色10分鐘，將對(duì)應(yīng)的另一半分別進(jìn)行繼代培養(yǎng)；如此反復(fù)循環(huán)，至少4個(gè)循環(huán)，獲得高兒茶素含量和低兒茶素含量的茶細(xì)胞系；所述高兒茶素含量的茶細(xì)胞系，1%香草醛鹽酸試劑活體快速顯色后呈現(xiàn)深紅色；茶細(xì)胞系的兒茶素含量達(dá)到每克干重7.7689毫克以上；所述低兒茶素含量的茶細(xì)胞系，1%香草醛鹽酸試劑活體快速顯色后呈現(xiàn)淺紅色；茶細(xì)胞系的兒茶素含量達(dá)到每克干重O.1272毫克以下；(4)含不同兒茶素組分的茶細(xì)胞系篩選將高兒茶素含量和低兒茶素含量的茶愈傷組織分別接種到液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)21天，接著再分別接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)21天；固體培養(yǎng)條件溫度25土rC，暗培養(yǎng)；液體培養(yǎng)條件搖床轉(zhuǎn)速100rpm/min、培養(yǎng)瓶為150ml的三角錐形瓶、裝液量30ml、接種量lg，溫度25土rc、暗培養(yǎng)；在液體與固體培養(yǎng)的交替繼代接種時(shí)，將高兒茶素含量和低兒茶素含量的茶愈傷組織的一半分別進(jìn)行兒茶素組分的薄層層析檢測(cè)，將對(duì)應(yīng)的另一半分別進(jìn)行繼代培養(yǎng)；如此反復(fù)循環(huán)，至少4個(gè)循環(huán)；獲得兩種以上含六種兒茶素組分和六種以下兒茶素組分的茶細(xì)胞系；薄層層析檢測(cè)操作步驟如下A.制備茶細(xì)胞系兒茶素提取液對(duì)兩種以上含六種兒茶素組分和六種以下兒茶素組分的茶細(xì)胞系分別制備茶細(xì)胞系兒茶素提取液；取含六種兒茶素組分和六種以下兒茶素組分的茶細(xì)胞系3g，加少許石英砂，液氮研磨至粉碎，力tl3ml95M乙醇研磨，4000g離心，吸取上清液，沉淀加3ml95。/。乙醇，再次離心，此法重復(fù)三次，最后95%乙醇定容至10ml;將上述得到的IOml乙醇溶液，蒸干去除乙醇，再用熱水溶解，再用等量乙酸乙酯萃取3次，取有機(jī)相濃縮干燥，用lml甲醇定容；甲醇定容溶液用孔徑為0.45pm有機(jī)膜過(guò)濾，得兩種以上兒茶素提取液；B.薄層層析檢測(cè)分別對(duì)兩種以上兒茶素提取液進(jìn)行薄層層析檢測(cè)；將兒茶素提取液點(diǎn)樣于2.5W0硅膠GF-254板上，25'C下展層23h，展開(kāi)劑接近硅膠板上端后取出硅膠板晾干，硅膠板經(jīng)過(guò)W(g/v)香蘭素鹽酸溶液噴霧顯色，吹風(fēng)機(jī)吹干后，立刻觀察拍照；所述含六種兒茶素組分的茶細(xì)胞系，其兒茶素提取液，在展層后的硅膠板上，經(jīng)過(guò)W(g/v)香蘭素鹽酸溶液噴霧顯色，呈現(xiàn)四個(gè)紅色條帶；高效液相色譜檢測(cè)(公識(shí)方法)含有表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯((-)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯((-)-epicatechin-3-gallate，ECG)、表沒(méi)食子兒茶素((-)-epigallocatechin，EGC)、沒(méi)食子7兒茶素((+)-gallocatechin，GC)、兒茶素((+)-catechin，C)和表兒茶素((-)-epicatechin，EC)六種兒茶素；所述含六種以下兒茶素組分的茶細(xì)胞系，其兒茶素提取液，在展層后的硅膠板上，經(jīng)過(guò)W(g/v)香蘭素鹽酸溶液噴霧顯色，呈現(xiàn)四個(gè)以下紅色條帶；高效液相色譜檢測(cè)(公識(shí)方法)含有表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯((-)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯((-)-epicatechin-3-gallate,ECG)、表沒(méi)食子兒茶素((-)-epigallocatechin，EGC)、沒(méi)食子兒茶素((+)-gallocatechin，GC)、兒茶素((+)-catechin,C)和表兒茶素((-)-epicatechin，EC)六種JL茶素中的五種以下；所述固體培養(yǎng)基為在1LB5培養(yǎng)基中加入2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg、激動(dòng)素O.lmg、瓊脂8g和蔗糖30g;pH為5.5;所述液體培養(yǎng)基為在1LB5培養(yǎng)基中加入2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg、激動(dòng)素O.lmg和蔗糖30g;pH為5.5。發(fā)明技術(shù)特點(diǎn)說(shuō)明1.培養(yǎng)基的選擇不同培養(yǎng)基會(huì)影響到茶愈傷組織的生長(zhǎng)特性和兒茶素合成能力，表2、圖7結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pH5.5的H培養(yǎng)基(H培養(yǎng)基為1LMS培養(yǎng)基含10mgH引哚丁酸(IBA)、2mg激動(dòng)素(KT)、8g克瓊脂和30g蔗糖的固體培養(yǎng)基)生長(zhǎng)的茶愈傷組織，不僅兒茶素合成能力有限，兒茶素含量低，而且組織緊結(jié)、生長(zhǎng)速度慢；在pH5.5的S固體培養(yǎng)基(S固體培養(yǎng)基為1LMS培養(yǎng)基含2mg2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、0.5mg激動(dòng)素(KT)、8g瓊脂和30g蔗糖)上生長(zhǎng)的茶愈傷組織，雖然兒茶素含量高，但組織緊結(jié)、生長(zhǎng)速度慢，這兩種培養(yǎng)基均不適合進(jìn)行均一茶細(xì)胞系的誘導(dǎo)和篩選；只有在pH5.5的B固體培養(yǎng)(B固體培養(yǎng)為1LB5培養(yǎng)基含0.5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、0.lmg激動(dòng)素(KT)、8g克瓊脂和30g蔗糖)上誘導(dǎo)的茶愈傷組織，生長(zhǎng)速度快，組織疏松，適合誘導(dǎo)篩選均一的茶細(xì)胞系。另外，在B固體培養(yǎng)基中，激素濃度也會(huì)影響茶細(xì)胞系的生長(zhǎng)和兒茶素積累。由表3可見(jiàn)，在激動(dòng)素(KT)保持不變的情況下，適當(dāng)增加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的濃度能夠促進(jìn)茶細(xì)胞系的生長(zhǎng)，但是對(duì)兒茶素的積累沒(méi)有太大的影響；在激動(dòng)素(KT)保持不變的情況下，增加萘乙酸(NAA)濃度，不僅有利于茶細(xì)胞系生長(zhǎng)，也有利于兒茶素合成；在2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)保持不變的情況下，增加激動(dòng)素(KT)濃8度，不利于茶細(xì)胞系生長(zhǎng)，也不明顯提高茶細(xì)胞系兒茶素的積累；當(dāng)同時(shí)提高2，4_二氯苯氧乙酸(2，4-D)與激動(dòng)素(KT)的濃度，保持其比例不變時(shí)，均不利于茶細(xì)胞系的生長(zhǎng)和兒茶素的積累。2.含不同兒茶素含量的茶愈傷組織篩選早期茶愈傷組織是不均勻的，從外觀上看，有黃色、白色，淺綠色，從質(zhì)地上看，有堅(jiān)硬、疏松的區(qū)別。圖8-圖13所示，經(jīng)過(guò)W(w/v)香蘭素鹽酸溶液顯色后，黃色茶愈傷組織的顏色較深，而白色和淺綠色茶愈傷組織則顯色較淺，說(shuō)明從茶愈傷組織的外觀上可以初步區(qū)分茶愈傷組織體內(nèi)的兒茶素含量，即黃色茶愈傷組織的兒茶素含量大于白色、淺綠色的。但在試驗(yàn)中要區(qū)分由于衰老引起的茶愈傷組織色澤變黃，變黃衰老的茶愈傷組織中的兒茶素含量很低。3.含不同兒茶素含量的茶細(xì)胞系篩選由于培養(yǎng)條件的差異，在液體培養(yǎng)條件下的茶細(xì)胞團(tuán)呈圓形，細(xì)胞較均勻，而固體培養(yǎng)的茶細(xì)胞團(tuán)呈不規(guī)則性，茶細(xì)胞系均勻性較差，因此液體培養(yǎng)有利于獲得均一的茶細(xì)胞系(圖14、圖15，圖16、圖17)。但液體培養(yǎng)方式并不適合茶細(xì)胞系的篩選的操作，因此在茶細(xì)胞系篩選中選擇液體與固體交替培養(yǎng)方式，再結(jié)合二分法、1%香草醛濃鹽酸試劑活體顯色法，篩選具有明顯兒茶素含量差異的茶細(xì)胞系，例如，本發(fā)明實(shí)施例中采用這種方式，從云莖63愈傷組織中，篩選得到兩種兒茶素含量差異較大的茶細(xì)胞系，"云莖63XA"和"云莖63YA";從外形上看，"云莖63XA"茶細(xì)胞顏色發(fā)白、松散、懸浮性較好，而"云莖63YA"茶細(xì)胞顏色發(fā)黃、略緊、懸浮性較差(圖2);高效液相色譜(HPLC)分析表明(表l，圖3)，云莖63Y茶細(xì)胞的兒茶素含量遠(yuǎn)高于云莖63X茶細(xì)胞。4.含不同兒茶素組分的茶細(xì)胞系篩選與高效液相色譜(HPLC)相比，利用薄層層析可以在短時(shí)間快速檢測(cè)出茶細(xì)胞系的兒茶素組分，具有快速、方法簡(jiǎn)單、不需要昂貴的儀器的特點(diǎn)。例如，本發(fā)明實(shí)施例中采用這種方式，從云莖63茶愈傷組織中，篩選得到一種兒茶素組分較少的細(xì)胞系云莖63H,從外形上看，"云莖63H"與"云莖63Y，'相似，但"云莖63H"細(xì)胞只含有簡(jiǎn)單兒茶素GC、EGC、C、EC，不含有酯型兒茶素ECG、EGCG(圖5，圖6)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益技術(shù)效果1.目前，獲得含不同兒茶素含量或組分的茶愈傷組織的方法主要是通過(guò)改變培養(yǎng)條件而達(dá)到的，如增加光照，改變培養(yǎng)基成分等。但光照和培養(yǎng)基都可能較大地改變細(xì)胞特性，無(wú)法得到有價(jià)值的、均勻的茶細(xì)胞系。目前尚沒(méi)有建立含不同兒茶素含量或組分的茶細(xì)胞系的篩選技術(shù)。2.雖然茶樹(shù)兒茶素是無(wú)色的。但本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，茶愈傷組織的外觀顏色與兒茶素含量有相關(guān)性，因此直接目視法是可以用來(lái)篩選含不同兒茶素含量的茶細(xì)胞系的。3.與1%香草醛鹽酸試劑顯色的分光光度法相比，茶樹(shù)愈傷組織的香草醛鹽酸試劑活體顯色技術(shù)，雖然不能精確測(cè)定愈傷組織中的兒茶素含量，但卻具有操作簡(jiǎn)單、顯色迅速的特點(diǎn)。由于能在5-10分鐘的短時(shí)間內(nèi)顯示愈傷組織的兒茶素含量的差異，因此其最大優(yōu)點(diǎn)是可以在轉(zhuǎn)接繼代的操作過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行兒茶素檢測(cè)，從而加快了含不同兒茶素含量的茶細(xì)胞系的篩選速度。5.與高效液相色譜技術(shù)相比，茶樹(shù)細(xì)胞系兒茶素組分的薄層層析鑒定，可以一次分析多個(gè)樣品，因此具有快速鑒定的特點(diǎn)。另外，薄層層析鑒定還可以發(fā)現(xiàn)新的成分，從而加快了含不同兒茶素組分的茶細(xì)胞系的篩選速度。圖1為二分法結(jié)合1%香草醛鹽酸試劑活體快速顯色法篩選茶細(xì)胞系示意圖，圖2為云莖63YB(上左，下左)和云莖63XB(上右，下右)茶細(xì)胞系示意圖，圖3為"云莖63XB"和"云莖63YB"茶細(xì)胞系的兒茶素組分的比較圖，圖4為含不同兒茶素組分的茶細(xì)胞系篩選程序示意圖，圖5為不同茶細(xì)胞系兒茶素組分的薄層層析圖，圖6為不同茶細(xì)胞系兒茶素組分的高效液相色譜圖，圖7為不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的茶愈傷組織兒茶素組分的高效液相色譜圖，圖8為綠色茶愈傷組織染色前狀態(tài)圖，圖9為綠色茶愈傷組織染色后狀態(tài)圖，圖10為白色茶愈傷組織染色前狀態(tài)圖，圖1l為白色茶愈傷組織染色后狀態(tài)圖，圖12為黃色茶愈傷組織染色前狀態(tài)圖，圖13為黃色茶愈傷組織染色后狀態(tài)圖，圖14為液體培養(yǎng)篩選系染色前狀態(tài)圖，圖15為液體培養(yǎng)篩選系染色后狀態(tài)圖，10圖16為固體培養(yǎng)篩選系染色前狀態(tài)圖，圖17為固體培養(yǎng)篩選系染色后狀態(tài)圖，圖18為"云莖63XB"和"云莖63YB"兒茶素含量，見(jiàn)表l，圖19為不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織的特性，見(jiàn)表2，圖20為激素對(duì)茶樹(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)和兒茶素合成的影響，見(jiàn)表3。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說(shuō)明。實(shí)施例主要設(shè)備1.手術(shù)刀；2.高壓蒸汽滅菌鍋；3.2.5"0硅膠GF-254板；4.9cm培養(yǎng)皿；5.離心機(jī)；6.pH計(jì)；7.超凈工作臺(tái)；8.高效液相色譜(HPLC)材料與試劑1.材料茶樹(shù)云南大葉禾中(C"附e〃/a57'"e"57》(L.)0.Kuntze.var.w'wera!'scultivarYunNanDaYeZhong)幼嫩莖段。2.主要試劑(1)70%的乙醇按體積比無(wú)水乙醇水=750:282配制，(2)0.1%氯化汞(HgCl2):取O.lg氯化汞(HgCl2)溶于100ml純水中，(3)固體培養(yǎng)基為在lLBs培養(yǎng)基中加入2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg、激動(dòng)素O.lmg、瓊脂8g和蔗糖30g;pH為5.5，(4)液體培養(yǎng)基為在lLBs培養(yǎng)基中加入2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg、激動(dòng)素O.lmg和蔗糖30g;pH為5.5，(5)1%香草醛濃鹽酸溶液稱(chēng)取1.0g香草醛，溶于100ml濃鹽酸溶液，(6)薄層層析展開(kāi)劑:正丁醇:冰乙酸:水=4:1:5，配制后的展開(kāi)劑經(jīng)過(guò)多次振搖后，放置24小時(shí)后，棄去下層后待用。操作方法茶樹(shù)含不同兒茶素含量及組分的細(xì)胞系篩選方法包括茶愈傷組織誘導(dǎo)與繼代、含不同兒茶素含量的茶愈傷組織篩選、含不同兒茶素含量的茶細(xì)胞系篩選、含不同兒茶素組分的茶細(xì)胞系篩選4道操作步驟，具體操作方法如下1.茶愈傷組織誘導(dǎo)與繼代A:茶愈傷組織誘導(dǎo)選取茶樹(shù)幼嫩莖為外植體。采來(lái)的外植體用清水沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)上，先用70%的乙醇浸泡30秒，經(jīng)無(wú)菌水沖洗35遍，然后放入O.WHgCl2中浸泡57分鐘，再用無(wú)菌水沖洗35遍,得無(wú)菌外植體。立即將無(wú)菌外植體接種于固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)茶愈傷組織。茶愈傷組織誘導(dǎo)條件為溫度25士rc;暗培養(yǎng)。外植體每21天轉(zhuǎn)接繼代一次，轉(zhuǎn)接l-3次后，莖段兩端即可長(zhǎng)出淺黃色的茶愈傷組織。B:茶愈傷組織繼代將淺黃色茶愈傷組織切成0.5cnPK).5cm大小，接種在固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。在第21天轉(zhuǎn)接繼代過(guò)程中，在超凈工作臺(tái)上，棄去褐化和長(zhǎng)勢(shì)不好的茶愈傷組織，保留生長(zhǎng)速度快的茶愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)條件為溫度25土rc;暗培養(yǎng)。以后每21天轉(zhuǎn)接繼代一次。繼代4次，得到較為均勻的茶愈傷組織，命名為云莖63愈傷組織。2.含不同兒茶素含量的茶愈傷組織篩選將云莖63茶愈傷組織接種在固體培養(yǎng)基上，在第21天轉(zhuǎn)接繼代過(guò)程中，在超凈工作臺(tái)上，釆取目視法對(duì)愈傷組織進(jìn)行篩選，即挑選不同顏色、不同質(zhì)地的愈傷組織分別進(jìn)行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)條件為溫度25土rc;暗培養(yǎng)。以后每21天轉(zhuǎn)接1次，同時(shí)采用目視法對(duì)愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行篩選。繼代培養(yǎng)至少半年，可以初步獲得高兒茶素含量和低兒茶素含量的茶愈傷組織，分別命名為云莖63YA和云莖63XA愈傷組織。高兒茶素含量的茶愈傷組織(云莖63YA):顏色黃色、生長(zhǎng)速度快、質(zhì)地疏松。低兒茶素含量的茶愈傷組織(云莖63XA):顏色白色、生長(zhǎng)速度快、質(zhì)地松散。3.含不同兒茶素含量的茶細(xì)胞系篩選將高兒茶素含量和低兒茶素含量的茶愈傷組織進(jìn)行液體與固體交替培養(yǎng)，即將茶愈傷組織接種在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)，在第21天將茶愈傷組織再接種到固體培養(yǎng)基上進(jìn)行固體培養(yǎng)；固體培養(yǎng)條件溫度25士rC;暗培養(yǎng)；液體培養(yǎng)條件培養(yǎng)瓶為150ml的三角錐形瓶；裝液量30ml;接種量lg;搖床轉(zhuǎn)速100rpm/min;培養(yǎng)周期21天；(25士irC;暗培養(yǎng)；在液體與固體培養(yǎng)的交替過(guò)程中，在超凈工作臺(tái)上，利用二分法，結(jié)合1%香草醛鹽酸試劑活體快速顯色法(圖l)，分別篩選高兒茶素含量和低兒茶素含量的茶細(xì)胞系，即在超凈工作臺(tái)上將細(xì)胞團(tuán)逐一編號(hào)后用手術(shù)刀一分為二，取其中的一半細(xì)胞團(tuán)放入事先裝有5mlW香草醛鹽酸試劑的試管中，顯色10分鐘。將顯色不同深淺的茶愈傷組織對(duì)應(yīng)的另一半茶細(xì)胞團(tuán)分別接種，繼續(xù)培養(yǎng)。以后每21天液體與固體培養(yǎng)的交替培養(yǎng)l次，同時(shí)進(jìn)行二分法，結(jié)合1%香草醛鹽酸試劑活體快速顯色法分別篩選。至少交替培養(yǎng)4個(gè)周期，獲得了高兒茶素含量和低兒茶素含量的茶細(xì)胞系，分別命名為云莖63YB細(xì)胞系和云莖63XB細(xì)胞系(圖2，圖3，表l)。高兒茶素含量的茶細(xì)胞系(云莖63YB)(圖2):顏色黃色、生長(zhǎng)速度快、質(zhì)地疏松、細(xì)胞顆粒大、懸浮性差；1%香草醛鹽酸試劑活體快速顯色后呈現(xiàn)深紅色。低兒茶素含量的茶細(xì)胞系(云莖63XB)(圖2):顏色白色、生長(zhǎng)速度快、質(zhì)地松散、細(xì)胞顆粒小、懸浮性好；1%香草醛鹽酸試劑活體快速顯色后呈現(xiàn)淺紅色。4.含不同兒茶素組分的茶細(xì)胞系篩選將高兒茶素含量和低兒茶素含量的茶愈傷組織進(jìn)行液體與固體交替培養(yǎng)，即將茶愈傷組織接種在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)，在第21天將茶愈傷組織再接種到固體培養(yǎng)基上進(jìn)行固體培養(yǎng)。在液體與固體培養(yǎng)的交替過(guò)程中，在超凈工作臺(tái)上，利用二分法，結(jié)合薄層層析和1%香草醛濃鹽酸溶液噴霧顯色法，分別篩選含兒茶素組分多和含兒茶素組分少的茶細(xì)胞系(圖4)。以后每21天液體與固體培養(yǎng)的交替培養(yǎng)1次，同時(shí)進(jìn)行二分法，結(jié)合1%香草醛鹽酸試劑活體快速顯色法分別篩選。至少交替培養(yǎng)4個(gè)周期，獲得了含兒茶素組分多和含兒茶素組分少的茶細(xì)胞系，分別命名為云莖63YC，云莖63H細(xì)胞系(圖5，圖6)。細(xì)胞系兒茶素薄層層析檢測(cè)方法如下-A.篩選細(xì)胞系兒茶素提取液的制備取篩選細(xì)胞系3g，加少許石英砂，液氮研磨至粉碎，力B3ml95%乙醇研磨，4000g離心，吸取上清液，沉淀加3ml95%乙醇，再次離心。此法重復(fù)三次，最后95%乙醇定容至10ml。將上述得到的IOml乙醇溶液，蒸干去除乙醇，再用熱水溶解，再用等量乙酸乙酯萃取3次，取有機(jī)相濃縮干燥，用lml甲醇定容。得到的樣品用孔徑為O.45nm有機(jī)膜過(guò)濾，得兒茶素提取液。B.薄層層析檢測(cè)兒茶素提取液點(diǎn)樣于2.5H40硅膠GF-254板上，25。C下展層23h，展開(kāi)劑接近硅膠板上端后取出硅膠板晾干，W(g/v)香蘭素鹽酸溶液噴霧顯色，吹風(fēng)機(jī)吹干后，立刻觀察拍照。薄層層析檢測(cè)(圖5)顯示，茶樹(shù)中的六種兒茶素可以在硅膠板呈現(xiàn)四條紅色條帶，每一個(gè)條帶的遷移率并不相同。含不同兒茶素組分的細(xì)胞系的條帶數(shù)有差異，云莖63YC含有四條紅色條帶，而云莖63H只有兒茶素((+)-catechin，C)和表兒茶素((-)-epicatechin，EC)和表沒(méi)食子兒茶素((-)-epigallocatechin，EGC)的紅色條帶，但云莖63H有未知條帶。13高效液相色譜(HPLC)進(jìn)一步證實(shí)(圖6)，含兒茶素組分多的細(xì)胞系(云莖63YC)含有表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯((-)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯((-)-epicatechin-3-gallate，ECG)、表沒(méi)食子兒茶素((-)-epigallocatechin，EGC)、沒(méi)食子兒茶素((+)-gallocatechin，GC)、兒茶素((+)-catechin，C)和表兒茶素((-)-epicatechin，EC)，而含兒茶素組分少的細(xì)胞系(云莖63H)只有表沒(méi)食子兒茶素((-)-epigallocatechin，EGC)、沒(méi)食子兒茶素((+)-gallocatechin，GC)、兒茶素((+)-catechin，C)和表兒茶素((-)-epicatechin，EC)。5.篩選茶細(xì)胞系穩(wěn)定性檢測(cè)利用高效液相色譜(HPLC)方法，定期檢測(cè)培養(yǎng)的茶細(xì)胞系的兒茶素含量和組分，以確定茶細(xì)胞系兒茶素合成能力的穩(wěn)定性。茶細(xì)胞系兒茶素高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法如下A.篩選茶細(xì)胞系兒茶素提取液的制備(同薄層層析檢測(cè)方法)，B.高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法兒茶素提取液用色譜甲醇稀釋到合適的濃度，HPLC檢測(cè)。HPLC色譜條件色譜泵沃特斯600(Waters600);控制儀沃特斯600(Waters600);色譜柱菲羅門(mén)圣潔蘭4u輻深25(^4.6mm(PhenomenexSynergi4uFusion250M.6mm);檢測(cè)器UV沃特斯(Waters)2487;靈敏度0.01;檢測(cè)波長(zhǎng)280nm;流速1.2ml/分鐘；進(jìn)樣量5pl;每一試樣進(jìn)樣之前，以流動(dòng)相平衡15分鐘。采用梯度洗脫條件A相1%乙酸，B相色譜純乙腈，洗脫梯度為前20分鐘內(nèi)八相由90%到87%，B相由10。/o到13%;20分鐘到40分鐘A相由87私到708/6，8相由13%到30%。外標(biāo)法定量。目的在于檢測(cè)已經(jīng)篩選到的茶細(xì)胞系的兒茶素合成的能力是否保持不變，如果有變化，茶細(xì)胞系必須被液氮超低溫保存。14參考文獻(xiàn)蘇國(guó)慶，王莉，劉玉軍.植物細(xì)胞培養(yǎng)中的高產(chǎn)細(xì)胞系篩選[J].海南師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005,18(4):364-368.Y.山本，R.水口.篩選穩(wěn)定高含量花青素鐵海棠細(xì)胞培養(yǎng)物的策略[J].基因理論與應(yīng)用，1982，61:113-116(Y.Yamamoto,R.Mizuguchi.Selectionofahighandstablepigment-producingstraininculturedeuphorbiamilliiCells[J"].TheorApplGenet,1982，61:113-116.)吳蘊(yùn)祺，朱蔚華，陸儉，胡秋，李新蘭.紅豆杉愈傷組織中紫杉醇高產(chǎn)細(xì)胞系的選擇及其培養(yǎng)[J].中藥及天然藥物，1998,33(1):15-18.權(quán)利要求1、茶樹(shù)含不同兒茶素含量及組分的細(xì)胞系篩選方法，其特征在于包括茶愈傷組織誘導(dǎo)與繼代、含不同兒茶素含量的茶愈傷組織篩選、含不同兒茶素含量的茶細(xì)胞系篩選、含不同兒茶素組分的茶細(xì)胞系篩選4道操作步驟，具體操作方法如下(1)茶愈傷組織誘導(dǎo)與繼代A、誘導(dǎo)選取茶樹(shù)幼嫩莖為外植體，將外植體消毒，并接種于固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)，誘導(dǎo)條件溫度25±1℃，暗培養(yǎng)；每21天轉(zhuǎn)接繼代一次，轉(zhuǎn)接1-3次，莖段兩端即可長(zhǎng)出淺黃色的茶愈傷組織；B、繼代將淺黃色茶愈傷組織切成0.5cm*0.5cm大小，繼續(xù)在固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，每21天轉(zhuǎn)接繼代一次，至少轉(zhuǎn)接5次，繼代培養(yǎng)條件溫度25±1℃，暗培養(yǎng)；繼代過(guò)程中不斷棄去褐化和長(zhǎng)勢(shì)不好的茶愈傷組織，保留生長(zhǎng)速度快的茶愈傷組織；(2)含不同兒茶素含量的茶愈傷組織篩選取茶愈傷組織在固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，21天轉(zhuǎn)接繼代一次；繼代培養(yǎng)條件溫度25±1℃，暗培養(yǎng)；在第21天轉(zhuǎn)接繼代時(shí)，采取目視法對(duì)茶愈傷組織進(jìn)行篩選，即在超凈工作臺(tái)上挑選不同顏色、不同質(zhì)地的茶愈傷組織分別進(jìn)行繼代培養(yǎng)；轉(zhuǎn)接繼代半年至一年，獲得高兒茶素含量和低兒茶素含量的茶愈傷組織；所述高兒茶素含量的茶愈傷組織，顏色為黃色、生長(zhǎng)速度快、質(zhì)地疏松；所述低兒茶素含量的茶愈傷組織，顏色為白色、生長(zhǎng)速度快、質(zhì)地松散；(3)含不同兒茶素含量的茶細(xì)胞系篩選將高兒茶素含量和低兒茶素含量的茶愈傷組織分別接種到液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)21天，接著再分別接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)21天；固體培養(yǎng)條件溫度25±1℃，暗培養(yǎng)；液體培養(yǎng)條件搖床轉(zhuǎn)速100rpm/min、培養(yǎng)瓶為150ml的三角錐形瓶、裝液量30ml、接種量1g，溫度25±1℃、暗培養(yǎng)；在液體與固體培養(yǎng)的交替繼代接種時(shí)，在超凈工作臺(tái)上將高兒茶素含量和低兒茶素含量的茶愈傷組織逐一編號(hào)后用手術(shù)刀一分為二，取其中的一半放入事先裝有5ml1％香草醛鹽酸試劑的試管中，顯色10分鐘，將對(duì)應(yīng)的另一半分別進(jìn)行繼代培養(yǎng)；如此反復(fù)循環(huán)，至少4個(gè)循環(huán)，獲得高兒茶素含量和低兒茶素含量的茶細(xì)胞系；所述高兒茶素含量的茶細(xì)胞系，1％香草醛鹽酸試劑活體快速顯色后呈現(xiàn)深紅色；茶細(xì)胞系的兒茶素含量達(dá)到每克干重7.7689毫克以上；所述低兒茶素含量的茶細(xì)胞系，1％香草醛鹽酸試劑活體快速顯色后呈現(xiàn)淺紅色；茶細(xì)胞系的兒茶素含量達(dá)到每克干重0.1272毫克以下；(4)含不同兒茶素組分的茶細(xì)胞系篩選將高兒茶素含量和低兒茶素含量的茶愈傷組織分別接種到液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)21天，接著再分別接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)21天；固體培養(yǎng)條件溫度25±1℃，暗培養(yǎng)；液體培養(yǎng)條件搖床轉(zhuǎn)速100rpm/min、培養(yǎng)瓶為150ml的三角錐形瓶、裝液量30ml、接種量1g，溫度25±1℃、暗培養(yǎng)；在液體與固體培養(yǎng)的交替繼代接種時(shí)，將高兒茶素含量和低兒茶素含量的茶愈傷組織的一半分別進(jìn)行兒茶素組分的薄層層析檢測(cè)，將對(duì)應(yīng)的另一半分別進(jìn)行繼代培養(yǎng)；如此反復(fù)循環(huán)，至少4個(gè)循環(huán)；獲得兩種以上含六種兒茶素組分和六種以下兒茶素組分的茶細(xì)胞系；薄層層析檢測(cè)操作步驟如下A.制備茶細(xì)胞系兒茶素提取液對(duì)兩種以上含六種兒茶素組分和六種以下兒茶素組分的茶細(xì)胞系分別制備茶細(xì)胞系兒茶素提取液；取含六種兒茶素組分和六種以下兒茶素組分的茶細(xì)胞系3g，加少許石英砂，液氮研磨至粉碎，加3ml95％乙醇研磨，4000g離心，吸取上清液，沉淀加3ml95％乙醇，再次離心，此法重復(fù)三次，最后95％乙醇定容至10ml；將上述得到的10ml乙醇溶液，蒸干去除乙醇，再用熱水溶解，再用等量乙酸乙酯萃取3次，取有機(jī)相濃縮干燥，用1ml甲醇定容；甲醇定容溶液用孔徑為0.45μm有機(jī)膜過(guò)濾，得兩種以上兒茶素提取液；B.薄層層析檢測(cè)分別對(duì)兩種以上兒茶素提取液進(jìn)行薄層層析檢測(cè)；將兒茶素提取液點(diǎn)樣于2.5*10硅膠GF-254板上，25℃下展層2～3h，展開(kāi)劑接近硅膠板上端后取出硅膠板晾干，硅膠板經(jīng)過(guò)1％香蘭素鹽酸溶液噴霧顯色，吹風(fēng)機(jī)吹干后，立刻觀察拍照；所述含六種兒茶素組分的茶細(xì)胞系，其兒茶素提取液，在展層后的硅膠板上，經(jīng)過(guò)1％g/v香蘭素鹽酸溶液噴霧顯色，呈現(xiàn)四個(gè)紅色條帶；高效液相色譜檢測(cè)含有表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素、沒(méi)食子兒茶素、兒茶素和表兒茶素六種兒茶素；所述含六種以下兒茶素組分的茶細(xì)胞系，其兒茶素提取液，在展層后的硅膠板上，經(jīng)過(guò)1％香蘭素鹽酸溶液噴霧顯色，呈現(xiàn)四個(gè)以下紅色條帶；高效液相色譜檢測(cè)含有表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素、沒(méi)食子兒茶素、兒茶素和表兒茶素六種兒茶素中的五種以下；所述固體培養(yǎng)基為在1LB5培養(yǎng)基中加入2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg、激動(dòng)素0.1mg、瓊脂8g和蔗糖30g；pH為5.5；所述液體培養(yǎng)基為在1LB5培養(yǎng)基中加入2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg、激動(dòng)素0.1mg和蔗糖30g；pH為5.5。全文摘要本發(fā)明涉及茶樹(shù)含不同兒茶素含量及組分的細(xì)胞系篩選方法，解決了篩選技術(shù)中茶樹(shù)愈傷組織或細(xì)胞系中兒茶素含量及組分檢測(cè)所需時(shí)間較長(zhǎng)，操作復(fù)雜的問(wèn)題。本發(fā)明包括茶愈傷組織誘導(dǎo)與繼代、含不同兒茶素含量的愈傷組織篩選、含不同兒茶素含量的細(xì)胞系篩選、含不同兒茶素組分的細(xì)胞系篩選4道操作步驟。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了含不同兒茶素含量或組分的細(xì)胞系的篩選；能在5-10分鐘的短時(shí)間內(nèi)顯示愈傷組織的兒茶素含量的差異，因此其最大優(yōu)點(diǎn)是可以在轉(zhuǎn)接繼代的操作過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行兒茶素檢測(cè)；茶樹(shù)細(xì)胞系兒茶素組分的薄層層析鑒定，可一次分析多個(gè)樣品，另外，薄層層析鑒定還可以發(fā)現(xiàn)新的成分，從而加快了含不同兒茶素含量和含不同兒茶素組分的細(xì)胞系的篩選速度。文檔編號(hào)G01N30/02GK101498703SQ20091011619公開(kāi)日2009年8月5日申請(qǐng)日期2009年2月12日優(yōu)先權(quán)日2009年2月12日發(fā)明者劉亞軍,濤夏,高麗萍申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)