專(zhuān)利名稱(chēng)：茶樹(shù)dxr基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于茶樹(shù)基因工程領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及茶樹(shù)I-脫氧-D-木酮糖-5-憐酸還原異構(gòu)化酶(1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase, DXR)基因的分離和分析，還涉及通過(guò)調(diào)節(jié)該基因表達(dá)強(qiáng)度達(dá)到控制茶葉萜類(lèi)物質(zhì)含量。
背景技術(shù)：
萜類(lèi)物質(zhì)是由五個(gè)碳原子的異戊二烯單元組裝和衍生而成的一大類(lèi)化合物，可分為半萜、單萜、倍半萜、雙萜、三萜、四萜和多萜等。半萜為I個(gè)異戊二烯單元組成的5碳化合物，單萜為2個(gè)異戊二烯單元組成的10碳化合物，如檸檬烯、薄荷醇、樟腦、冰片、桉樹(shù)醇、菔烯、芳樟醇、香葉醇、橙花醇等；倍半萜為3個(gè)異戊二烯基單元組成的15碳化合物，如法尼烯、青蒿素、除蟲(chóng)菊內(nèi)酯、紅沒(méi)藥醇、橙花叔醇等；雙萜為4個(gè)異戊二烯單元組成的20碳化合 物，如赤霉素、紫杉醇、丹參酮、銀杏內(nèi)酯、葉綠醇等；三萜為6個(gè)異戊二烯單元組成的30碳化合物，如植物留醇、油菜素類(lèi)留醇等；四萜為8個(gè)異戊二烯單元組成40碳化合物，如類(lèi)胡蘿卜素等。植物萜類(lèi)生物合成有兩條重要途徑，即甲羥戊酸(MVA)途徑和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)或I-脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途徑。MVA合成途徑在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，該途徑中，3個(gè)乙酰Cok在酶的催化下，縮合生成3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA(HMG-CoA)，之后還原成MVA，后者經(jīng)多步生物催化反應(yīng)，相繼生成萜類(lèi)物質(zhì)合成直接前體異戊烯基焦磷酸(IPP)、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，并縮合成15碳的法尼基焦磷酸(FPP)，之后進(jìn)一步生成具有奇數(shù)個(gè)異戊二烯基骨架的萜類(lèi)。MEP途徑在質(zhì)體進(jìn)行中，該途徑中，前體物質(zhì)丙酮酸和甘油醛-3-磷酸在脫氧木酮糖合酶催化下形成DXP，并經(jīng)I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)催化生成MEP，之后在羥甲基丁烯基焦磷酸還原酶作用下形成IPP和DMAPP，并經(jīng)櫳牛兒基焦磷酸合酶(GPS)和櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合酶(GGPS)催化生成櫳牛兒基焦磷酸(GPP)和櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸(GGPP)，最后在單萜合酶和雙萜合酶的作用形成單萜、雙萜等具有偶數(shù)異戊二烯基骨架的萜類(lèi)。此外，這兩條合成途徑也不是截然分開(kāi)的，有些中間產(chǎn)物可以相互交換。萜類(lèi)物質(zhì)在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著多種重要作用。葉綠醇和類(lèi)胡蘿卜素是光合器官中的重要化合物，赤霉素、油菜素類(lèi)是重要的植物生長(zhǎng)激素，除蟲(chóng)菊內(nèi)酯、薄荷醇、樟腦等是植物體內(nèi)抗蟲(chóng)祛病的防御性物質(zhì)，留醇是植物細(xì)胞膜的重要組分。同時(shí)，多種萜類(lèi)物質(zhì)具有良好芳香特性以及抗菌和抗腫瘤效果，在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域均具有巨大的應(yīng)用前景。萜類(lèi)及其衍生物不僅是茶樹(shù)正常生命活動(dòng)的重要參與者，也是茶樹(shù)應(yīng)對(duì)病蟲(chóng)侵害、機(jī)械損傷等不利因素的關(guān)鍵防御性化合物，同時(shí)也是主要的茶葉香氣組分，如何通過(guò)現(xiàn)代分子生物學(xué)手段改變茶樹(shù)組織中的萜類(lèi)物質(zhì)含量具有很高理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種茶樹(shù)DXR的基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)，通過(guò)調(diào)節(jié)該基因表達(dá)可控制茶樹(shù)葉片中的萜類(lèi)物質(zhì)含量。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種茶樹(shù)DXR基因，其具有SEQ ID No:l所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了上述DXR基因編碼的蛋白質(zhì),其具有SEQ ID NO 2所不的氣基酸序列。本發(fā)明還提供了上述DXR基因用途通過(guò)調(diào)節(jié)該DXR基因表達(dá)強(qiáng)度從而達(dá)到控制茶葉萜類(lèi)物質(zhì)含量。作為本發(fā)明的茶樹(shù)DXR基因的用途的改進(jìn)調(diào)節(jié)DXR基因表達(dá)方法為以下任意一種將茶樹(shù)葉片在采摘前(例如為采摘前的8 36小時(shí))對(duì)葉片沿側(cè)脈方向進(jìn)行劃傷處 理，在茶葉制作過(guò)程的攤青工藝中增加能使茶葉產(chǎn)生一定程度損傷的搖青工藝，采用雙鏈干涉技術(shù)使DXR基因表達(dá)受抑制。提高本發(fā)明所述的DXR基因的表達(dá)可顯著提高茶樹(shù)葉片萜類(lèi)物質(zhì)含量，抑制該基因表達(dá)，可顯著降低茶樹(shù)葉片萜類(lèi)物質(zhì)含量。本發(fā)明主要針對(duì)如何改變茶樹(shù)葉片萜類(lèi)物質(zhì)含量這一技術(shù)問(wèn)題，通過(guò)對(duì)茶樹(shù)機(jī)械損傷葉片和健康葉片差異基因篩選和克隆，以及基因表達(dá)活性與葉片萜類(lèi)物質(zhì)含量相關(guān)性研究，明確本發(fā)明基因表達(dá)活性變化與茶樹(shù)葉片萜類(lèi)物質(zhì)含量之間的關(guān)系。為通過(guò)調(diào)節(jié)該基因表達(dá)活性進(jìn)行茶樹(shù)萜類(lèi)物質(zhì)積累控制創(chuàng)造了條件，同時(shí)也為通過(guò)基因工程手段進(jìn)行高香、高抗茶樹(shù)新材料的創(chuàng)制奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明是采用了以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)采用抑制性消減雜交(suppressionsubtractive hybridization, SSH)和RACE技術(shù)分離了與茶樹(shù)機(jī)械損傷響應(yīng)相關(guān)的DXR基因，其具有SEQ ID No I所不的核昔酸序列；提供一種茶樹(shù)DXR全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)序列,其具有如SEQ ID No 2所示序列。本發(fā)明還提供了 DXR基因表達(dá)特性與茶樹(shù)葉片萜類(lèi)物質(zhì)含量的關(guān)系，證明通過(guò)調(diào)節(jié)DXR基因表達(dá)活性可以調(diào)控茶樹(shù)葉片萜類(lèi)物質(zhì)含量。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下一、茶樹(shù)DXR基因分離和分析在茶園中，將同一品種生長(zhǎng)勢(shì)一致的新梢分成兩組，一組以鋒利刀片沿側(cè)脈方向?qū)θ~片進(jìn)行劃傷處理，另一組為對(duì)照(不劃傷)。于劃傷處理6h采集劃傷葉片，同時(shí)采摘對(duì)照新梢上相同嫩度的葉片。分別置于液氮中充分研磨后，以TRIZOL (Invitrogen公司)提取總RNA，并以UNIQ-10柱式mRNA抽提純化試劑盒(上海生工生物工程有限公司)處理，分別獲得劃傷和對(duì)照葉片的mRNA樣本。分別以劃傷處理和對(duì)照的2Pg mRNA為起始物，采用PCR-Select cDNA Subtraction Kit (Clontech Laboratories, Inc)進(jìn)行雙鏈 cDNA 合成、酶切、接頭連接、消減雜交和擴(kuò)增，具體操作參照該試劑盒使用說(shuō)明，獲得在劃傷葉片中上調(diào)表達(dá)的差異基因片段，插入TaKaRa pMD 18_T Vector(寶生物工程(大連)有限公司)，并轉(zhuǎn)化JM109 (寶生物工程(大連)有限公司)感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白斑擴(kuò)增，以M13通用引物(序列如SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4所示)進(jìn)行菌液PCR，將有插入片段的陽(yáng)性克隆，委托上海英維捷基公司進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)與美國(guó)國(guó)家生物信息中心NCBKhttp://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)提供的Blastn工具在線比對(duì)發(fā)現(xiàn),其中有I條長(zhǎng)835bp的差異片段與葡萄(Vitis vinifera)和海島棉(Gossypium barbadense) DXR基因有85%以上的同源性。根據(jù)獲得的835bp的序列，設(shè)計(jì)了 5’端RACE序列特異性引物SEQ ID No: 5和SEQID No:6(預(yù)計(jì)產(chǎn)物長(zhǎng)度約870bp)、以及3’端RACE序列特異性引物SEQ ID No:7和SEQ IDNo:8 (預(yù)計(jì)產(chǎn)物長(zhǎng)度為530bp)，以上述劃傷葉片的mRNA為起始物，采用TaKaRa 5’ -FullRACE Core Set、TaKaRa 3' -Full RACE Core Set 和 TaKaRa Taq (寶生物工程(大連)有限公司)進(jìn)行DXR基因5’端和3’端序列克隆(具體操作參照試劑盒使用說(shuō)明)，對(duì)獲得的5’ RACE 和 3’ RACE 產(chǎn)物進(jìn)行 I. 5% 瓊脂糖凝膠電泳，以 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit (寶生物工程(大連)有限公司)對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行割膠純化,將純化的目標(biāo)條帶插入TaKaRa pMD 18_T Vector，并轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白斑擴(kuò)增，以M13通用引物(序列如SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4所示)進(jìn)行菌液PCR，將有插入片段的陽(yáng)性克隆，委托上海英維捷基公司進(jìn)行測(cè)序，獲得了 5’端880bp (與中間片段重疊區(qū)長(zhǎng)116)的RACE產(chǎn)物和3’端536bp (與中間片段的重疊區(qū)長(zhǎng)152bp)的RACE產(chǎn)物，經(jīng)與NCBI已知序列比對(duì)，上述序列與葡萄等植物DXR基因的5’端和3’端高度同源。以DNAStar包中SeqMan軟件(DNASTAR，Inc.)對(duì)獲得茶樹(shù)DXR基因5’端、中間序列和3’端 序列進(jìn)行拼接，得到了茶樹(shù)DXR基因全長(zhǎng)序列。該基因長(zhǎng)1983bp，如SEQ ID No :I所示，具有1419bp(255th -1673th)的開(kāi)放閱讀框，編碼472個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，如SEQ ID No 2所示。經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn),茶樹(shù)DXR氨基酸序列與葡萄(Vitis vinifera)和橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis) DXR基因有90%的一致性和94%以上的相似性。證明在劃傷葉中高表達(dá)的差異序列為茶樹(shù) DXR 基因。根據(jù) PredictProtein (http://www. predictprotein. org/)分析顯示，茶樹(shù)DXR為膜結(jié)合蛋白，定位于葉綠體(質(zhì)體)中，屬于DXR超家族。研究發(fā)現(xiàn)，DXR能夠催化DXP分子內(nèi)碳骨架重排和中間體2-C赤蘚糖磷酸Cl位置發(fā)生輔酶II (NADPH)依賴(lài)的還原反應(yīng)，生成MEP。該反應(yīng)是質(zhì)體萜類(lèi)合成途徑上最重要的限速反應(yīng)之一，也是萜類(lèi)物質(zhì)代謝工程最重要的靶點(diǎn)之一。轉(zhuǎn)基因研究顯示，在植物中超量表達(dá)DXR基因，可以增加植物中萜類(lèi)物質(zhì)積累，提高植物對(duì)病蟲(chóng)等侵害所弓I起的機(jī)械損傷的抵御能力。由此可見(jiàn)，刀片劃傷后茶樹(shù)葉片中DXR基因表達(dá)上調(diào)是機(jī)體對(duì)機(jī)械損傷所起的一種應(yīng)激反應(yīng)之一，可能是茶樹(shù)在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的抵御昆蟲(chóng)取食等的防衛(wèi)機(jī)制。二、DXR基因表達(dá)強(qiáng)度與茶樹(shù)葉片萜類(lèi)物質(zhì)積累關(guān)系分析根據(jù)上述獲得的茶樹(shù)DXR基因序列，采用DNAStar軟件包(DNAStar Inc.)中PrimerSelect設(shè)計(jì)表達(dá)引物，序列如SEQ ID No: 9和SEQ ID No : 10所示(預(yù)計(jì)產(chǎn)物長(zhǎng)度 354bp),同時(shí)以茶樹(shù)肌動(dòng)蛋白(Actin, ACT)基因(http:IIwm. ncbi. nlm. nih. rov/nuccore/FJ355923)為參比基因，設(shè)計(jì)用于ACT基因表達(dá)的引物，序列如SEQ ID No: 11和SEQ ID No 12所示(預(yù)計(jì)產(chǎn)物344bp)。例如于4月初，以適制綠茶、烏龍茶和紅茶的茶樹(shù)品種為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，選擇長(zhǎng)至I芽3葉左右的新梢，用鋒利的刀片將展開(kāi)的葉片沿側(cè)脈方向進(jìn)行劃傷處理，在劃傷處理后8-36h采摘上述刀片劃傷的I芽3葉新梢，同時(shí)收集上述品種同等嫩度的未經(jīng)劃傷處理的I芽3葉新梢為對(duì)照。取少量刀片劃傷處理和對(duì)照新梢的芽下第二葉置于-70°C冰箱保存，用于DXR基因表達(dá)強(qiáng)度研究；剩余樣品經(jīng)蒸汽殺青固定后，于80°C條件下烘干磨碎，用于萜類(lèi)含量分析。從冰箱中取出收集的樣品，分別提取這些品種總RNA，合成cDNA第一鏈，采用設(shè)計(jì)的表達(dá)引物進(jìn)行RT-PCR，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和目的條帶光密度分析，并以DXR基因目的條帶光密度與參比ACT基因目的條帶光密度之比作為DXR基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度，結(jié)果顯示，不同品種新梢經(jīng)刀片劃傷后，葉片中DXR基因相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度均顯著高于同品種的對(duì)照葉片。說(shuō)明DXR基因表達(dá)上調(diào)是茶樹(shù)對(duì)機(jī)械損傷的一種普遍應(yīng)激響應(yīng)之一，兩者之間存在因果關(guān)聯(lián)關(guān)系。同時(shí)對(duì)收集的蒸汽固定烘干樣品，采用連續(xù)蒸餾萃取法進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)制備，并以GC/MS方法進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)分析，結(jié)果顯示，不同品種劃傷處理均表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，即劃傷處理的茶葉中(Z)-2-戊烯-I-醇、順-2，6- 二甲基-2，6-辛二烯、D-檸檬烯、3，7- 二甲基-1，3，6-辛三烯、2，6- 二甲基-1，3，5，7-辛四烯、丁香醛D、法尼烯、雪松醇、α -蓽澄茄油烯、植醇以及萜類(lèi)物質(zhì)總量均顯著高于對(duì)照。說(shuō)明劃傷處理后引起茶樹(shù)DXR基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而使萜類(lèi)物質(zhì)積累增加。進(jìn)一步的，將采收的適制烏龍茶的茶樹(shù)品種對(duì)夾三、四葉原料，分成2組，一組采用普通攤青作為對(duì)照；另一組在攤青2h后采用搖青機(jī)進(jìn)行搖青(搖青是烏龍茶的一種特有制作工序，主要目的是通過(guò)搖青機(jī)的作用使茶葉與器具表面、茶葉與茶葉之間進(jìn)行摩擦，并造成茶葉一定程度的損傷，進(jìn)而形成烏龍茶特有的香氣)，搖青轉(zhuǎn)速10-15rpm,時(shí)間5飛min,之后采用常規(guī)方式攤青，搖青后攤放O. 5h進(jìn)行取少量樣品，冷藏于-70°C冰箱用作DXR基 因表達(dá)分析。至攤青總時(shí)間達(dá)到16h后，將搖青處理葉和普通攤青對(duì)照葉進(jìn)行蒸汽殺青固定，并于80°C條件下烘干，用于萜類(lèi)含量分析。采用TRIZOL法提取冷藏樣品的總RNA，合成cDNA第一鏈，采用設(shè)計(jì)的表達(dá)引物進(jìn)行RT-PCR，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和目的條帶光密度分析，并以DXR基因目的條帶光密度與參比ACT基因目的條帶光密度之比作為DXR基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度，結(jié)果顯示，搖青處理葉片中DXR基因相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度顯著高于對(duì)照。對(duì)收集的蒸汽固定烘干樣品，采用連續(xù)蒸餾萃取法進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)制備，并以GC/MS方法進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)分析，結(jié)果顯示，搖青處理樣品中3-戊烯醛、(Z)-2-戊烯-I-醇、D-檸檬烯、3，7- 二甲基-1，3，7-辛三烯、香葉醇、2-癸烯醛、2，4-癸二烯醛、紫羅酮、α -法尼烯、橙花叔醇、植醇等萜類(lèi)物質(zhì)及其總量顯著高于對(duì)照。說(shuō)明搖青處理引起新梢機(jī)械損傷，進(jìn)而引起茶樹(shù)DXR基因表達(dá)上調(diào)，致使樣品中萜類(lèi)物質(zhì)含量增加。備注說(shuō)明搖青處理組為攤青2h+搖青5min+攤放13h 55min (總共時(shí)間是16h),在搖青后攤放O. 5h取樣，茶樹(shù)DXR基因在搖青處理后的短時(shí)間內(nèi)，表達(dá)量差異不大，之后隨放置時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)強(qiáng)度增加，到O. 5h后其表達(dá)量已經(jīng)顯著超過(guò)對(duì)照，如果進(jìn)一步延長(zhǎng)時(shí)間，其表達(dá)量會(huì)慢慢降低。對(duì)照組只采用攤青方法,其總的攤青時(shí)間也是16h,在攤后2h 35min時(shí)也進(jìn)行表達(dá)用少量樣品的取樣。在此基礎(chǔ)上，采用DNAStar包中的PrimerSelect設(shè)計(jì)了用于DXR基因雙鏈干涉載體構(gòu)建的引物對(duì)，序列如SEQ ID No:13和SEQ IDNo : 14所示，在SEQ ID No:13的5’端包含了限制性?xún)?nèi)切酶XbaI (TCTAGA)與AscI的酶切位點(diǎn)(GGCGCGCC)和兩個(gè)保護(hù)性堿基(AA)，在SEQ IDNo 14的5’端包含BamHI (GGATCC)與SwaI的酶切位點(diǎn)(ATTTAAAT)和兩個(gè)保護(hù)性堿基(AA)，該引物對(duì)目的產(chǎn)物為位于SEQ ID No 1中第716位至1172位之間的457bp長(zhǎng)的片段。以上述提取的總RNA為起始物，采用上述相同的方法進(jìn)行RT-PCR，電泳后，以TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit膠純化試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)對(duì)目的條帶進(jìn)行割膠純化，將純化的目標(biāo)條帶插入TaKaRa pMD 18_T Vector (寶生物工程(大連)有限公司)，并轉(zhuǎn)化TGl感受態(tài)大腸桿菌(上海超研生物科技有限公司)，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和擴(kuò)增。以M13通用引物(序列如SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4所示)進(jìn)行菌液PCR，將有插入片段的陽(yáng)性克隆，委托上海英維捷基公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，獲得該片段與SEQID No :1第716位至1172位之間的457bp完全一致。將上述陽(yáng)性克隆在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增，以UNIQ-IO柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒(上海生工生物有限公司)提取上述陽(yáng)性克隆中的含DXR基因片段的質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒命名為pMD 18-T-DXR。分別以組合酶AscI和SwaI (NewEngland BioLabs)、以及組合酶BamHI 和 XbaI (New England BioLabs)對(duì)pMD 18-T_DXR質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，經(jīng)過(guò)電泳，以膠純化試劑盒分別回收含DXR的目的片段，并正向(AscI和SwaI組合酶切產(chǎn)物)和反向(BamHI和XbaI組合酶切產(chǎn)物)插入雙鏈干涉表達(dá)載體pFG5941 (美國(guó)擬南芥生物信息中心)，構(gòu)建完成含DXR雙鏈干涉基因的重組pFG5941[可參考張廣輝，梁月榮，陸建良，董俊杰.茶葉科學(xué)，2006，26 (4) :246-248]。經(jīng)上海英維捷基公司測(cè)序，目的序列已經(jīng)正確插入。將構(gòu)建完成的載體命名為PFG5941-DXR。采用凍融交替法[可參考Hofgen R，Willmitzer L. Nucleic acid Research,1988,16(20) :9877.]，將pFG5941_DXR導(dǎo)入野生發(fā)根農(nóng)桿菌15834，獲含雙鏈DXR干涉基因的重組發(fā)根農(nóng)桿菌。將擴(kuò)繁至0D600為O. 5^0. 8的重組農(nóng)桿菌菌液侵染已培養(yǎng)6(T70 d苗齡的“浙農(nóng)25”無(wú)菌苗莖段1(T50 min,在添加100 mmol/L乙酰丁香酮的YMB固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2d，在含500 mg/L頭胞噻肟鈉·(上海生工生物有限公司)的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化[可參考張廣輝，梁月榮，陸建良.茶葉科學(xué)，2006，26 (I) :1-10]，獲得重組有DXR雙鏈干涉基因的“浙農(nóng)25”轉(zhuǎn)基因小植株。同時(shí)采用類(lèi)似方法，以不含雙鏈干涉DXR基因的野生農(nóng)桿菌15834侵染“浙農(nóng)25”莖段，獲得無(wú)雙鏈DXR干涉基因的“浙農(nóng)25”品種的對(duì)照小植株。以刀片劃傷含DXR雙鏈干涉基因小植株以及無(wú)DXR雙鏈干涉基因的對(duì)照小植株上的葉片，8h后取葉片樣品，一部分樣品經(jīng)液氮研磨后，以TriZOL提取總RNA，以SEQ ID No 9和SEQ ID No : 10 (DXR基因表達(dá)引物)、以及SEQ ID No : 11和SEQ ID No 12 (ACT參照基因表達(dá)引物)為引物對(duì)，以RT-PCR方法進(jìn)行DXR基因表達(dá)強(qiáng)度分析，結(jié)果顯示，含干涉DXR基因的小植株內(nèi)源DXR基因相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度僅為對(duì)照20%左右；剩余樣品經(jīng)液氮研磨后，以乙醚提取葉片中揮發(fā)性物質(zhì)，經(jīng)GC/MS分析，結(jié)果顯示，含干涉DXR基因的轉(zhuǎn)基因小植株葉片萜類(lèi)物質(zhì)總量?jī)H為對(duì)照25%左右。說(shuō)明采用轉(zhuǎn)基因手段，將DXR干涉基因?qū)氩铇?shù)組織后，轉(zhuǎn)基因茶樹(shù)葉片中的內(nèi)源DXR表達(dá)受到抑制，萜類(lèi)物質(zhì)積累也顯著下降，茶樹(shù)DXR基因的表達(dá)強(qiáng)度與萜類(lèi)物質(zhì)的積累存在顯著的相關(guān)關(guān)系。由此可見(jiàn)，通過(guò)調(diào)節(jié)DXR基因表達(dá)強(qiáng)度，可以顯著影響茶樹(shù)樣品中的萜類(lèi)物質(zhì)含量。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖I劃傷處理后不同茶樹(shù)品種葉片DXR基因表達(dá)變化圖；圖I中ACT為茶樹(shù)肌動(dòng)蛋白參比基因，DXR為茶樹(shù)I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)化酶基因，泳道I和2分別為品種“毛蟹”對(duì)照和刀片劃傷樣品、泳道3和4分別為品種“浙農(nóng)113”對(duì)照和刀片劃傷樣品、泳道5和6分別為品種“浙農(nóng)25”對(duì)照和刀片劃傷樣品；
圖2是搖青處理對(duì)茶樹(shù)葉片DXR基因表達(dá)的影響圖；圖2中ACT為茶樹(shù)肌動(dòng)蛋白參比基因，DXR為茶樹(shù)I-脫氧_D_木酮糖_5_磷酸還原異構(gòu)化酶基因，泳道I為常規(guī)攤青對(duì)照，泳道2為搖青處理。圖3 DXR雙鏈基因干涉表達(dá)載體PFG5941-DXR的示意圖；圖3中DXR為正向插入的茶樹(shù)DXR基因片段、rDXR為反向插入的茶樹(shù)DXR基因片段，AscI, SwaI, BamHI和XbaI分別為酶切位點(diǎn)，KMr為抗卡那霉素基因，LB為左邊界，MAS為甘露堿合成酶基因，BARlr為抗除草劑基因，Mas I’ promoter為Mas I’啟動(dòng)子，CaMV 35Spromoter為花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子，intron為矮牽牛查爾酮合成酶基因內(nèi)含子，OCS為章魚(yú)堿合成酶，RB為右邊界。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例I在茶園中，將生長(zhǎng)勢(shì)一致的“福鼎大白茶”新梢分成兩組，一組以鋒利刀片沿側(cè)脈方向?qū)θ~片進(jìn)行劃傷處理，每張葉片劃四次，另一組為對(duì)照(不劃傷)。于劃傷處理6h采集劃傷葉片，同時(shí)采摘對(duì)照新梢上相同嫩度的葉片，分別置于液氮中充分研磨后，以TRIZOL(Invitrogen公司)提取總RNA，并以UNIQ-IO柱式mRNA抽提純化試劑盒(上海生工生物工程有限公司)處理，分別獲得劃傷處理和對(duì)照葉片的mRNA樣本。分別以劃傷處理和對(duì)照的2M-g mRNA 為起始物，米用 PCR-Select cDNA Subtraction KitCClontech Laboratories,Inc)進(jìn)行雙鏈cDNA合成、酶切、接頭連接、消減雜交和擴(kuò)增，具體操作參照該試劑盒使用說(shuō)明，獲得在劃傷葉片中上調(diào)表達(dá)的差異基因片段，插入TaKaRa pMD 18_T Vector(寶生物工程(大連)有限公司)，并轉(zhuǎn)化JM109 (寶生物工程(大連)有限公司)感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白斑，轉(zhuǎn)接于Iml液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)12h ;取菌液100 μ I于新離心管中，6000rpm離心2min，棄上清后，加20 μ I重蒸去離子水(ddH20)稀釋?zhuān)米鼍篜CR模板。以M13通用引物(序列如SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4所示)進(jìn)行菌液PCR，PCR反應(yīng)液配制和程序設(shè)置如下表I所示。表I
權(quán)利要求
1.茶樹(shù)DXR基因，其特征是具有SEQID No : I所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求I所述的茶樹(shù)DXR基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征是具有SEQID NO 2所示的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求I所述的茶樹(shù)DXR基因的用途，其特征是通過(guò)調(diào)節(jié)該DXR基因表達(dá)強(qiáng)度從而達(dá)到控制茶葉萜類(lèi)物質(zhì)含量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的茶樹(shù)DXR基因的用途，其特征是調(diào)節(jié)DXR基因表達(dá)方法為以下任意一種 將茶樹(shù)葉片在采摘前對(duì)葉片沿側(cè)脈方向進(jìn)行劃傷處理， 在茶葉制作過(guò)程的攤青工藝中增加能使茶葉產(chǎn)生損傷的搖青工藝， 采用雙鏈干涉技術(shù)使DXR基因表達(dá)受抑制。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種茶樹(shù)DXR基因，其具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了上述茶樹(shù)DXR基因編碼的蛋白質(zhì)，其具有SEQ ID NO2 所示的氨基酸序列。 本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了上述茶樹(shù)DXR基因的用途通過(guò)調(diào)節(jié)該DXR基因表達(dá)強(qiáng)度從而達(dá)到控制茶葉萜類(lèi)物質(zhì)含量。調(diào)節(jié)DXR基因表達(dá)方法為以下任意一種將茶樹(shù)葉片在采摘前對(duì)葉片沿側(cè)脈方向進(jìn)行劃傷處理，在茶葉制作過(guò)程的攤青工藝中增加能使茶葉產(chǎn)生損傷的搖青工藝，采用雙鏈干涉技術(shù)使DXR基因表達(dá)受抑制。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102899341SQ201210239518
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月11日
發(fā)明者陸建良, 甘泉, 徐燕, 范方媛, 李娜娜, 鄭新強(qiáng), 梁月榮 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)