專利名稱：狀黃姑魚細(xì)菌性爛鰓病的預(yù)警方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)動(dòng)物疾病的預(yù)警方法，尤其涉及鯢狀黃姑魚細(xì)菌性爛鰓病 的預(yù)警方法。
背景技術(shù)：
鯢狀黃姑魚(M6ra to7c/ /Wo^m Chu Lo&Wu)隸屬于石首魚科黃姑魚屬，閩、 粵沿海漁民俗稱鯢鱸，體重可達(dá)25至30kg，肉味鮮美，魚鰾還具有藥用價(jià)值，暢 銷于國際市場。鯢狀黃姑魚主要采用的是海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的方法，娩狀黃姑魚雖然抗 病能力較強(qiáng)，但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，其發(fā)生疾病的問題也日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)殖 戶造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。有效地防治細(xì)菌性魚病是提高生產(chǎn)經(jīng)營效益的必要措 施。細(xì)菌性魚病對魚類養(yǎng)殖業(yè)危害廣，威脅嚴(yán)重。由于魚類生活在水中，直觀性不 及陸上動(dòng)物；水又是很好的媒介體，病菌的傳染較空氣中更為容易，因此預(yù)防工作 十分重要，尤其是監(jiān)測健康魚及病菌攜帶者，是有效防治魚病的關(guān)鍵。娩狀黃姑魚 的細(xì)菌性爛鰓病的病原為桿狀細(xì)菌，主要表現(xiàn)癥狀為病魚體色發(fā)黑，游動(dòng)緩慢，外 界刺激反應(yīng)遲鈍，食欲減退，魚體消瘦。捕起病魚觀察，可見病魚鰓蓋內(nèi)表皮膚充 血發(fā)炎，鰓絲粘液增多、腫脹，部分呈淡紅色，淤血處呈紫紅色，并可見小出血點(diǎn)。 池水溫達(dá)到25至3(TC時(shí)，易發(fā)生此病，各生長階段魚均有發(fā)生，發(fā)病率約5%至10%。 迅速、準(zhǔn)確地診斷該魚病，檢測出細(xì)菌病原，是有效防治的關(guān)鍵。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種人工養(yǎng)殖娩狀黃姑魚細(xì)菌性爛鰓病發(fā)生 的預(yù)警方法，達(dá)到提前預(yù)知，及時(shí)采取必要手段進(jìn)行預(yù)防和處理以達(dá)到避免重大經(jīng)濟(jì) 損失的目的。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為娩狀黃姑魚細(xì)菌性爛鰓病的預(yù)警 方法，其具有以下步驟①制備熒光抗體取患病魚的血清加入佐劑，注射到體重為2kg至3kg的兔體 內(nèi)，制備兔抗魚血清抗體，并用熒光色素對抗體進(jìn)行標(biāo)記，得到標(biāo)記溶液待用；② 純化熒光抗體首先將步驟①的標(biāo)記溶液用透析法除去該標(biāo)記溶液中游離的 熒光素，再采用纖維素過柱法除去過度標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子，將純化產(chǎn)物冷凍保存；③ 檢測選取待測標(biāo)的物，并將待測標(biāo)的物鋪設(shè)載玻片表面固定；將上述固定有 待測標(biāo)的物的載玻片上滴加步驟②純化產(chǎn)物。為優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的措施還包括待測標(biāo)的物為鯢狀黃姑魚的血清液或體表粘液或鰓絲片段。佐劑的成分按照體積份數(shù)含有羊毛脂1份、石臘油2份至9份。 佐劑的混勻?yàn)槿闈嵋?，并?jīng)高溫滅菌；佐劑還含有3mg/ml至4mg/ml的卡介苗。 在步驟①中，熒光色素為異硫氰酸熒光素；標(biāo)記的步驟包括用pH9.5碳酸鹽緩沖液將純抗體液稀釋至20mg/ml，得到蛋白液；再按質(zhì)量份數(shù)異硫氰酸熒光素1分、抗體20份至IOO份稱取異硫氰酸熒光素，并用pH9.5碳酸鹽緩沖液溶解，得到熒光素液；然后，混合蛋白液和熒光素液，用碳酸鈉溶液調(diào)整pH，使蛋白液和熒光素液的混合液的pH大于或等于9。在步驟②中，透析法的透析液采用0.01Mol/L pH7.6 PBS或生理鹽水；透析的溫度為3。C至5。C;透析的時(shí)間為4天至7天。在步驟②中，纖維素過柱法采用磷酸鹽緩沖液(PBS)液階梯洗脫，洗脫階梯數(shù)至少為4個(gè)。磷酸鹽緩沖液(PBS)液還含有0.05Mol/L至0.2Mol/L的NaCl。在步驟③中，固定的步驟為將鋪設(shè)有待測標(biāo)的物載玻片在火焰上通過3次；再放在密閉濕盒中，37。C恒溫30分鐘；然后用0.1Mol/L、 pH為8的磷酸鹽緩沖液(PBS)，最后冷風(fēng)吹干。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是通過熒光抗體的制備和純化可到大量的免疫熒光探針分子，成 本低廉，采用本發(fā)明的免疫熒光的檢測方法不僅能快速檢測病原，檢測的時(shí)間一般 不超過3h，為疾病的及時(shí)預(yù)警和防治贏得了寶貴的時(shí)間，而且該方法還能夠檢測到 帶菌狀態(tài)或未發(fā)病的被感染個(gè)體，在實(shí)踐中此類潛伏狀態(tài)更加具有風(fēng)險(xiǎn)。攜帶病原 的魚由于個(gè)體免疫性狀的差異性，如果其自身免疫力超出一般水平則可能終生不發(fā) 病，然而其具有傳播病原的風(fēng)險(xiǎn)。在免疫能力一般的魚接觸病原后，經(jīng)短時(shí)期的潛 伏就會(huì)大規(guī)模爆發(fā)，造成慘重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，定期采用本發(fā)明的方法檢測可能 具有細(xì)菌性爛鰓病病原的待測標(biāo)的物，以及時(shí)采取規(guī)避手段，在較低成本的前提下 能夠極大幫助養(yǎng)殖戶降低養(yǎng)殖風(fēng) 。而且，在制得免疫熒光探針分子后保存條件比較普通，檢測的操作也很方便，為本發(fā)明方法大量的推廣使用創(chuàng)造了有利條件。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。 實(shí)施例鯢狀黃姑魚細(xì)菌性爛鰓病的預(yù)警方法，具有以下步驟①制備熒光抗體取患病魚的血清加入佐劑，注射到體重為3kg的純種新西蘭 兔體內(nèi)，制備兔抗魚血清抗體，并用熒光色素對上述抗體進(jìn)行標(biāo)記，得到標(biāo)記溶液 待用。上述佐劑的成分按照體積份數(shù)含有羊毛脂1份、石臘油5份。佐劑配制方法按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻，高壓 滅菌，置4"下保存?zhèn)溆?。免疫前取等容積佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻 成乳濁液?？梢栽诿庖咔叭⌒枰孔魟┲萌槔徶醒心?，均勻后再邊磨邊滴加入等體積抗原液(其中加卡介苗4mg/ml或者不加入卡介苗)，加完后再繼續(xù)研磨成乳劑， 滴于冰水上5 10min內(nèi)完全不擴(kuò)散為止。為避免損失抗原，亦可用一注射器裝抗 原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來回反復(fù)抽吸，約 數(shù)十分鐘后即能完全乳化。檢查合格后即以其中 一注射器作注射用。取患細(xì)菌性爛鰓病的鯢狀黃姑魚的血清加入上述佐劑，注射到體重為3kg的純 種新西蘭兔體內(nèi)，制備家兔抗魚血清抗體，并用熒光色素iH己。制備家兔抗魚血清抗體首次注射劑量為300ug，加強(qiáng)免疫的劑量約為首次劑 量為1/4左右。每2周加強(qiáng)免疫一次。首次免疫時(shí)皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加強(qiáng) 免疫時(shí)不必注射百日咳疫苗。在第2次加強(qiáng)免疫后2周，從兔耳緣靜脈取血，制備 血清，用抑菌試驗(yàn)方式檢測抗體效價(jià)。如未達(dá)到預(yù)期效價(jià)，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直 到滿意時(shí)為止。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平時(shí)，即耳緣靜脈或耳動(dòng)脈取血。收集的血 液置于室溫下lh左右，凝固后，置4X:下，過夜析出血清，離心，4000rpm， 10min。 在無菌條件，吸出血清，加入熒光色素標(biāo)記抗體。上述熒光色素優(yōu)選為異硫氰酸熒光素；異硫氰酸熒光素常用的標(biāo)記法可用攪拌 法，步驟為a) 取一定量的抗體液，用0.5Mol/LpH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋至20mg/ml。b) 按熒光素與抗體質(zhì)量比一般用1: IOO稱取異硫氰酸熒光素，用pH9.5碳酸5鹽緩沖液溶解。C)將球蛋白液置于電磁攪拌器上，啟動(dòng)開關(guān)，輕輕攪拌，以不起沫為準(zhǔn)。逐 滴加入熒光素液(約10min 15min加完)。加完后，隨時(shí)用試紙測定攪拌液的pH 值，若低于9.0，則應(yīng)以碳酸鈉溶液調(diào)整。置4'C攪拌12h即可。② 純化熒光抗體首先將步驟①的標(biāo)記溶液用透析法除去該標(biāo)記溶液中游離的 熒光素，再采用纖維素過柱法除去過度標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子，將純化產(chǎn)物冷凍保存。標(biāo)記后溶液是一個(gè)混合體，它包括蛋白質(zhì)與熒光素的結(jié)合體，還有游離的熒光 素、游離的蛋白質(zhì)以及結(jié)合過多的蛋白質(zhì)。去除游離的熒光素將標(biāo)記好的抗體放入透析袋中于0.01Mol/L、 pH7.6的磷酸 鹽緩沖液(PBS)或生理鹽水中4匸透析5天，每天換液3次，直至透析液中無游 離色素為止。去除過度標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子用DEAE纖維素過柱。利用階梯洗脫進(jìn)行，具體方法如下a) 以0.01Mol/L pH 7.6 PBS液洗脫。b) 以0.01 Mol/L pH 7.6 PBS液(含有0.05Mol/L NaCl)洗脫。c) 以0.01 Mol/LpH7.6PBS (含有0.1Mol/LNaCl)洗脫。d) 以0.01 Mol/LPH7.6PBS (含有0.2Mol/LNaCl)洗脫。 收集每部分有熒光抗體的洗脫液管，于495nm測熒光素的OD值，再于280nm測蛋白的OD值，査標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出各管熒光素和蛋白質(zhì)的濃度，并計(jì)算出F/P比 值，濃縮后分裝小瓶備用。層析柱上滯留的過度標(biāo)記的蛋白質(zhì)，可以用1Mol/L的 NaCl洗脫。去除交叉反應(yīng)等非特異性染色因素非特異性染色的干擾因素，包括免疫血清 的不純、類屬抗原以及熒光色素的質(zhì)量不高、標(biāo)本處理不當(dāng)?shù)??？梢砸耘K粉進(jìn)行吸 收。具體做法如下每lml標(biāo)記抗體中加入臟器干粉100mg，充分混合，于室溫中 振蕩約lh，然后以10 000r/min離心30min，吸取標(biāo)記抗體。必要時(shí)可減半臟粉用 量再處理一次。臟器干粉優(yōu)選兔肝臟干燥后凍干粉碎制成。經(jīng)過臟粉吸收后的熒光抗體必須加0.1%疊氮鈉防腐。分裝小瓶冷凍保存。③ 檢測選取待測標(biāo)的物，并將上述待測標(biāo)的物鋪設(shè)載玻片表面固定；將上述固定有待測標(biāo)的物的載玻片上滴加步驟②上述純化產(chǎn)物。上述待測標(biāo)的物為娩狀黃 姑魚的血清液或體表粘液或鰓絲片段。在載玻片上，放上待檢測魚的待測標(biāo)的物，讓其自然鋪開，冷風(fēng)吹干，在火焰 上通過3次固定，放在密閉濕盒中，37'C恒溫30分鐘，然后用0.1Mol/L、 pH為8 的PBS輕輕沖洗3次，再按順序依次浸泡于PBS液的三個(gè)缸中，每缸5分鐘，取 出再經(jīng)沖洗3次，冷風(fēng)吹干。在上述載玻片上滴加家兔抗魚血清熒光抗體，令其蓋滿標(biāo)本，置密閉濕盒中， 37。C恒溫30分鐘，用0.1Mol/L、 pH為8.0的PBS液輕輕沖洗3次，再按順序依次 浸泡于PBS液的三個(gè)缸中，每缸5分鐘，取出再經(jīng)沖洗3次，冷風(fēng)吹干。然后再用 蒸餾水輕輕漂洗3次，冷風(fēng)吹干，力IU滴緩沖甘油液，蓋上蓋玻片封片。在熒光顯微鏡下觀察，如果出現(xiàn)熒光，則娩狀黃姑魚攜帶的細(xì)菌性爛鰓病的病 原體超標(biāo)，應(yīng)具有潛在爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)立即采取措施避免損失。此檢測方法的優(yōu)點(diǎn)免疫熒光技術(shù)不僅能快速檢測患病動(dòng)物的病原，檢測的時(shí) 間一般不超過3h，為疾病的及時(shí)預(yù)警和防治贏得了寶貴的時(shí)間，而且該方法還能夠 檢測到帶菌狀態(tài)或未發(fā)病的被感染個(gè)體，在實(shí)踐中此類潛伏狀態(tài)更加具有風(fēng)險(xiǎn)。攜 帶病原的魚由于個(gè)體免疫性狀的差異性，如果其自身免疫力超出一般水平則可能終 生不發(fā)病，然而其具有傳播病原的風(fēng)險(xiǎn)。在免疫能力一般的魚接觸病原后，經(jīng)短時(shí) 期的潛伏就會(huì)大規(guī)模爆發(fā)，造成慘重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，定期采用本發(fā)明的方法檢 測可能具有細(xì)菌性爛鰓病病原的待測標(biāo)的物，以及時(shí)采取規(guī)避手段，在較低成本的 前提下能夠極大幫助養(yǎng)殖戶降低養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)。而且，在制得免疫熒光探針分子后保存 條件比較普通，檢測的操作也很方便，為本發(fā)明方法大量的推廣使用創(chuàng)造了有利條 件。盡管已結(jié)合優(yōu)選的實(shí)施例描述了本發(fā)明，然其并非用以限定本發(fā)明，任何本領(lǐng) 域技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，能夠?qū)υ谶@里列出的主題實(shí) 施各種改變、同等物的置換和修改，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視所提出的權(quán)利要求 限定的范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1、鯢狀黃姑魚細(xì)菌性爛鰓病的預(yù)警方法，其特征是具有以下步驟①制備熒光抗體取患病魚的血清加入佐劑，注射到體重為2kg至3kg的兔體內(nèi)，制備兔抗魚血清抗體，并用熒光色素對所述的抗體進(jìn)行標(biāo)記，得到標(biāo)記溶液待用；②純化熒光抗體首先將步驟①的標(biāo)記溶液用透析法除去該標(biāo)記溶液中游離的熒光素，再采用纖維素過柱法除去過度標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子，將純化產(chǎn)物冷凍保存；③檢測選取待測標(biāo)的物，并將所述的待測標(biāo)的物鋪設(shè)載玻片表面固定；將上述固定有待測標(biāo)的物的載玻片上滴加步驟②所述的純化產(chǎn)物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的娩狀黃姑魚細(xì)菌性爛鰓病的預(yù)警方法，其特征是在步 驟③中，所述的待測標(biāo)的物為娩狀黃姑魚的血清液或體表粘液或鰓絲片段。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的娩狀黃姑魚細(xì)菌性爛鰓病的預(yù)警方法，其特征是所述 的佐劑的成分按照體積份數(shù)含有羊毛脂1份、石臘油2份至9份。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的鯢狀黃姑魚細(xì)菌性爛鰓病的預(yù)警方法，其特征是所述的佐劑的混勻?yàn)槿闈嵋?，并?jīng)高溫滅菌；所述的佐劑還含有3mg/ml至4mg/ml的卡介 苗。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的娩狀黃姑魚細(xì)菌性爛鰓病的預(yù)警方法，其特征是 在步驟①中，所述的熒光色素為異硫氰酸熒光素；所述的標(biāo)記的步驟包括用pH9.5碳 酸鹽緩沖液將抗體液稀釋至20mg/ml，得到蛋白液；再按質(zhì)量份數(shù)異硫氰酸熒光素1分、 抗體20份至100份稱取異硫氰酸熒光素，并用pH9.5碳酸鹽緩沖液溶解，得到熒光素 液；然后，混合所述的蛋白液和熒光素液，用碳酸鈉溶液調(diào)整pH，使蛋白液和熒光素 液的混合液的pH大于或等于9。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的鯢狀黃姑魚細(xì)菌性爛鰓病的預(yù)警方法，其特征是在步 驟②中，所述的透析法的透析液采用0.01Mol/L、 pH7.6 PBS或生理鹽水；透析的溫度 為3t:至5'C;透析的時(shí)間為4天至7天。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的鯢狀黃姑魚細(xì)菌性爛鰓病的預(yù)警方法，其特征是在步 驟②中，所述的纖維素過柱法采用磷酸鹽緩沖液液階梯洗脫，洗脫階梯數(shù)至少為4個(gè)。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的鯢狀黃姑魚細(xì)菌性爛鰓病的預(yù)警方法，其特征是所述 的磷酸鹽緩沖液還含有0.05Mol/L至0.2Mol/L的NaCl。
9、 根據(jù)權(quán)利要求6或8所述的鯢狀黃姑魚細(xì)菌性爛鰓病的預(yù)警方法，其特征是在步驟③中，所述的固定的步驟為將鋪設(shè)有待測標(biāo)的物載玻片在火焰上通過3次；再放在密閉濕盒中，37"C恒溫30分鐘；然后用0.1Mol/L、 pH為8的磷酸鹽緩沖液，最后 冷風(fēng)吹干。
全文摘要
本發(fā)明公開了狀黃姑魚細(xì)菌性爛鰓病發(fā)生的預(yù)警方法，包括①制備熒光抗體、②純化熒光抗體、③檢測等步驟。本發(fā)明通過熒光抗體的制備和純化可到大量的免疫熒光探針分子，成本低廉，檢測時(shí)間短，為疾病的及時(shí)預(yù)警和防治贏得了寶貴的時(shí)間，而且該方法還能夠檢測到帶菌狀態(tài)或未發(fā)病的被感染個(gè)體，在實(shí)踐中此類潛伏狀態(tài)更加具有風(fēng)險(xiǎn)。因此，定期采用本發(fā)明的方法檢測可能具有細(xì)菌性爛鰓病病原的待測標(biāo)的物，以及時(shí)采取規(guī)避手段，在較低成本的前提下能夠極大幫助養(yǎng)殖戶降低養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)。而且，在制得免疫熒光探針分子后保存條件比較普通，檢測的操作也很方便，適于推廣。
文檔編號G01N33/533GK101566630SQ200910096309
公開日2009年10月28日 申請日期2009年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月19日
發(fā)明者于新秀, 吳常文, 徐佳晶 申請人:浙江海洋學(xué)院