專利名稱：塵螨過敏原快速檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測人血液中塵螨類過敏原特異性抗體IgE含量的塵螨過 敏原快速檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
過敏性疾病(變態(tài)反應(yīng)疾病)被世界衛(wèi)生組織(WHO)認為是當今世界 性的重大衛(wèi)生學(xué)問題，世界各國變態(tài)反應(yīng)疾病的總發(fā)病率約為15%-30%，此 類疾病包括過敏性哮喘(外源性哮喘)、過敏性鼻炎、過敏性皮炎等，是臨床 上的常見病、多發(fā)病。
隨著我國醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展和人們生活水平的提高，許多嚴重危害人們 身體健康的傳染病、寄生蟲病的發(fā)病率、死亡率有較大幅度的下降，但人們 生活方式的變化和環(huán)境污染，過敏性疾病的發(fā)病率卻不斷上升，嚴重影響了 人們的生活和生存質(zhì)量。如何防治過敏性哮喘等過敏性疾病是我國醫(yī)藥衛(wèi)生 界急需要迫切解決的任務(wù)之一。
過敏性疾病是由于人體吸入、食入或接觸過敏原引起的。其中，塵螨是最 常見的過敏原(變應(yīng)原)之一，塵螨過敏占所有過敏性疾病的首位。在哮喘死 亡率高的地區(qū)，哮喘發(fā)作與對塵螨過敏有關(guān)，兩者之間存在一定的因果關(guān)系。
Voorhorst等早在1964年就報道了屋塵中的過敏原主要來自塵螨，塵螨的 分泌物、排泄物及其尸體的降解產(chǎn)物都是引起過敏性疾病的過敏原。引起變態(tài) 反應(yīng)主要的塵螨種類有屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssius )、粉塵螨 (Dermatophagoides farinae)等。調(diào)査結(jié)果顯示在中國華南地區(qū)，最主要的 室內(nèi)塵螨為粉塵螨，其次為屋塵螨。近十幾年來，逐步證實了塵螨過敏原的組 成非常復(fù)雜，約含有30種以上的過敏原成份。
IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)的致敏過敏原檢測在臨床上可以通過皮膚試驗及各種 體外檢測方法，如放射性過敏原吸附檢測(RAST)、免疫印跡(IS)及酶免疫 分析(EIA)等，結(jié)合病史、病癥的問診來確定致敏的過敏原。體外檢測是測 定血液樣本中的IgE，特別是過敏原特異性IgE (slgE)抗體濃度。酶免疫分析 中有多種檢測結(jié)合酶的方法，即熒光法，化學(xué)發(fā)光法和免疫層析法等，且均有 產(chǎn)品被美國FDA批準(Chapman JA etal， 2006， Food allergy: a practice parameter, Ann Allergy Asthma Immunol, 96: Sl-S68)。美國臨床實驗室標準 化委員會(CLSI)專門制定了人IgE抗體免疫分析方法評價的綱要(1/LA20 —
3A， NCCLS， 1997， 17 (20))。使用免疫層析法，僅用少量樣品就可以簡便、 快速地檢測塵螨過敏原，通過目測可定性判斷結(jié)果，通過使用比色卡可對檢 測結(jié)果進行半定量分級，通過使用定量金標檢測儀檢測結(jié)果進行定量分級， 試劑操作方便，既可用于醫(yī)院床邊快速診斷，也可用于社區(qū)診所或鄉(xiāng)村醫(yī)院甚 至家庭。尤其適合我國當前的國情。
免疫層析法，采用高度特異性的抗原抗體反應(yīng)及免疫層析分析技術(shù)來定性 和半定量檢測血清中的特異性IgE抗體。當固化于硝酸纖維膜載體表面的致敏 性抗原與病人血清在一起反應(yīng)后，血清中特異性IgE就會特異地結(jié)合到抗原上， 此特異結(jié)合的抗體被標記的抗人igE抗體所識別，顏色的強度與血清中特異性 IgE含量成比例；根據(jù)人血清中特異性IgE的濃度，評判的過敏原的致敏程度。
免疫層析法應(yīng)用的多種技術(shù)，如塵螨過敏原蛋白的提取純化方法，人IgE 抗體和抗人IgE抗體的制備、純化，膠體金標記抗人IgE抗體的制取純化等均 已成熟，為塵螨過敏原快速檢測試劑的商品化生產(chǎn)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種塵螨過敏原快速檢測試劑盒及其制備方法。
本發(fā)明的塵螨過敏原快速檢測試劑盒，其組成包括置于加樣槽中的已固 化了粉塵螨與戶塵螨過敏原蛋白和人IgE抗體的硝酸纖維膜條，膠體金標記的 抗體，緩沖液，分級比色卡；
其中
膠體金標記的抗體膠體金標記的抗人IgE抗體；
緩沖液0.05mol/L pH8.0的Tris—HCl中含2%胎牛血清，0.15mol/LNaCl， 0.5% Tween-20和20mg/L慶大霉素；
分級比色卡根據(jù)國際上通用的特異性IgE抗體濃度和分級標準關(guān)系制作 的分級比色卡。
本發(fā)明中的分級比色卡的顏色強度與血清中特異性IgE含量成比例，隨特 異性IgE濃度的升高，顏色逐漸變深。
本發(fā)明的塵螨過敏原快速檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟
1) 粉塵螨與戶塵螨過敏原蛋白的制備將含粉塵螨與戶塵螨過敏原蛋白 的詞養(yǎng)塵螨經(jīng)粉碎、脫脂、提取、SDS-PAGE電泳確證、洗脫、干燥；
2) 膠體金標記抗體的制備用膠體金標記抗人IgE抗體；
3) 用粉塵螨與戶塵螨過敏原蛋白和人IgE抗體固化硝酸纖維膜條，構(gòu)成 測試區(qū)和質(zhì)控區(qū)，并封閉；
44) 將固化處理過的硝酸纖維膜條放入加樣槽中；
5) 配制緩沖液0.05mol/L pH8.0的Tris —HC1中含2%胎牛血清， 0.15mol/L NaCl, 0.5°/。 Tween-20和20mg/L慶大霉素；
6) 根據(jù)國際上通用的特異性IgE抗體濃度和分級標準的關(guān)系，制作分級 比色卡。
上述的加樣槽為由聚苯乙烯或聚氯乙烯材料制造的加樣槽； 本發(fā)明的試劑盒的使用方法，包括如下操作步驟
(1) 將被檢測樣品加入到加樣槽的加樣孔中，樣品液中的過敏原特異性 IgE抗體各自與相應(yīng)的固相塵螨過敏原蛋白結(jié)合，過敏原特異性IgE抗體再與 膠體金標記的抗人IgE抗體結(jié)合，膠體金標記的抗人IgE抗體同時也與質(zhì)控區(qū) 中人IgE相結(jié)合。
(2) 再將緩沖液加入到加樣槽的加樣孔中，加快血清標本遷移速度，被 結(jié)合區(qū)域顯色；
(3) 20—30分鐘后，通過目測可定性判斷結(jié)果，通過使用比色卡可對 檢測結(jié)果進行半定量分級。
為對檢測結(jié)果進行定量分級，也可使用定量金標檢測儀檢測結(jié)果，定量 金標檢測儀自身帶百分比濃度的計算，是商品化儀器。
本發(fā)明的試劑盒的檢測原理固化在硝酸纖維膜條表面上的抗原(粉塵螨與 戶塵螨過敏原灘獲樣品血清中的特異性IgE抗體，膠體金標記抗人IgE抗體識 別特異性IgE并與之結(jié)合，形成抗原一特異性IgE—膠體金標記抗人IgE抗體 的復(fù)合物，顏色的強度與血清中特異性IgE含量成比例，通過目測可定性判 斷結(jié)果，通過使用比色卡可對檢測結(jié)果進行半定量分級，通過使用定量金 標檢測儀檢測結(jié)果進行定量分級。
本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明建立了免疫層析法測定樣品液中的塵螨過敏原特異性IgE抗體含 量，定性或半定量或定量檢測致敏過敏原，檢測靈敏度小于0.35IU/ml，通過 目測可定性判斷結(jié)果，通過使用比色卡可對檢測結(jié)果進行半定量分級，通 過使用定量金標檢測儀檢測結(jié)果進行定量分級。
本發(fā)明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定的優(yōu)點，為體外輔助診斷確 定使患者致敏的塵螨過敏原及過敏反應(yīng)程度提供了有效的手段。既可用于醫(yī)院 床邊快速診斷，也可用于社區(qū)診所或鄉(xiāng)村醫(yī)院甚至家庭。
具體實施方式
以下結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明。
本發(fā)明的塵螨過敏原快速檢測試劑盒組成包括置于加樣槽中的已固化了 粉塵螨與戶塵螨過敏原蛋白和人IgE抗體的硝酸纖維膜條，膠體金標記的抗體， 緩沖液，分級比色卡；
其中-
膠體金標記的抗體膠體金標記的抗人IgE抗體；
緩沖液0.05mol/L pH8.0的Tris—HCl中含2%胎牛血清，0.15mol/LNaCl, 0.5% Tween-20和20mg/L慶大霉素；
分級比色卡根據(jù)國際上通用的特異性IgE抗體濃度和分級標準關(guān)系制作 的分級比色卡。 實施例1
本發(fā)明的塵螨過敏原快速檢測試劑盒的制備方法 1.粉塵螨與戶塵螨過敏原蛋白的制備 l.l塵螨蛋白浸提液的制備
取50g飼養(yǎng)的塵螨，加入80ml丙酮或無水乙醇清洗滅活后用多層紗布過 濾除去溶劑，風(fēng)干、研細，再加入100ml乙醚，反復(fù)振搖l小時脫脂；揮凈乙 醚的脫脂粉以l: 100 (w/v)的量加入0.125mol/lNH4HCO3緩沖液(pH8.3)， 內(nèi)含0.ly。NaN3溶液室溫提取3小時，期間經(jīng)常攪拌；lOOOOg離心20分鐘， 上清浸提液-20'C下貯存。
1.2塵螨過敏原蛋白的提取
(1) 將上清浸提液在透析袋(MWCO 10000)中用10mmol/LPBS(pH7.2) 透析48小時，期間緩緩攪動PBS溶液，并更換PBS液4次；
(2) 透析后的塵螨過敏原蛋白溶液過0.45pm濾膜，并稀釋成4mg/ml的 蛋白溶液；
(3) 塵螨過敏原蛋白溶液灌入SDS-PAGE的膠柱，電泳分離；在分子量 10-lOOkD的區(qū)域用病人陽性血清在一個電泳膠柱進行免疫印跡，顯色；
(4) 切割下其余膠柱過敏原蛋白定位的相應(yīng)條帶，加入適量PBS溶液后， 室溫2000g離心IO分鐘；
(5) 測出過敏原蛋白溶液的濃度，加入適量防腐劑，-2(TC下冷凍貯存。 2.膠體金標記抗體的制備
2.1膠體金制備
膠體金的制備采用還原法。氯金酸(HAuCl4)與檸檬酸鈉反應(yīng)制備膠體金，
6具體操作方法如下a.將HAuCl4先配制成0.01X水溶液，取100ml加熱至沸； b.攪動下加入質(zhì)量濃度1%檸檬酸三鈉(Na3C6H507'2H20)水溶液；c.繼續(xù)加熱 煮沸15min。此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰 色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。全過程約2 3min;冷卻至室溫后用 蒸餾水恢復(fù)至原體積。用此法可制備5nm 80nm粒徑的膠體金。膠體金顆粒 的大小取決于制備時加入的檸檬酸三鈉的量。 2.2膠體金標記抗人IgE抗體
用膠體金標記蛋白質(zhì)，就是指蛋白質(zhì)吸附到膠體金顆粒表面。膠體金表面 帶有負電荷，能與蛋白質(zhì)的正電荷靜電吸引而形成牢固的結(jié)合。由于這種結(jié)合 主要是物理作用，所以不會引起蛋白質(zhì)活性的改變。標記前，需確定膠體金與 待標記蛋白質(zhì)的比例和將pH值調(diào)節(jié)到標記蛋白質(zhì)IgE的等電點或略高 (pH8.2)。標記時，將待標記抗人IgE抗體lmg加15ml膠體金溶液(1 OD )， 混合，室溫攪拌15分鐘，在磁性攪拌下加入質(zhì)量濃度5。/。的牛血清白蛋白
(BSA)使其終濃度為1%，混合5分鐘，離心，再通過離心法或凝膠層析法 純化標記的抗人IgE抗體。放在4。C達2年半仍然保持良好性能。 3.用塵螨過敏原蛋白固化硝酸纖維膜條 3.1材料和儀器
(1) 活化處理過的硝酸纖維素膜(Millipore， MDI， S&S， whatman等國外
公司的硝酸纖維素膜)，能與蛋白質(zhì)分子中的氨基基團反應(yīng)形成穩(wěn)定的共價鍵。
(2) 塵螨過敏原蛋白；
(3) 0.05mol/L Tris—HC1緩沖液(pH8.0)或活化增強劑；
(4) 0.01mol/LPBS溶液；
(5) 3。/。BSA封閉液；
(6) 微量點樣系統(tǒng)；
(7) 金屬箔袋及真空封口機等。 3.2步驟
(1)塵螨過敏原蛋白的硝酸纖維素膜條制備 采用Millipore， MDI， S&S, whatman中等流速的硝酸纖維素濾膜。試劑 墊、樣本墊、吸收墊采用Millipore公司產(chǎn)品，與玻片相比，膜的優(yōu)點是與蛋 白親和力強，檢測技術(shù)成熟，通常無需另外修飾。硝酸纖維素膜、尼龍膜、PVDF 膜等都是帶有微孔的濾膜，其孔徑一般在0.45 pm左右，在顯微鏡下這種膜 就是一個立體的纖維網(wǎng)絡(luò)，可以結(jié)合更多的蛋白質(zhì)探針，使檢測更加靈敏。同
7時，這種多孔結(jié)構(gòu)可使液體在其中進行自由擴散，當在膜的一端給以液體擴散 壓力時，液體將沿一定方向擴散，是層析的良好材料，是制作層析過敏原蛋白 的非常理想的載體。
(2) 點樣
具體采用0.05mol/L碳酸緩沖液，pH9.6或根據(jù)塵螨過敏原蛋白的特性選 擇的緩沖液適當稀釋過敏原蛋白溶液成0.05ng/ml-10^ig/ml的濃度。稀釋后將 塵螨過敏原蛋白(IO(HU)加到噴樣儲液瓶內(nèi)，應(yīng)用微量連續(xù)型點膜機(如 BIO-DOT公司的產(chǎn)品)，將變應(yīng)原溶液噴線于膜的相應(yīng)的位點非接觸式連續(xù)點 樣，即噴點，每次點樣lpl，連續(xù)3次；噴點后的硝酸纖維素膜放置2 — 8'C下 反應(yīng)過夜。用3。/。BSA封閉液，37'C下保溫2小時。層析膜條一般25—30mm 長，可以噴線2—10條線或噴點2—30點。
(3) 固化人IgE陽性的質(zhì)控區(qū)
a. 材料
人IgE抗體:來源于人血漿中經(jīng)親和色譜純化，純度>95%的人IgE抗體(購 自美國Biodesign公司)。
b. 步驟
用樣品稀釋液將人IgE抗體配制成濃度為50IU/ml，在過敏原蛋白硝酸纖 維素膜條上端固化人IgE抗體即為陽性質(zhì)控區(qū)。
4. 將塵螨過敏原蛋白固化硝酸纖維膜條放入加樣槽中 采用切割機將固化好的塵螨過敏原蛋白硝酸纖維素膜條切成所需的規(guī)格
和形狀，放入加樣槽中，再加入干燥劑裝入金屬箔袋內(nèi)密封，在2—8"C下貯存。
5. 配制緩沖液0.05mol/L pH8.0的Tris —HC1中含2%胎牛血清， 0.15mol/L NaCl， 0.5% Tween-20和20mg/L慶大霉素；
6. 分級比色卡制作
根據(jù)國際上特異性IgE抗體濃度和分級標準的關(guān)系，印制分級比色卡。 本發(fā)明的塵螨過敏原快速檢測試劑盒的使用方法
1. 檢測步驟
(1) 將所有試劑平衡至室溫(20—25"C)。
(2) 測定時用加樣吸管向加樣槽標本孔內(nèi)加入2 3滴血清(若使用定量加樣 器，每孔加100 150pl血清)，血清標本遷移至質(zhì)控區(qū)指示線時加入緩沖液1滴。
(3) 20-30分鐘觀察結(jié)果。
2. 結(jié)果判斷a. 目測
(1) 陽性結(jié)果在檢測板上質(zhì)控區(qū)和相應(yīng)的過敏原平行處的檢測線出現(xiàn)紅 色反應(yīng)帶。
(2) 陰性僅質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅色條帶
(3) 無效質(zhì)控區(qū)未出現(xiàn)紅色條帶
b. 使用分級比色卡可半定量分級判斷陽性結(jié)果-
C.使用定量金標檢測儀檢測可定量分級判斷陽性結(jié)果。
呈陽性的指標應(yīng)與分級比色卡級別基本一致，其分級結(jié)果只允許在相鄰兩 個級別間變化。
國際上過敏原特異性IgE濃度的分級方法國際分級標準過敏程度分級
分級IgE濃度
o級<0.35IU/ml陰性
l級0.35—0.70IU/ml弱陽性
2級0.71 — 3.50IU/ml陽性
3級0.5H7.5IU/ml較強陽性
4級17.51—50.0IU/ml強陽性
5級50.01—畫U/ml特強陽性
6級>100 IU/ml超強陽性
實施例2用塵螨過敏原快速檢測試劑試驗對200例過敏患者(2 — 18歲的120人，18 — 70歲的80人)，抽取血液制備血清篩查塵螨過敏原。
按上述塵螨過敏原快速檢測試劑盒的使用方法測出患者血清的不同過敏原特異性IgE濃度，采用分級比色卡或定量金標檢測儀判斷檢測結(jié)果。檢測結(jié)果如下表-
過敏性哮喘患者中塵螨致敏篩查結(jié)果
過敏原屋塵螨粉塵螨
過敏患者數(shù)目138152
其中男8083
女5869
檢出百分率(％)6976
檢測結(jié)果表明，采用本發(fā)明的試劑盒能夠簡便、快速、準確地檢測出致敏
過敏原，靈敏度達93.0%，特異性達85.0%,準確性87.0%。
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權(quán)利要求
1、塵螨過敏原快速檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒組成包括置于加樣槽中的已固化了粉塵螨與戶塵螨過敏原蛋白和人IgE抗體的硝酸纖維膜條，膠體金標記的抗體，緩沖液，分級比色卡；其中膠體金標記的抗體膠體金標記的抗人IgE抗體；緩沖液0. 05mol/L pH8.0的Tris—HCl中含2％胎牛血清，0.15mol/LNaCl，0.5％Tween-20和20mg/L慶大霉素；分級比色卡根據(jù)國際上通用的特異性IgE抗體濃度和分級標準關(guān)系制作的分級比色卡。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的塵螨過敏原快速檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括如下步驟1) 粉塵螨與戶塵螨過敏原蛋白的制備將含粉塵螨與戶塵螨過敏原蛋白 的飼養(yǎng)塵螨經(jīng)粉碎、脫脂、提取、SDS-PAGE電泳確證、洗脫、干燥；2) 膠體金標記抗體的制備用膠體金標記抗人IgE抗體；3) 用粉塵螨與戶塵螨過敏原蛋白和人IgE抗體固化硝酸纖維膜條，構(gòu)成 測試區(qū)和質(zhì)控區(qū)，并封閉；4) 將步驟3)固化處理過的硝酸纖維膜條放入加樣槽中；5) 配制緩沖液0.05mol/L pH8.0的Tris —HC1中含2%胎牛血清， 0.15mol/LNaCl， 0.5% Tween-20和20mg/L慶大霉素；6) 根據(jù)國際上通用的特異性IgE抗體濃度和分級標準的關(guān)系，制作分級 比色卡。
全文摘要
本發(fā)明公開了塵螨過敏原快速檢測試劑盒及其制備方法，試劑盒組成包括置于加樣槽中的已固化了粉塵螨與戶塵螨過敏原蛋白和人IgE抗體的硝酸纖維膜條，膠體金標記的抗體，緩沖液，分級比色卡。采用該試劑盒，通過目測可定性判斷結(jié)果，通過使用比色卡可對檢測結(jié)果進行半定量分級，通過使用定量金標檢測儀檢測結(jié)果進行定量分級。本發(fā)明具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定的優(yōu)點，為體外輔助診斷確定使患者致敏的塵螨過敏原及過敏反應(yīng)程度提供了有效的手段。
文檔編號G01N33/52GK101509920SQ200910096948
公開日2009年8月19日 申請日期2009年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月26日
發(fā)明者吳善東 申請人:杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司