專利名稱：檢測化合物抗過敏作用的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種檢測化合物抗過敏作用強弱的方法，特別涉及一種 通過觀察雞胚尿囊卵黃膜血管的變化程度來檢測化合物抗過敏作用強弱的方法。
背景技術：
近年來過敏物質所致皮膚疾病正在逐年增多，成為皮膚科常見疾病之一。對于化合物抗 過敏性的評價也越來越引起人們的注意，傳統(tǒng)對化合物的抗過敏性的評價主要以動物試驗為 主，但在全球化的動物保護運動的影響下，發(fā)達國家普遍開展了以替代(r印lacement)、減 少(reduction)和優(yōu)化(refinement)為核心的"3R"運動，體外替代實驗將逐步取代動物 實驗。歐盟2003年3月正式通過化妝品指令2003/15/EC，其主要議題就是對化妝品成品及 其成分的非動物測試的規(guī)定和限制。很多國家都在對動物替代評價體系進行研究。
目前對化妝品眼刺激性的動物替代方法研究中，雞胚絨毛膜尿囊膜動物替代試驗法 (hen， s egg test chorioallantoic membrane , HET-雞胚絨毛尿囊膜)是研究中的熱點。雞 胚尿囊膜絨毛膜是雞胚的呼吸膜,血管豐富,緊貼于蛋殼膜下，雞胚尿囊膜絨毛膜試驗通過觀
察尿囊膜暴露于化學物質后血管的變化-充血、出血和凝血并計算剌激分值,根據結果對
受試物評分操作簡單，費用較低，重現(xiàn)性好，與體內試驗結果的相關性高，值得推廣。但該方 法中，傳統(tǒng)的是將雞殼開窗，直接將測試物質加到暴露的尿囊膜絨毛膜上，視野窄，雞胚血 管網個體差異大，不好統(tǒng)一標準，并且僅僅能夠評價急性刺激性(5min內的)，而且該方法 也沒有用于對化合物抗過敏性的評價方面應用的記錄。

發(fā)明內容
本發(fā)明的發(fā)明目的是，提供一種體外進行化合物抗過敏作用檢測的方法，而且可以降低 試驗的成本，提高試驗的準確性， 一致性。
本發(fā)明提供一種檢測化合物抗過敏作用的方法，依次包括以下步驟
1、 將受精雞卵用75%酒精消毒后置于有加濕水盤的孵箱中孵化75到100小時；
2、 打開蛋殼，將雞胚移入75到90ram直徑的無菌玻璃平皿中，平皿中預先加入預熱37
3。C的開殼緩沖液l到4ml，開殼緩沖液的成分為CaCL2.2H20 : 0. 265g/l;無水MgS04 :0.09767 g/l: KC1: 0. 4g/l; NaHCO" 2.2g/l; NaCl: 6.8g/l;無水Na2HP04 : 0. 122g/l;青霉素 0. 066g/l;鏈霉素0. 154g/l;
3、 選擇卵黃膜未破、雞胚尿囊卵黃膜血網管位于卵黃中央上方的雞胚，蓋好平皿蓋，放 入37. 5'C恒溫孵育箱中繼續(xù)孵育到第8到15天；
4、 選擇雞胚尿囊卵黃膜血管發(fā)育好的的雞胚，隨機進行分組，分別加入不同濃度待測化 合物和空白對照物，加入待測化合物和空白對照物的方式為雞胚尿囊卵黃膜血管網表面滴加 或血管內注射，之后將雞胚放入37. 5'C恒溫孵育箱中繼續(xù)孵育，在繼續(xù)孵育到1小時或12 小時或24小時或48小時的時候，在雞胚尿囊卵黃膜血管網表面滴加等量的濃度為1%十二 烷基硫酸鈉或0. 1mmol/L NaOH等己知對雞胚尿囊卵黃膜血管有剌激性的物質，上述操作均是 在無菌的環(huán)境下完成，依照刺激因子法對血管的變化進行評分,并計算不同濃度抗過敏化合物 的抑制率。
本發(fā)明提供的檢測化合物抗過敏作用的方法，其中所述打開蛋殼的方法為，用牙科鉆在 蛋殼中央垂直長軸磨切出一道1.5到5cm長切口，以切口為界向兩側掰開蛋殼。
本發(fā)明提供的檢測化合物抗過敏作用的方法，其中所述待測化合物為水溶性成分，將其 溶于生理鹽水中，各劑量組滴加0. 1到lml或血管注射0. 1到0. 5ml。
本發(fā)明提供的檢測化合物抗過敏作用的方法，其中所述待測化合物為水溶性差的成分， 先用二甲基亞砜將該化合物溶解，并用生理鹽水將二甲基亞砜濃度稀釋至小于O. W，各劑量 組加入的化合物的量為，滴加時0. lml到lml或血管注射時0. 1 ml到0. 5ml。
本發(fā)明使用雞胚為試驗材料，避免使用活體動物作為實驗對象體，而且在操作過程中將 雞胚移入平皿，這樣擴大了操作視野，非常直觀，有利于結果記錄及評價，有利于給藥部位 確定及保證給藥部位一致性，降低個體差異，通過加入緩沖液，提高了雞胚繼續(xù)孵化的存活 率，長時間使用，有利于試驗材料的節(jié)省。故此，該方法簡便，價格便宜、觀察指標明了。


圖1為肉眼所見雞胚8天的雞胚尿囊卵黃膜血管網照片；
圖2為肉眼所見雞胚12天的雞胚尿囊卵黃膜血管網照片；
圖3為肉眼所見雞胚15天的雞胚尿囊卵黃膜血管網照片；
圖4為普通解剖放大鏡下雞胚尿囊卵黃膜血管，血管出血的照片；
圖5為普通解剖放大鏡下雞胚尿囊卵黃膜血管，血管凝血的照片；
圖6為普通解剖放大鏡下雞胚尿囊卵黃膜血管，血管溶解的照片。
具體實施例方式
通過實施例進一步說明本發(fā)明，并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍中。
實施例1
材料與方法
材料
1、 雞卵無特定病原體(SPF)級受精雞卵，3日齡，購于北京梅里亞通實驗動物技術有限 公司；
2、 各種試劑購于北京化學試劑公司及sigma試劑公司；
方法
1、 將雞卵用75%酒精消毒后置于有加濕水盤的孵箱中孵化84小時；
2、 用牙科鉆在蛋殼中央垂直長軸磨切出一道5cm長切口，以切口為界向兩側掰開蛋殼， 將雞胚移入90mm直徑的無菌玻璃平皿中，平皿中預先加入預熱37。C的開殼緩沖液2ml，開殼 緩沖液的成分為CaCL2. 2H20 : 0. 265g/l;無水MgS04 : 0. 09767 g/1; KC1: 0.4g/l; NaHCO,: 2. 2g/l; NaCl: 6. 8 g/1;無水NazHP04 : 0. 122g/l;青霉素0. 066g/l;鏈霉素0.154g/l;
3、 選擇卵黃膜未破、雞胚尿囊卵黃膜血管網位于卵黃中央上方的雞胚，蓋好平皿蓋，放 入37. 5'C恒溫孵育箱中繼續(xù)孵育到第8天，該雞胚如圖l所示；
4、 選擇雞胚尿囊卵黃膜血管網發(fā)育好的雞胚20只，隨機分為4組，加入待測黃酮類抗 過敏化合物，加入方式為將該黃酮類抗過敏化合物用生理鹽水溶解為濃度分別為0, 1， 10， 20剛o1/1,每劑量組各5只，在雞胚尿囊卵黃膜血管網表面滴加該黃酮類抗敏化合物l毫升， 之后繼續(xù)放入孵箱孵育，上述操作均是在無菌的環(huán)境下完成，此后繼續(xù)孵化24h時，每只雞 胚的尿囊卵黃膜血管網上分別滴加0. lmmol/L NAOH lml ,采用刺激因子法(irritation score, IS)對其刺激性進行判定，計算每組的刺激性抑制率及p值。
結果觀察加入0. lmmol/L Na0H 1 ml后300秒內觀察雞胚尿囊卵黃膜血管的反應，監(jiān) 控并記錄每一種預期變化出現(xiàn)的時間，精確到秒。觀察終點包括出血血液從血管和/或從 毛細血管流出，如圖4;血管溶解:終末毛細血管消失，血管樹枝樣變，如圖5;凝血指血 管內和血管外蛋白的變性，如圖6。
結果評價
刺激因子法(irritation score, IS).下列公式顯示了如何計算IS值
'301-出血時間
301-血管溶解時間
、、 300
x7
+ |
301-凝血時間
人
x9
5出血時間=加入刺激物到雞胚尿囊卵黃膜上觀察到開始發(fā)生出血的時間(秒)
血管溶解時間=加入刺激物到雞胚尿囊卵黃膜上觀察到開始發(fā)生出血的時間(秒)
凝血時間=加入剌激物到雞胚尿囊卵黃膜上觀察到血管開始出現(xiàn)溶解的時間(秒) 抑制率(W卜IS'/(IS廠IS。) X薩o IS,:加入抗敏化合物后測得NA0H的IS值 ISn:未加入抗敏化合物對照組測得的NA0H的IS值
結果黃酮類抗敏化合物A對O. lmmol/LNAOH的刺激性有抑制作用。濃度為0， 1， 10， 20剛o1/1時，抑制率分別為0， 24%, 50% (p<0. 01)' 72% (p〈0. 001)。 實施例2 材料與方法 材料
1、雞卵無特定病原體(SPF)級受精雞卵，3日齡,購于北京梅里亞通實驗動物技術有限 公司；2、各種試劑購于北京化學試劑公司及sigma試劑公司；
方法
1、 將雞卵用75%酒精消毒后置于有加濕水盤的孵箱中孵化90小時；
2、 用牙科鉆在蛋殼中央垂直長軸磨切出一道1.5cm長切口，以切口為界向兩側掰開蛋殼， 將雞胚移入90,直徑的無菌玻璃平皿中，平皿中預先加入預熱37i:的開殼緩沖液2ml，開殼 緩沖液的成分為CaCU. 2H20 : 0.265g/l;無水MgS04 : 0. 09767 g/l: KC1: 0.4g/l; NaHC03: 2.2g/l; NaCl: 6.8g/l;無水船2冊04 : 0. 122g/l;青霉素0.066g/l;鏈霉素0. 154g/l;
3、 選擇卵黃膜未破、雞胚尿囊卵黃膜血管網位于卵黃中央上方的雞胚，蓋好平皿蓋，放 入37. 5'C恒溫孵育箱中繼續(xù)孵育到第12天，如圖2;
4、 選擇雞胚尿囊卵黃膜血管網發(fā)育好的雞胚15只，隨機分為3組，加入待測天然提取 的抗敏化合物，加入方式為，首先將該化合物用生理鹽水溶解成濃度為O， 1， 10Mmol/l的溶 液，每劑量組各5只，每只雞胚尿囊卵黃膜血管網上表面滴加1毫升，之后繼續(xù)放入孵箱孵 育，上述操作均是在無菌的環(huán)境下完成，此后繼續(xù)孵化24h后，在每只雞胚的雞胚尿囊卵黃 膜血管網分別加入1%十二烷基硫酸鈉lml ,加入方式為表面滴加，采用刺激因子法
(irritation score, IS)對其刺激性進行判定，計算每組的刺激性抑制率及P值。
結果觀察加入1%十二烷基硫酸鈉后300秒內觀察雞胚尿囊卵黃膜血管的反應，監(jiān) 控并記錄每一種預期變化出現(xiàn)的時間，精確到秒。觀察終點包括-
出血血液從血管和Z或從毛細血管流出，如圖4;血管溶解終末毛細血管消失，血管樹枝樣變，如圖5;凝血指血管內和血管外蛋白的變性，如圖6。
結果評價刺激因子法(irritation score, IS).下列公式顯示了如何計算IS值:
V、
301-出血時間' 300
、 x5+
」
'301-血管溶解時間
、、
x7+
J 」
301-凝血時間 300
x9
出血時間=加入刺激物到雞胚尿囊卵黃膜上觀察到開始發(fā)生出血的時間(秒)
血管溶解時間=加入刺激物到雞胚尿囊卵黃膜上觀察到開始發(fā)生出血的時間(秒)
凝血時間=加入刺激物到雞胚尿囊卵黃膜上觀察到血管開始出現(xiàn)溶解的時間(秒) 抑制率(％) =IS,/ (IS「IS。) X 100% IS卜'加入抗敏化合物后測得NA0H的IS值 IS,,:未加入抗敏化合物對照組測得的NA0H的IS值
結果該天然提取的抗敏化合物A對1%十二垸基硫酸鈉的刺激性有抑制作用。濃度為0，
1, 10tool/l時，抑制率分別為0， 32%， 71% (p<0.01)。
實施例3
材料與方法
材料
1、 雞卵無特定病原體(SPF)級受精雞卵，3日齡,購于北京梅里亞通實驗動物技術有限 公司；
2、 各種試劑購于北京化學試劑公司及sigma試劑公司；
方法
1、 將雞卵用75%酒精消毒后置于有加濕水盤的孵箱中孵化90小時；
2、 用牙科鉆在蛋殼中央垂直長軸磨切出一道3cm長切口，以切口為界向兩側掰開蛋殼， 將雞胚移入90,直徑的無菌玻璃平皿中，平皿中預先加入預熱37"C的丌殼緩沖液2ml，開殼 緩沖液的成分為CaCU. 2H20 : 0 . 265g/l;無水MgS04 : 0. 09767 g/l; KC1 : 0. 4 g/1; NaHC03 :
2. 2 g/l; NaCl:6. 8 g/1;無水Na異:0. 122g/l;青霉素0. 066g/l;鏈霉素0. 154g/l;
3、 選擇卵黃膜未破、雞胚尿囊卵黃膜血管網位于卵黃中央上方的雞胚，蓋好平皿蓋，放 入37. 5'C恒溫孵育箱中繼續(xù)孵育到第15天，如圖3;
4、選擇雞胚尿囊卵黃膜血管發(fā)育好的雞胚15只，隨機分為3組，加入待測水溶性差的植 物提取物，加入的方式為，首先用二甲基亞砜溶解該物質，溶解(二甲基亞砜終濃度小于0. 1%) 濃度為0， 1, 10陶o1/1，血管內注射，每劑量組各5只，每只0.2毫升，繼續(xù)放入孵箱孵育， 上述操作均是在無菌的環(huán)境下完成，繼續(xù)孵化12小時后，在雞胚尿囊卵黃膜血管網上分別加入1%十二烷基硫酸鈉lml ,加入方式為表面滴加，采用刺激因子法(irritation score, IS)對其刺激性進行判定，計算每組的刺激性抑制率及p值。
結果觀察加入1%十二烷基硫酸鈉后300秒內觀察雞胚尿囊卵黃膜血管的反應，監(jiān) 控并記錄每一種預期變化出現(xiàn)的時間，精確到秒。觀察終點包括
出血血液從血管和/或從毛細血管流出，如圖4;血管溶解終末毛細血管消失，血管 樹枝樣變，如圖5;凝血指血管內和血管外蛋白的變性，如圖6。
結果評價刺激因子法(irritation score, IS).下列公式顯示了如何計算工S值
V、
301-出血時間' 300
、、
x 5 」 」+
301-血管溶解時間
人 、 x7
/7
+
301-凝血時間、 300 ,
x9
出血時間=加入剌激物到雞胚尿囊卵黃膜上觀察到開始發(fā)生出血的時間(秒) 血管溶解時間=加入刺激物到雞胚尿囊卵黃膜上觀察到開始發(fā)生出血的時間(秒) 凝血時間=加入刺激物到雞胚尿囊卵黃膜上觀察到血管開始出現(xiàn)溶解的時間(秒)
抑制率(。/。卜isy(is,-is。) X100%
IS':加入抗敏化合物后測得NA0H的IS值 ISn:未加入抗敏化合物對照組測得的NA0H的IS值
結果該植物提取物對1%十二垸基硫酸鈉的剌激性有抑制作用。濃度為0， 1， lOMmol/1 時，抑制率分別為0， 21%， 51% (p<0.01)。 實施例4 材料與方法 材料
1、 雞卵無特定病原體(SPF)級受精雞卵50只，3 R齡,購于北京梅里亞通實驗動物技 術有限公司；
2、 各種試劑購于北京化學試劑公司及sigma試劑公司； 方法
1、 將雞卵用75%酒精消毒后置于有加濕水盤的孵箱中孵化84小時；
2、 用牙科鉆在蛋殼中央垂直長軸磨切出一道5cm長切口，以切口為界向兩側掰開蛋殼， 將雞胚移入75mm直徑的無菌玻璃平皿中。選上述雞胚40只，隨機分成兩組每組20只， 一組 放入平皿中； 一組平皿中預先加入預熱37'C的開殼緩沖液2ml，開殼緩沖液的成分為 CaCU 2即:0. 265g/l;無水MgS04 : 0. 09767 g/l; KC1: 0.4g/l; Na跳:2.2g/l; NaCl: 6.8g/l;無水Na2HP04 : 0. 122g/l;青霉素0.066g/l;鏈霉素0. 154g/l;以上操作均是在無菌條件下完成。將兩組雞胚放入37. 5"恒溫孵育箱中繼續(xù)孵育至15天。
結果未加開殼緩沖液時，孵化第8天雞胚存活率為30%,第9天為15%，第10天為
10%，第11天5%，第12天為0%孵化時間越長，死亡率越高。加入開殼緩沖液后，孵化第
8天雞胚存活率為80%，第9天為80%，第10天為80%，第12天為75%，第13天為75%
孵化第14天為70%，第15天為70%。
通過加入開殼緩沖液延長了雞胚在平皿中的存活時間。
9
權利要求
1、檢測化合物抗過敏作用的方法，其特征在于依次包括以下步驟1)將受精雞卵用75％酒精消毒后置于有加濕水盤的孵箱中孵化75到100小時；2)打開蛋殼，將雞胚移入75到90mm直徑的無菌玻璃平皿中，平皿中預先加入預熱37℃的開殼緩沖液1到4ml，開殼緩沖液的成分為CaCL2.2H2O0.265g/l；無水MgSO40.09767g/l；KCl0.4g/l；NaHCO32.2g/l；NaCl6.8g/l；無水Na2HPO40.122g/l；青霉素0.066g/l；鏈霉素0.154g/l；3)選擇卵黃膜未破、雞胚尿囊卵黃膜血管網位于卵黃中央上方的雞胚，蓋好平皿蓋，放入37.5℃恒溫孵育箱中繼續(xù)孵育到第8到15天；4)選擇雞胚尿囊卵黃膜血管發(fā)育好的雞胚，隨機進行分組，分別加入不同濃度的待測化合物和空白對照物，加入化合物和空白對照物的方式為雞胚尿囊卵黃膜血管網表面滴加或血管內注射，之后將雞胚放入37.5℃恒溫孵育箱中繼續(xù)孵育，在繼續(xù)孵育到1小時或12小時或24小時或48小時的時候，在雞胚尿囊卵黃膜血管網表面滴加等量的濃度為1％十二烷基硫酸鈉或0.1mmol/L NaOH等已知對雞胚尿囊卵黃膜血管有刺激性的物質，上述操作均是在無菌的環(huán)境下完成，依照刺激因子法對血管的變化進行評分，并計算不同濃度化合物的抑制率。
2、 依權利要求1檢測化合物抗過敏作用的方法，其特征在于所述打開蛋殼的方法為，用 牙科鉆在蛋殼中央垂直長軸磨切出一道1. 5到5cm長切口，以切口為界向兩側掰開蛋殼。
3、 依權利要求2檢測化合物抗過敏作用的方法，其特征在于所述待測化合物為水溶性成 分，將其溶于生理鹽水中，各劑量組加入的化合物的量為，滴加時0. lml到lml或血管注射 時0. 1 ml到0. 5ml。
4、 依權利要求2檢測化合物抗過敏作用的方法，其特征在于所述待測化合物水溶性差， 先用二甲基亞砜將該化合物溶解，并用生理鹽水將二甲基亞砜濃度稀釋至小于0.1%，各劑量 組加入的化合物的量為，滴加時0. lml至ij lml或血管注射時0. 1 ml到0.5ml。
全文摘要
檢測化合物抗過敏作用的方法，依次包括以下步驟將受精雞卵用75％酒精消毒后置于有加濕水盤的孵箱中孵化75到100小時；打開蛋殼，將雞胚移入75到90mm直徑的無菌玻璃平皿中，平皿中預先加入預熱37℃的開殼緩沖液，選擇卵黃膜未破的雞胚放入37.5℃恒溫孵育箱中繼續(xù)孵育到第8到15天；隨機進行分組，加入待測化合物之后將雞胚放入恒溫孵育箱中繼續(xù)孵育，在繼續(xù)孵育到1小時或12小時或24小時或48小時的時候，加入已知對雞胚尿囊卵黃膜血管有刺激性的物質，依照刺激因子法對血管的變化進行評分，并計算不同濃度抗過敏化合物的抑制率。該方法簡便，價格便宜、觀察指標明。
文檔編號G01N33/50GK101487839SQ200910078358
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月26日 優(yōu)先權日2009年2月26日
發(fā)明者楊曉冉, 王軍兵, 董益陽, 鄒運動, 鄭洪艷 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院