專利名稱：一種dna銀染方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA銀染方法，尤其涉及一種對變性聚丙烯酰胺凝膠 (PAGE)中DNA的銀染及顯色方法。
背景技術(shù)：
聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 是分析蛋白質(zhì)和核酸樣品的一種常用的方法，由于其具有較高的分辨率，在 分子生物學(xué)及相關(guān)學(xué)科的研究中得以廣泛的應(yīng)用，尤其在AFLP、 SSR、 SNP等 分子標(biāo)記研究和遺傳圖譜構(gòu)建等方面應(yīng)用更多。電泳后對樣品的顯示有許多 的方法，目標(biāo)產(chǎn)物的檢測主要采取顯色法，目前采用的顯色法大體有如下幾 種(1)同位素放射自顯影法，(2)熒光染料標(biāo)記法，(3)溴化乙錠染色 法，其中，同位素放射自顯影法具有靈敏度高、可靠性強等優(yōu)點，但必須使 用同位素標(biāo)記、凝膠轉(zhuǎn)移、自顯影等步驟，操作過程比較繁瑣，且操作者易 遭受同位素照射的危險，需要外加特別的設(shè)備和防護措施，因而在推廣應(yīng)用 中有一定的難度；熒光染料標(biāo)記法雖然克服了方法(1)中同位素對人的危害 性，但同時也降低了檢測的靈敏度，并且操作過程同樣繁瑣，試驗成本也較 高，需要有熒光顯微鏡等設(shè)備；溴化乙錠(EB)染色法方便易行，但聚丙烯酰 胺對溴化乙錠EB的熒光有猝滅作用，大大降低了溴化乙錠染色靈敏度，小于 lOng的DNA條帶很難檢測到，另外，往往要求產(chǎn)物的量較大，且EB具有致 癌性，使得對凝膠的操作和處理變得復(fù)雜起來。
3采用銀染法，可以有效地克服以上三種常見凝膠染色法的缺點，銀染法 的基本原理為先用固定液將核酸固定到凝膠上，然后使銀染液中的銀離子 與之牢固結(jié)合，再通過還原劑將銀離子還原，從而發(fā)生了顯色反應(yīng)，使得目 標(biāo)產(chǎn)物能夠憑肉眼即能看見。銀染法對試劑的要求相對不高， 一般國產(chǎn)分析 純試劑即可滿足要求，并且固定液和染色液可以重復(fù)使用，降低了實驗成本， 銀染后的凝膠可以長期保存，更有利于對實驗結(jié)果的回顧性分析。在目前的
分子生物學(xué)研究上具有廣泛的推廣價值。目前較常用的是Bassam (1991)和 Sanguinetti (1994)的銀染法，同時很多研究者根據(jù)自己的實踐提出了不少 改進的銀染法(Rderetal. ， 1998;許紹斌等2002)，主要用于聚丙烯酰胺 凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染色，其靈敏度比EB高200倍，但銀染色 后DNA不宜回收。銀染法是迄今為止靈敏度最高的一種染色法，現(xiàn)有的銀染 法大都存在有以下缺點(l)可能造成很高的背景特別在水不夠純的情況下； (2)費時費力(需要l 2h); (3)費用昂貴；(4)需要接觸有毒的物質(zhì)較多。目 前，常用的銀染方法主要包含下面幾個步驟(l)預(yù)處理與固定；(2)染色；(3) 顯色；(4)終止反應(yīng)。整個過程比較繁瑣，需要用到去離子水、乙醇、硝酸、 硝酸銀、碳酸鈉、甲醛、硫代硫酸鈉及乙酸等多種化學(xué)試劑。現(xiàn)有的銀染方 法均需要采用乙醇或/和乙酸來終止顯色，所用到試劑較多，操作步驟相對較 為復(fù)雜，相應(yīng)地顯色時間較長。目前所采用的銀染方法每次染色時需配固定 液，顯影液及染色液，染色液還要事先進行預(yù)冷等，同時在顯影過程后期顯 影速度很快，它要求帶型顯出時及時終止反應(yīng)，如把握不當(dāng)，隨著染色時間 的延長，會使膠越染越黑，降低DNA帶型與背景的對比度，染色效果較差。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種操作時間短，使用試劑少的對變性聚丙烯酰
胺凝膠(PAGE)中DNA的銀染方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案在于采用了 一種DNA銀染方法， 該方法的步驟如下
(1) 電泳結(jié)束后切斷電源，從電泳槽中倒出緩沖液，然后取下膠板，放
入裝有蒸餾水的瓷盤中，用蒸餾水漂洗2—3次；
(2) 銀染加入染色劑進行銀染，并用手或搖床不停搖動，染色8—12 分鐘，然后用蒸餾水漂洗2—3次；
(3) 顯影加入顯影劑進行顯色，并用手或搖床不停搖動，顯影8—12 分鐘，至目的條帶清晰為止；
(4) 用蒸餾水漂洗2—3次；
(5) 凝膠攝影將凝膠平鋪于X線膠片觀片燈上照相。
步驟(2)中的染色劑由0.1—0.2%的AgNCb與10%的無水乙醇組成。 優(yōu)選地，步驟(2)中的染色劑由0.2。/。的AgN03與10%的無水乙醇組成， 0.2%硝酸銀染色后，帶型顯色更深，更快，靈敏度更高；染色過程中加入10% 的無水乙醇，后續(xù)顯色過程快，條帶不飄移，帶型整齊。
步驟(3)中的顯影劑由2—3。/。的NaOH和0.2—0.4%的甲醛組成。 優(yōu)選地，步驟(3)中的顯影劑由2—3。/。的NaOH和0.3y。的甲醛組成。 本發(fā)明的方法，將固定步驟與染色步驟合而為一，且采用乙醇進行固定， 避免了常規(guī)銀染方法中采用乙酸固定而帶來的帶色較淺，同時其具有刺激性 氣味，具有腐蝕性等缺陷；同時，乙醇和硝酸銀配制在一起，可使后續(xù)顯色 過程快，條帶不飄移，帶型整齊。顯影劑中，甲醛的作用是將銀離子還原為金屬銀，顯色時，當(dāng)甲醛濃度較高時，染色時間縮短，但膠顏色發(fā)黃，背景 污濁，且相互反差變小，使不同分子量的DNA不能同步顯色，影響靈敏度；
濃度低時，不僅染色時間延長而且不易著色，本發(fā)明優(yōu)選0.3%的甲醛，可以 獲得高敏感性和特異性的銀染結(jié)果；氫氧化鈉在顯影劑中起提供堿性環(huán)境、 促進顯影劑顯影能力的作用。另外，本發(fā)明的方法無需采用乙醇或/和乙酸來 終止顯色，省去了終止顯色步驟，避免了采用乙酸所帶來的刺激性氣味，具 有腐蝕性等問題。
本發(fā)明的DNA銀染方法只需要配制染色劑和顯影劑兩種溶液，染色過程 中明顯的減少了溶液配制的種類，從而大大簡化了顯色程序；且本發(fā)明的方 法在染膠過程中省去了常規(guī)方法中使用的顯影步驟所采用的硫代硫酸鈉及終 止顯色步驟所用到的乙酸，減少了試劑的用量，降低了成本；更重要的是它 省時省力，操作簡便，顯影過程比較溫和，容易控制，當(dāng)把凝膠放入顯影劑 中，最初5min無明顯變化，在以后的2-4min逐漸顯出帶型，當(dāng)帶型都顯出 來后，背景顏色基本不變，由此可見采用本發(fā)明的方法顯影容易控制。
本發(fā)明所用NaOH的濃度較低，即使適當(dāng)延長染色時間，也不會把膠染黑， 因此不用停顯的步驟，在帶型顯出后，僅用蒸餾水漂洗，洗掉膠上殘存的顯 影液即可。
本發(fā)明對聚丙烯胺凝膠電泳技術(shù)染色方法及其最適條件進行了探索，經(jīng) 過多次實驗，最終研究建立了一種DNA銀染方法，在大幅度提高檢測靈敏度 的同時，可有效地控制凝膠的染色背景，步驟簡單，容易操作，整個染色過 程所需時間短(15—20min)，利用本發(fā)明的銀染法對葡萄微衛(wèi)星DNA擴增產(chǎn)物 的PAGE凝膠進行染色取得了十分滿意的效果。另外，本發(fā)明的方法克服了許多非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳及銀染法的 不足，省時簡便且重復(fù)性好，確保了非變性聚丙烯酰氨凝膠中陽性條帶的顯 示與觀察，能夠達到準(zhǔn)確篩查和精確定量的目的，對篩查出的陽性標(biāo)本進行 有目的的測序，可避免盲目測序所帶來的資金浪費。


圖1為本發(fā)明銀染方法的銀染效果圖； 圖2為常規(guī)方法的銀染效果圖。
具體實施方式
實施例1
本發(fā)明DNA銀染方法的步驟如下
(1) 電泳結(jié)束后切斷電源，從電泳槽中倒出緩沖液，然后取下膠板，放 入裝有蒸餾水的瓷盤中，用蒸餾水漂洗2次；
(2) 銀染加入染色劑進行銀染，并用手或搖床不停搖動，染色10分鐘，
然后用蒸餾水漂洗2次，其中染色劑由0.2y。的AgN03 (W/V)與10%的無水乙 醇(V/V)組成；
(3) 顯影加入顯影劑進行顯色，并用手或搖床不停搖動，顯影10分鐘， 至目的條帶清晰為止，，其中，顯影劑由3呢的NaOH(W/V)和0.3。/。的甲醛(V/V) 組成；
(4) 用蒸餾水漂洗2次；
(5) 凝膠攝影用數(shù)碼相機對平鋪于X線膠片觀片燈上的凝膠照相。 材料與方法
1. 1材1. 1. 1 實驗材料
以葡萄(Kz'z^s w'w'/era L.)葉片為材料，用dH20清洗除去表面污物， 用濾紙吸干表面殘留水分，標(biāo)記分裝，置-2(TC冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?1. 2方法
1.2.1改良CTAB法的操作步驟
參照J(rèn)os印h Sambrook等[3]的方法并作適當(dāng)改良，進行基因組DNA的提取。
1.2.2 PCR擴增
反應(yīng)體系總體積為20uL，擴增程序為94 'C預(yù)變性5 min; 94 'C變性 1 min， 54 。C復(fù)性1 min， 72 。C延伸1. 5 min， 30循環(huán)；72 。C延伸10min， 4。C保存。
1.2.3 6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 1. 2. 4顯帶方法
1.2.4. 1
常規(guī)方法
聚丙烯酰胺凝膠的常規(guī)銀染方法的步驟如下
(1) 電泳結(jié)束后切斷電源，從電泳槽中倒出緩沖液，然后取下膠板，將 凝膠從玻板中取出放入裝有蒸餾水的瓷盤中，用蒸餾水漂洗2次；
(2) 固定加入固定液(10%冰醋酸)進行固定30 min，然后用蒸餾水 漂洗2次；
(3) 銀染加入染色液(0.2。/。的AgN03、0. 15。/。的甲醛)進行銀染30min，然 后用蒸餾水漂洗2次；
8(4) 顯影加入顯影液(30%的化20)3， 0. 15%甲醛和2%的硫代硫酸鈉)進 行顯色；
(5) 當(dāng)條帶清晰時，將玻璃板取出放入醋酸溶液中，終止2分鐘左右(氣 泡消失)；
(6) 凝膠攝影用數(shù)碼相機對凝膠進行照相。 2結(jié)果與分析
2. 1不同聚丙烯酰胺凝膠銀染方法銀染結(jié)果
不同聚丙烯酰胺凝膠銀染方法銀染結(jié)果見圖l一圖2，圖1為本發(fā)明銀染 方法的銀染結(jié)果，圖2為常規(guī)銀染方法的銀染結(jié)果。從圖中可以看出常規(guī)銀 染方法銀染的背景較淺，目的片段與背景反差不明顯，給準(zhǔn)確判型帶來一定 的困難。
表l不同銀染方法銀染時間比較 Table 1 Comparison of time in different sliver—stained menthod
染色流程 Detecting process
固定Fixation 銀染Silver staining 顯影Developing 終止/沖洗End/Rinse 共計total
常規(guī)方法
conventional silverstained
method (min)_
^5 30 10 2
72
本發(fā)明的方法
Improving silver-stained
method (min)_
10 10
20
實施例2
本發(fā)明DNA銀染方法的步驟如下:
9(1) 電泳結(jié)束后切斷電源，從電泳槽中倒出緩沖液，然后取下膠板，放 入裝有蒸餾水的瓷盤中，用蒸餾水漂洗2次；
(2) 銀染加入染色劑進行銀染，并用手或搖床不停搖動，染色9分鐘，
然后用蒸餾水漂洗2次，其中染色劑由0.2%的AgN03 (W/V)與10%的無水乙
醇(V/V)組成；
(3) 顯影加入顯影劑進行顯色，并用手或搖床不停搖動，顯影8分鐘，
至目的條帶清晰為止，其中，顯影劑由2y。的NaOH(W/V)和0.4。/。的甲醛(V/V) 組成；
(4) 用蒸餾水漂洗3次； ，
(5) 凝膠攝影用數(shù)碼相機對用數(shù)碼相機對平鋪于X線膠片觀片燈上的凝 膠照相。
最后所應(yīng)說明的是以上實施例僅用以說明，而非限制本發(fā)明的技術(shù)方
案，盡管參照上述實施例對本發(fā)明進行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員
應(yīng)當(dāng)理解依然可以對本發(fā)明進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精 神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1、一種DNA銀染方法，其特征在于該方法的步驟如下(1)電泳結(jié)束后切斷電源，從電泳槽中倒出緩沖液，然后取下膠板，放入裝有蒸餾水的瓷盤中，用蒸餾水漂洗2—3次；(2)銀染加入染色劑進行銀染，并不停搖動，染色8—12分鐘，然后用蒸餾水漂洗2—3次；(3)顯影加入顯影劑進行顯色，并不停搖動，顯影8—12分鐘；(4)用蒸餾水漂洗2—3次；(5)凝膠攝影將凝膠平鋪于X線膠片觀片燈上照相。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA銀染方法，其特征在于步驟(2)中的染色劑由0.1—0.2°/0的AgN03與10%的無水乙醇組成。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA銀染方法，其特征在于步驟(2)中的染色劑由0.2%的AgNCb與10%的無水乙醇組成。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA銀染方法，其特征在于步驟(3)中的顯影劑由2—3。/。的NaOH和0.2—0.4%的甲醛組成。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA銀染方法，其特征在于步驟(3)中的顯影劑由2—3M的NaOH和0.3y。的甲醛組成。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1—5中任一條所述的DNA銀染方法，其特征在于步驟(3)中的顯影至目的條帶清晰為止。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種DNA銀染方法，該方法的步驟如下(1)電泳結(jié)束后切斷電源，從電泳槽中倒出緩沖液，然后取下膠板，放入裝有蒸餾水的瓷盤中，用蒸餾水漂洗2-3次；(2)銀染加入染色劑進行銀染，并不停搖動，染色8-12分鐘，然后用蒸餾水漂洗2-3次；(3)顯影加入顯影劑進行顯色，并不停搖動，顯影8-12分鐘；(4)用蒸餾水漂洗2-3次；(5)凝膠攝影將凝膠平鋪于X線膠片觀片燈上照相。本發(fā)明的方法將固定步驟與染色步驟合而為一，采用乙醇進行固定，避免了常規(guī)銀染方法中采用乙酸固定而帶來的帶色較淺，同時其具有刺激性氣味，具有腐蝕性等缺陷；另外，本發(fā)明的方法無需采用乙醇或/和乙酸來終止顯色，省去了終止顯色步驟，避免了采用乙酸所帶來的刺激性氣味，具有腐蝕性等問題。
文檔編號G01N1/30GK101477001SQ20091006405
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月12日
發(fā)明者關(guān)小燕, 吳正景, 張國海, 段書延, 段佩楠, 白曉燕, 郭大龍, 高珊珊 申請人:河南科技大學(xué)