專利名稱：基于聚燦爛甲酚藍碳納米管復合電極的乙醇脫氫酶傳感器的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種乙醇脫氫酶傳感器，尤其是涉及用聚燦爛甲酚藍和碳納米管復合電極，以及乙醇脫氫酶的固定化制備方法。
背景技術：
生物體中絕大多數(shù)氧化還原反應都是在脫氫酶或氧化酶的催化下進行，其中脫氫 酶尤為重要。脫氫酶作為生物體內(nèi)的大分子是構成生命的主要基元，參與完成生命體中的 新陳代謝等許多生理過程，在這些生命過程中，脫氫酶都要經(jīng)歷電子轉(zhuǎn)移過程，在其氧化型 和還原型之間相互轉(zhuǎn)化。研究生物體中的電子傳遞過程能揭示生命過程的奧秘。脫氫酶的 電化學研究是生物電化學界和生物學界非常關注的研究問題。它的研究對于深入認識酶在 生命體內(nèi)的生理作用及電子傳遞反應傳遞機制以及開發(fā)新型生物傳感器、新型生物燃料電 池等生物電子器件具有重要的理論和應用指導意義。基于生物識別的高度專一性與電化學信號檢測的放大作用相結(jié)合的電化學生物 傳感器，具有靈敏度高、選擇性好、易于微型化和自動化等優(yōu)點，在生物分析和環(huán)境檢測等 領域應用廣泛。早在20世紀60年代，生物催化功能就已被用于電化學生物傳感器的研制。 但主要使用氧化酶作為生物敏感材料，如葡萄糖氧化酶、過氧化物酶等，通過檢測氧化酶催 化的生物反應中消耗的氧氣或產(chǎn)生過氧化氫，可以間接測定底物的含量(第一代電化學生 物傳感器)；或者使用電子媒介體，改變催化反應的路徑，達到測定底物的目的(第二代電 化學傳感器)，如目前市場上大多數(shù)血糖儀就是采用電化學測定葡萄糖氧化酶反應過程中 產(chǎn)生的電流，而得出血糖值。采用葡萄糖氧化酶的血糖儀在測定血糖值時，氧的影響是不可避免的，因為在電 子向電極轉(zhuǎn)移時氧與介質(zhì)競爭，高濃度氧可導致血糖值信號偏低，而低濃度氧則可導致血 糖值信號偏高。正像電化學干擾因素一樣，氧的影響在低糖時最明顯，這一影響通常太明 顯，以至這些試紙不能用于所有來源的血樣(靜脈、毛細血管和動脈血)的測定。采用葡萄 糖脫氫酶作為葡萄糖反應的酶，可避免這一問題。與葡萄糖氧化酶不同，葡萄糖脫氫酶反應 過程不需氧的參與，氧的影響大大降低，穩(wěn)定性更高，測試結(jié)果更準確。因此，用電化學方法 研究脫氫酶的氧化還原反應，為構筑脫氫酶生物傳感器提供理論和實驗基礎，具有廣闊的 應用價值和前景。脫氫酶反應過程雖然不需氧的參與，但需要NAD (P)作為輔基參與電子的傳遞。令 人遺憾的是NAD-NADH在電極上的氧化還原行為是不可逆的，NAD進行電化學還原不能得到 NADH，而是產(chǎn)生一種二聚物。NADH經(jīng)電化學氧化生成NAD，但過電位較大，NADH在玻碳電極 上于+0. 75V的電位下再循環(huán)利用，電位明顯高于其標準電位-0. 32V。因此降低NADH的氧 化過電位，對NADH高效的催化氧化，是構建電化學脫氫酶生物傳感器的先決條件。將染料 如亞甲藍、硫堇、亞甲綠和燦爛甲酚藍等固定在電極表面，研制成對NADH有良好催化活性 的仿生界面，降低NADH氧化過電位可達500-600mV。固定的方法有吸附法，現(xiàn)場電化學聚 合法及自組裝膜法等。吸附型仿生界面的最大缺點是不穩(wěn)定；現(xiàn)場電化學聚合法中酶的損耗較多；自組裝膜法耗費時間較長。因此研究酶及媒介體的固定方法是解決傳感器穩(wěn)定性 的關鍵。納米粒子具有獨特的化學性質(zhì)和物理性質(zhì)，如表面效應、微尺寸效應、量子效應和 宏觀量子隧道效應等，納米技術引入生物傳感器領域后，提高了生物傳感器的檢測性能，并 促發(fā)了新型的生物傳感器。因為具有了亞微米的尺寸、換能器、探針或者納米微系統(tǒng)，生物 傳感器的化學和物理性質(zhì)和其對生物分子或者細胞的檢測靈敏度大幅提高，檢測的反應時 間也得以縮短，并且可以實現(xiàn)高通量的實時檢測分析。納米技術構筑脫氫酶生物傳感器，已有一些報道，如瑞典Gorto n教授的課題組進 行了系統(tǒng)的研究。我國中科院長春應化所、南京大學、南京師范大學的一些課題組也進行了 有效的探索。其方法主要是利用碳納米管或金納米溶膠修飾電極，作為附載酶或媒介體的 載體，以吸附法和包埋法固定媒介體和酶，構筑脫氫酶傳感器。這些研究為構筑脫氫酶生物 傳感器提供了新的思路和方法。構筑脫氫酶電化學傳感器，需要解決的問題還很多，如選擇 合適的納米材料和適宜的納米技術構筑納米仿生界面，NADH有效的循環(huán)再利用，選擇合適 的媒介體，選擇合適的固定化材料和方法以保持酶的活性等等。利用聚燦爛甲酚藍催化氧化NADH，有一些報道，但大多采用循環(huán)伏安法在玻碳電 極表面制備聚燦爛甲酚藍。制備聚燦爛甲酚藍/碳納米管修飾電極及構筑乙醇脫氫酶傳感 器還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種乙醇脫氫酶傳感器，尤其是涉及用聚燦爛甲酚藍和碳納米管復合 電極，固定化乙醇脫氫酶等制備方法。乙醇脫氫酶電化學傳感器，其特征在于表示為乙醇脫氫酶/聚燦爛甲酚藍/單壁 碳納米管/玻碳電極(ADH/PBCB/SWCNT/GCE)。.乙醇脫氫酶電化學傳感器的制備步驟如下a)將市售單壁碳納米管經(jīng)混酸恒溫40°C超聲分散成均勻的黑色溶膠，抽慮純化， 清洗，真空干燥，制得單壁碳納米管水溶液。滴涂2 μ L 10 μ L單壁碳納米管水溶液至潔 凈的玻碳電極表面，室溫干燥，制得單壁碳納米管修飾電極。b)將此電極放入燦爛甲酚藍溶液中，采用三電極系統(tǒng)，硝酸鉀為支持電解質(zhì)，磷酸 緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值，控制電位極化，取出電極，清洗，制得聚燦爛甲酚藍/單壁碳納米管修 飾電極。c)取多糖水凝膠溶液，加入少許有機小分子，再加入乙醇脫氫酶，制得酶溶膠。取 10 μ L酶溶膠滴涂于燦爛甲酚藍/單壁碳納米管修飾電極表面，4°C下干燥，制得乙醇脫氫 酶傳感器。步驟⑵中，所述的溶液pH值為8. 0，控制電位為+0. 9V，極化時間為60s 90s。步驟(3)中，多糖水凝膠溶液使用卡拉膠、瓊脂糖、海藻酸鈉、甲基纖維素等中的 一種，濃度為 0. 2% 0. 8% (W/W)。步驟(3)中，有小分子為二甲亞砜，二甲基甲酰胺，甘油等中的一種，加入量為多 糖水凝膠有機不分子=3 1 (V/V)。本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在用恒電位法制備了聚燦爛甲酚藍/碳納米管納米復合物修飾玻碳電極，此方法具有簡便、快速、高效的特點。用多糖水凝膠固定化酶于電極表面， 多糖水凝膠具有較強的彈性、高穩(wěn)定性和良好的生物親和性，是固定酶的理想生物聚合物； 多糖水凝膠在各種有機溶劑中很穩(wěn)定；多糖水凝膠具有一定的孔徑，底物分子能自由擴散 至瓊脂糖凝膠中，與固定化的蛋白質(zhì)酶作用；多糖水凝膠呈網(wǎng)狀結(jié)構，其中形成許多水腔， 為酶提供適宜的微水環(huán)境；保持酶的原始構象和生物活性。在制備多糖水凝膠時，要注意多 糖的濃度合適，控制加熱溫度。在水凝膠中加入有機小分子，加速了多糖水凝膠的凝膠化過 程，形成均勻和穩(wěn)定的水凝膠，能將蛋白質(zhì)牢固地固定在電極表面，增加酶傳感器的使用壽 命。制得的聚燦爛甲酚藍/單壁碳納米管修飾電極用于檢測煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，具有 方法簡便，且線性寬(3. O 104. 2 μ M)、響應快(< 5s)、靈敏度高(9. 884ηΑ/μ M)、檢出限 低(1. 0 μ Μ, S/N = 3)，重現(xiàn)性好、穩(wěn)定和抗干擾等優(yōu)異性能。
制得的乙醇脫氫酶傳感器用于乙醇的檢測，乙醇濃度范圍0. 4 2. 4mM內(nèi)，有線性 關系，檢出限為0. ImM(S/N = 3)，具有酶的高活性(米氏常數(shù)為2. 3mM)、穩(wěn)定性高和良好的 重現(xiàn)性。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳述。
附圖為本發(fā)明制作工藝流程示意圖。圖中GC 玻碳電極，SffNT 單壁碳納米管，BCB 燦爛甲酚藍，PBCB 聚燦爛甲酚藍。
具體實施例方式表示為乙醇脫氫酶/聚燦爛甲酚藍/單壁碳納米管/玻碳電極(ADH/PBCB/SWCNT/ GCE)，即用恒電位一步法制備聚燦爛甲酚藍/單壁碳納米管修飾電極，電位控制在+0. 9V， 時間60s 90s，再用0. 2 0Z0 0. 4% (ff% )多糖水凝膠在電極表面固定乙醇脫氫酶。其步 驟如下(1)將市售單壁碳納米管經(jīng)混酸恒溫40°C超聲分散成均勻的黑色溶膠，抽慮純化， 清洗，真空干燥，制得單壁碳納米管水溶液，滴涂2 μ L 10 μ L單壁碳納米管水溶液至潔凈 的玻碳電極表面，室溫干燥，制得單壁碳納米管修飾電極；(2)將此電極放入燦爛甲酚藍溶 液中，采用三電極系統(tǒng)，硝酸鉀為支持電解質(zhì)，磷酸緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值，控制電位極化，取 出電極，清洗，制得聚燦爛甲酚藍/單壁碳納米管修飾電極；(3)取多糖水凝膠溶液，加入少 許有機小分子，再加入乙醇脫氫酶，制得酶溶膠。取10 μ L酶溶膠滴涂于燦爛甲酚藍/單壁 碳納米管修飾電極表面，4°C下干燥，制得乙醇脫氫酶傳感器。步驟(2)中，所述的溶液pH值 為8. 0，控制電位為+0. 9V，極化時間為60s 90s。步驟(3)中，多糖水凝膠溶液使用卡拉 膠、瓊脂糖、海藻酸鈉、甲基纖維素等中的一種，濃度為0.2% 0.8% (W/W)。步驟(3)中， 有小分子為二甲亞砜，二甲基甲酰胺，甘油等中的一種，加入量為多糖水凝膠有機不分子 =3:1 (V/V)。(1)單壁碳納米管修飾玻碳電極的制備將玻碳電極用金相砂紙(粒度10000目)打磨成鏡面，再分別用1. 0,0. 3,0. 05微 米氧化鋁顆粒將其拋光，然后分別置于水、無水乙醇、水中徹底超聲洗凈。將潔凈玻碳電極 放入0. 5M H2SO4溶液中，在-1.0 +1.0V (參比SCE)掃描范圍循環(huán)伏安法活化，掃描直至達 到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖為止。取出電極，水洗凈后，氮氣吹干，滴涂3 μ LSWNT水溶液于表面，室溫慢干后備用。(2)聚燦爛甲酚藍-單壁碳納米管修飾玻碳電極(PBCB/SWNT/GCE)的制備將單壁碳納米管修飾玻碳電極浸泡于含0. 5mM BCB和0. IM KNO3,控制溶液pH = 8?？刂齐娢?0. 9V，極化60 90秒，清洗電極，，去除表面殘留物，晾干，4°C冰箱存放備用。(3)乙醇脫氫酶電化學傳感器的制備(ADH/PBCB/SWCNT/GCE)。0.4% (W/W)卡拉膠水溶液與二甲亞砜3 KV V)混和，加入乙醇脫氫酶，得 30mg/mL酶溶膠。取10 μ L酶溶膠滴涂于PBCB/SWNT/GCE，4°C下4小時慢干。所得乙醇脫 氫酶傳感器可于4°C PBS中貯存。(4)將聚燦爛甲酚藍-單壁碳納米管修飾玻碳電極置于5mL pH = 7. 5PBS溶 液中，控制電極電位0V，持續(xù)間隔45s加入5μ L 3. OmM NADH，用電流-時間法定量檢測 NADH0線性范圍為3.0 104. 2μΜ、響應時間< 5s、檢測靈敏度為9. 884ηΑ/μ Μ、檢出限為 1. 0yM(S/N = 3)。
(5)將乙醇脫氫酶電化學傳感器置于含3. OmM NAD+的5mL pH = 7. 5PBS中，控制 電位0V，持續(xù)間隔45s加入5 μ L0. 4Μ乙醇，用電流-時間法定量檢測乙醇。乙醇濃度線 性范圍為0. 4 2. 4mM，檢出限為0. ImM(S/N = 3)，米氏常數(shù)KappM為2. 3mM,相對標準偏差 < 3. 9%。
權利要求
乙醇脫氫酶電化學傳感器，其特征在于表示為乙醇脫氫酶/聚燦爛甲酚藍/單壁碳納米管/玻碳電極(ADH/PBCB/SWCNT/GCE)，即用恒電位一步法制備聚燦爛甲酚藍/單壁碳納米管修飾電極，電位控制在+0.9V，時間60s～90s，再用0.2％～0.4％(W％)多糖水凝膠在電極表面固定乙醇脫氫酶。
2.如權利要求1所述的乙醇脫氫酶電化學傳感器的制備方法，其特征在于其步驟如下(1)將市售單壁碳納米管經(jīng)混酸恒溫40°C超聲分散成均勻的黑色溶膠，抽慮純化，清 洗，真空干燥，制得單壁碳納米管水溶液，滴涂2 μ L 10 μ L單壁碳納米管水溶液至潔凈的 玻碳電極表面，室溫干燥，制得單壁碳納米管修飾電極；(2)將此電極放入燦爛甲酚藍溶液中，采用三電極系統(tǒng)，硝酸鉀為支持電解質(zhì)，磷酸緩 沖溶液調(diào)節(jié)PH值，控制電位極化，取出電極，清洗，制得聚燦爛甲酚藍/單壁碳納米管修飾 電極；(3)取多糖水凝膠溶液，加入少許有機小分子，再加入乙醇脫氫酶，制得酶溶膠。取 10 μ L酶溶膠滴涂于燦爛甲酚藍/單壁碳納米管修飾電極表面，4°C下干燥，制得乙醇脫氫 酶傳感器。
3.如權利要求2所述的乙醇脫氫酶電化學傳感器的制備方法，其特征在于步驟(2) 中，所述的溶液PH值為8. 0，控制電位為+0. 9V，極化時間為60s 90s。
4.如權利要求2所述的乙醇脫氫酶電化學傳感器的制備方法，其特征在于步驟 (3)中，多糖水凝膠溶液使用卡拉膠、瓊脂糖、海藻酸鈉、甲基纖維素等中的一種，濃度為 0. 2% 0. 8% (W/W)。
5.如權利要求2所述的乙醇脫氫酶電化學傳感器的制備方法，其特征在于步驟(3) 中，有小分子為二甲亞砜，二甲基甲酰胺，甘油等中的一種，加入量為多糖水凝膠有機不 分子=3 1 (V/V) 0
全文摘要
本發(fā)明提供一種基于聚燦爛甲酚藍碳納米管復合電極的乙醇脫氫酶傳感器，表示為乙醇脫氫酶/聚燦爛甲酚藍/單壁碳納米管/玻碳電極(ADH/PBCB/SWCNT/GCE)，即用恒電位一步法制備聚燦爛甲酚藍/單壁碳納米管修飾電極，電位控制在+0.9V，時間60s～90s，再用0.2％～0.4％(W％)多糖水凝膠在電極表面固定乙醇脫氫酶，用恒電位法制備了聚燦爛甲酚藍/碳納米管納米復合物修飾玻碳電極，該電極檢測煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，方法簡便，且線性寬、響應快、靈敏度高、檢出限低，重現(xiàn)性好、穩(wěn)定和抗干擾等優(yōu)異性能。將乙醇脫氫酶用多糖水凝膠固定在聚燦爛甲酚藍/碳納米管納米復合物修飾玻碳電極表面，制備脫氫酶傳感器，保持高酶活性，具有高穩(wěn)定性和良好的重現(xiàn)性。
文檔編號G01N27/327GK101825602SQ20091006397
公開日2010年9月8日 申請日期2009年9月11日 優(yōu)先權日2009年9月11日
發(fā)明者劉慧宏, 楊冬偉, 肖沖 申請人:襄樊學院