專利名稱：：核酸探針及探針聚合物的形成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新核酸探針，形成該核酸探針的自我聚合體(聚合物)，能夠提高標(biāo)的分析物檢測(cè)靈敏度的探針聚合物形成方法，通過(guò)該方法生成探針聚合物以及利用該方法檢測(cè)標(biāo)的分析物的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明人提出過(guò)一種去酶恒溫核酸擴(kuò)增法，即使用多種含有與其他核酸探針互補(bǔ)的堿基序列的核酸探針，通過(guò)探針的自我聚合反應(yīng)(Probealternationlinkselfassembly^reaction)形成核酸探針聚合體(聚合物)的方法(以下，將通過(guò)探針的自我聚合反應(yīng)形成聚合物的方法稱為PALSAR法)(專利文獻(xiàn)14)。此外，本發(fā)明人也提出利用Palsar法提高目標(biāo)基因的檢測(cè)靈敏度的方法(專利文獻(xiàn)5)。通過(guò)上述方法，雖然能高靈敏度地檢測(cè)出目標(biāo)基因，但需要使用多種核酸探針來(lái)形成信號(hào)探針聚合物。專利文獻(xiàn)1日本專利第3267576號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)1日本專利第3310662號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3國(guó)際公開第02/31192號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4日本專利特開2002-355081號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5國(guó)際公開第03/029441號(hào)公報(bào)
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的課題本發(fā)明目的在于提供能夠簡(jiǎn)便且有效地形成核酸探針聚合物的方法，由該方法形成的探針聚合物，使用該方法的新核酸探針以及高靈敏度且簡(jiǎn)便地檢測(cè)標(biāo)的分析物的標(biāo)的分析物檢測(cè)方法。解決課題的手段本發(fā)明人為了解決上述課題，經(jīng)過(guò)反復(fù)研究，終于發(fā)現(xiàn)在核酸探針的一個(gè)區(qū)域，以此區(qū)域的中心位置為界，通過(guò)構(gòu)成對(duì)稱相對(duì)的堿基間具有互補(bǔ)的鏡像關(guān)系(對(duì)稱)的堿基序列，并且僅以一種核酸探針形成該核酸探針的聚合物。即本發(fā)明中的核酸探針的特征是，含有3個(gè)以上的核酸區(qū)域，同時(shí)該核酸探針的各個(gè)核酸區(qū)域含有第1區(qū)域以及與該第1區(qū)域互補(bǔ)且鄰接的第2區(qū)域。本發(fā)明的形成探針聚合物的方法，其特征是使本發(fā)明中的核酸探針發(fā)生反應(yīng)生成該核酸探針的聚合物。本發(fā)明的探針聚合物的特征是通過(guò)上述的本發(fā)明中的探針聚合物形成方法形成。本發(fā)明的標(biāo)的分析物的檢測(cè)方法，其特征是根據(jù)上述本發(fā)明中探針聚合物的形成方法形成探針聚合物，通過(guò)檢測(cè)出該探針聚合物來(lái)檢測(cè)標(biāo)的分析物。本發(fā)明的標(biāo)的分析物的檢測(cè)方法中，優(yōu)選使用能與上述標(biāo)的分析物特異結(jié)合可能且含有與上述核酸探針相同的一部分或者全部堿基序列的輔助探針，形成含有上述標(biāo)的分析物、上述輔助探針和上述探針聚合物的復(fù)合體，通過(guò)分析該復(fù)合體檢測(cè)上述標(biāo)的分析物。同時(shí)，本說(shuō)明書中的輔助探針是指含有能與被檢測(cè)標(biāo)的分析物進(jìn)行特異結(jié)合的部分，并且具有與用于形成聚合物的上述核酸探針相同的一部分或者全部堿基序列，起連接標(biāo)的分析物與探針聚合物的作用。上述標(biāo)的分析物可以列舉，例如，核酸、抗原、抗體、受體、半抗原、酶、蛋白質(zhì)、肽、聚合物以及糖類構(gòu)成的群類中至少一種。上述標(biāo)的分析物是核酸的情況時(shí)，上述核酸探針通過(guò)構(gòu)成含有與上述標(biāo)的核酸(目標(biāo)基因)的一部分互補(bǔ)的序列，能使標(biāo)的核酸與探針聚合物相結(jié)合。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，能僅通過(guò)一種核酸探針形成該核酸探針的聚合物。此外，通過(guò)本發(fā)明，能簡(jiǎn)便地檢測(cè)出標(biāo)的分析物并且能顯著的提高其檢測(cè)靈敏度。圖1表示一例本發(fā)明的核酸探針的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖圖2表示圖1記載的核酸探針的結(jié)合方式的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖圖3表示由圖1記載的核酸探針形成的探針聚合物的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖圖4顯示實(shí)施例1的結(jié)果的照片圖5顯示實(shí)施例2的結(jié)果的照片圖6顯示實(shí)施例3的結(jié)果的照片符號(hào)說(shuō)明10本發(fā)明的核酸探針，10a、10b、IOc核酸區(qū)域，20氫鍵，30探針聚合物。具體實(shí)施例方式以下根據(jù)附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明，圖示例僅例示，當(dāng)然可以在不脫離本發(fā)明的技術(shù)思想的范圍內(nèi)進(jìn)行各種變形。圖1是表示一例本發(fā)明的核酸探針簡(jiǎn)要說(shuō)明圖。圖2是表示圖1中的核酸探針的結(jié)合方式的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖。圖3是表示由圖1中的核酸探針形成的自我聚合體(探針聚合物)的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖。本發(fā)明的核酸探針，其特征是含有3個(gè)以上的核酸區(qū)域，該核酸探針的各個(gè)核酸區(qū)域含有相互鄰接的第1區(qū)域以及與該第1區(qū)域互補(bǔ)的第2區(qū)域，通過(guò)使該核酸探針發(fā)生反應(yīng)可以形成該核酸探針的聚合物。本說(shuō)明書中，核酸探針的核酸區(qū)域是指上述第1區(qū)域與第2區(qū)域構(gòu)成的區(qū)域。此外，也稱各核酸區(qū)域中的第1區(qū)域以及第2區(qū)域的各自的互補(bǔ)區(qū)域。本發(fā)明中核酸探針包含的核酸區(qū)域是3個(gè)以上，優(yōu)選3個(gè)以上10以下，更優(yōu)選3個(gè)以上5以下。圖1表示一例本發(fā)明的核酸探針簡(jiǎn)要說(shuō)明圖，其中包含3個(gè)核酸區(qū)域。如圖1所示，本發(fā)明的核酸探針10從5’端部開始按順序含有核酸區(qū)域10a，核酸區(qū)域IOb以及核酸區(qū)域10c，各個(gè)核酸區(qū)域10a，IOb以及IOc包括與之互補(bǔ)且鄰接的2區(qū)域。也即，上述核酸區(qū)域IOa包含互補(bǔ)區(qū)域X以及與其鄰接并含有與該互補(bǔ)區(qū)域X互補(bǔ)的堿基序列的互補(bǔ)區(qū)域X’，上述核酸區(qū)域IOb包含互補(bǔ)區(qū)域Y以及與其鄰接并含有與該互補(bǔ)區(qū)域Y互補(bǔ)的堿基序列的互補(bǔ)區(qū)域Y’，上述核酸區(qū)域IOc包含互補(bǔ)區(qū)域Z以及與其鄰接并含有與該互補(bǔ)區(qū)域Z互補(bǔ)的堿基序列的互補(bǔ)區(qū)域V。本發(fā)明的核酸探針10中，互補(bǔ)區(qū)域X與互補(bǔ)區(qū)域X’，互補(bǔ)區(qū)域Y與互補(bǔ)區(qū)域Y’，互補(bǔ)區(qū)域ζ與互補(bǔ)區(qū)域V是分別能夠與之雜化的互補(bǔ)核酸區(qū)域，如圖2所示，互補(bǔ)區(qū)域X與互補(bǔ)區(qū)域V相結(jié)合圖2(a)，互補(bǔ)區(qū)域Y與互補(bǔ)區(qū)域Y’相結(jié)合圖2(b)，互補(bǔ)區(qū)域Z與互補(bǔ)區(qū)域Z’相結(jié)合圖2(c)。圖2中，符號(hào)20表示氫鍵。其中，作為適宜的例子，圖1所舉是含有3個(gè)核酸區(qū)域(10a，IOb以及IOc)的核酸探針，但是并沒(méi)有特別將核酸區(qū)域的數(shù)目限定為3個(gè)以上。本發(fā)明中核酸探針10通過(guò)雜化反應(yīng)，如圖3所示，核酸探針10進(jìn)行自我聚合，形成核酸探針10自我聚合體即探針聚合物30。本發(fā)明的核酸探針，其各個(gè)互補(bǔ)區(qū)域的長(zhǎng)度以堿基數(shù)量來(lái)說(shuō)，優(yōu)選2個(gè)堿基以上，更優(yōu)選350個(gè)堿基，進(jìn)一步優(yōu)選415個(gè)堿基。此外，核酸探針中各個(gè)互補(bǔ)區(qū)域的長(zhǎng)度以相同為宜。本發(fā)明的核酸探針的堿基序列最優(yōu)是由各個(gè)核酸區(qū)域中的第1區(qū)域以及第2區(qū)域的互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成即可，無(wú)特別限定，各個(gè)互補(bǔ)區(qū)域兩末端的堿基優(yōu)選鳥瞟呤或者胞嘧啶。各個(gè)互補(bǔ)區(qū)域兩端的堿基是鳥瞟呤或者胞嘧啶時(shí)，能縮短反應(yīng)時(shí)間，以更低的反應(yīng)溫度形成穩(wěn)定的探針聚合物，同時(shí)還可以提高操作性和檢測(cè)靈敏度。本發(fā)明的核酸探針通常由DNA或者RNA構(gòu)成，核酸類似體也可以。核酸類似體可以列舉，例如，肽核酸(PNA，參閱國(guó)際公開第92/20702號(hào)公報(bào)等)和LockedNucleicAcid(LNA,參KoshkinAAetal.Tetrahedronl998.54,3607-3630.,KoshkinAAetal.J.Am.Chem.Soc.1998.120,13252-13253.,WahlestedtCetal.PNAS.2000.97,5633-5638.等)。此外，本發(fā)明中，核酸探針內(nèi)的核酸組成無(wú)必要僅為一種，比如，僅由DNA構(gòu)成，根據(jù)具體要求，也可能使用例如由DNA和RNA構(gòu)成的低聚核苷酸·探針(嵌合體探針)。這些探針均可由已知的方法合成。例如，使用AppliedBiosystem公司(AppliedBiosystemInc.)生產(chǎn)的DNA合成器394型，通過(guò)亞磷酰胺法可以合成DNA探針。此外還有，磷酸三酯法，H-膦酸鹽(phosphonate)法，硫代膦酸鹽法等，使用以上任意一種方法合成均可。本發(fā)明形成探針聚合物的方法是使上述本發(fā)明的核酸探針發(fā)生反應(yīng)形成探針聚合物的方法。如圖3所示，通過(guò)使多種本發(fā)明的核酸探針10發(fā)生雜化反應(yīng)，根據(jù)探針的濃度有效地形成核酸探針10的自我聚合體即探針聚合物30。所使用的核酸探針的數(shù)量無(wú)特別限定，但是一般在IO2IO15根的范圍內(nèi)使用。對(duì)于反應(yīng)緩沖溶液的組成，其濃度無(wú)特別限定，核酸擴(kuò)增常用的通常緩沖溶液適當(dāng)使用即可。PH值在常用的范圍即可，優(yōu)選7.09.0的范圍內(nèi)。雜化反應(yīng)的溫度條件也無(wú)特別限定，通常的溫度即可，但優(yōu)選在反應(yīng)溶液中形成部分的反應(yīng)溫度區(qū)，在此反應(yīng)溫度區(qū)內(nèi)發(fā)生自我聚合反應(yīng)(國(guó)際公開第2005/106031號(hào)公報(bào))。適用的部分反應(yīng)溫度區(qū)優(yōu)選4080°C，更優(yōu)選5565"C。通過(guò)使用本發(fā)明的探針聚合物的形成方法檢測(cè)標(biāo)的分析物，能簡(jiǎn)便且高靈敏度地檢測(cè)標(biāo)的分析物。標(biāo)的分析物的檢測(cè)方法無(wú)特別限定，采用已知的方法即可。本發(fā)明的標(biāo)的分析物的檢測(cè)方法是利用上述本發(fā)明的探針聚合物形成方法生成聚合物，通過(guò)檢測(cè)該聚合物測(cè)定樣本中標(biāo)的分析物是否存在的方法。上述標(biāo)的分析物的檢測(cè)方法，具體的可以列舉，使標(biāo)的分析物與探針聚合物形成復(fù)合體，通過(guò)檢測(cè)探針聚合物測(cè)定標(biāo)的分析物的方法以及僅在標(biāo)的分析物存在的情況下，利用形成聚合物的方法生成聚合物，通過(guò)檢測(cè)聚合物測(cè)定標(biāo)的分析物的方法(例如，使用切斷的核酸探針，僅在標(biāo)的分析物存在的情況下，通過(guò)雜化反應(yīng)連接核酸探針形成聚合物的方法)本發(fā)明中的標(biāo)的分析物測(cè)定用樣本，可以適宜使用有可能含有該標(biāo)的分析物的所有樣本，例如，血液、血清、尿、大便、腦脊液、組織液、痰、細(xì)胞培養(yǎng)物等生物由來(lái)樣本，含有或者可能已感染病毒、細(xì)菌、霉等的樣本。上述標(biāo)的分析物可以列舉，例如，核酸、抗原、抗體、受體、半抗原、酶、蛋白質(zhì)、肽、聚合物、糖類以及它們的組合所構(gòu)成的。該標(biāo)的分析物可以由樣本配制也可離析出來(lái)。此夕卜，樣本中的標(biāo)的核酸也可使用以已知的方法擴(kuò)增過(guò)的DNA或者RNA等核酸。上述標(biāo)的核酸(目標(biāo)基因)可以使用單鏈的DNA以及/或者RNA，與雙鏈的DNA以及/或者RNA。此外，上述標(biāo)的核酸可以使用SNPs(單核苷酸多態(tài))本發(fā)明的檢測(cè)方法中，優(yōu)選含有一個(gè)或者多個(gè)具有與本發(fā)明的核酸探針相同的一部分或者全部堿基序列的區(qū)域(稱為探針結(jié)合區(qū)域)，并且含有能與標(biāo)的分析物進(jìn)行特異結(jié)合的部分(稱為目標(biāo)區(qū)域T)的輔助探針。比起使用上述輔助探針，形成含有標(biāo)的分析物、輔助探針和聚合物的復(fù)合體，通過(guò)分析復(fù)合體測(cè)定上述標(biāo)的分析物的方法，本發(fā)明的檢測(cè)方法更能簡(jiǎn)便地檢測(cè)標(biāo)的分析物。目標(biāo)區(qū)域優(yōu)選位于輔助探針末端。上述目標(biāo)區(qū)域可根據(jù)標(biāo)的分析物進(jìn)行選擇。例如，標(biāo)的分析物是核酸的情況時(shí)，目標(biāo)區(qū)域優(yōu)選構(gòu)成含有與標(biāo)的核酸互補(bǔ)的堿基序列，使用含有與標(biāo)的核酸的1區(qū)域互補(bǔ)的序列的輔助探針，通過(guò)雜化反應(yīng)結(jié)合的區(qū)域。標(biāo)的分析物是抗原等蛋白質(zhì)的情況時(shí)，優(yōu)選其直接或者間接結(jié)合于能與抗體等標(biāo)的分析物進(jìn)行特異結(jié)合的物質(zhì)。并且，輔助探針與標(biāo)的分析物之間，兩者直接結(jié)合亦可，通過(guò)其他物質(zhì)介入間接結(jié)合亦可。具體的，優(yōu)選通過(guò)化學(xué)結(jié)合與抗體結(jié)合的輔助探針，例如，使用預(yù)先將氨基和羧基與抗體相結(jié)合的輔助探針。另外，選用使用抗生蛋白鏈霉素與生物素化抗體相結(jié)合的輔助探針也可以。上述輔助探針的探針結(jié)合區(qū)域優(yōu)選含有1個(gè)以上與本發(fā)明的核酸探針的互補(bǔ)區(qū)域具有相同堿基序列的區(qū)域結(jié)構(gòu)，更優(yōu)選含有2種以上與本發(fā)明的核酸探針相同的互補(bǔ)區(qū)域，輔助探針與本發(fā)明的核酸探針通過(guò)2個(gè)以上互補(bǔ)區(qū)域連結(jié)的結(jié)構(gòu)。此外，使用含有多個(gè)相同的探針結(jié)合區(qū)域的輔助探針，一個(gè)輔助探針連結(jié)有兩個(gè)以上的核酸探針亦可。此外，標(biāo)的分析物是核酸的情況時(shí)，本發(fā)明的核酸探針構(gòu)成含有與上述標(biāo)的核酸的一部分互補(bǔ)的序列，使用該核酸探針形成標(biāo)的核酸和探針聚合物的復(fù)合體，通過(guò)檢測(cè)探針聚合物測(cè)定標(biāo)的核酸。此外，本發(fā)明的檢測(cè)方法中，優(yōu)選含有通過(guò)標(biāo)的分析物檢測(cè)用反應(yīng)器材捕捉標(biāo)的分析物的步驟。本發(fā)明適用于標(biāo)的分析物檢測(cè)用的各種反應(yīng)器材，特別的，DNA芯片或者DNA微陣列(參閱Marshall,A.,Hodgson,J.DNAchips:anarrayofpossibilities.NatBiotechnol.16，27-31，1998.等)，微孔板以及磁性體粒子等同樣適用。使用反應(yīng)器材捕捉標(biāo)的分析物的方法無(wú)特別限定，但是優(yōu)選使用連接有能與標(biāo)的分析物進(jìn)行特異結(jié)合的捕捉用物質(zhì)的反應(yīng)器材，通過(guò)該捕捉用物質(zhì)與標(biāo)的分析物結(jié)合，使反應(yīng)器材與標(biāo)的分析物結(jié)合。該捕捉用物質(zhì)根據(jù)標(biāo)的分析物進(jìn)行適宜選擇即可，無(wú)特別限定。標(biāo)的分析物是核酸的情況時(shí)，捕捉用物質(zhì)優(yōu)選含有與該標(biāo)的核酸的1區(qū)域(與輔助探針互補(bǔ)的區(qū)域除外)相配對(duì)的堿基序列的低聚核苷酸(捕捉探針)。標(biāo)的分析物是抗原或者抗體的情況時(shí)，捕捉用物質(zhì)優(yōu)選使用與標(biāo)的分析物進(jìn)行特異結(jié)合的抗體或者抗原。此外，標(biāo)的分析物是糖類的情況時(shí)，捕捉用物質(zhì)優(yōu)選使用與標(biāo)的分析物進(jìn)行特異結(jié)合的外源凝集素。本發(fā)明中，探針聚合物的檢測(cè)方法無(wú)特別限定，優(yōu)選預(yù)先用標(biāo)識(shí)物質(zhì)標(biāo)記上述核酸探針，利用該標(biāo)識(shí)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。上述標(biāo)識(shí)物質(zhì)優(yōu)選吖啶鐺酯，放射性同位素，生物素，異羥洋地黃毒苷配基，熒光物質(zhì)，發(fā)光物質(zhì)或者色素，考慮到操作性，定量性及靈敏度特別優(yōu)選吖啶鐺酯。具體的，預(yù)先用熒光物質(zhì)標(biāo)記本發(fā)明的核酸探針，可以通過(guò)熒光物質(zhì)的光化學(xué)變化檢測(cè)探針聚合物是否存在。再者，預(yù)先用發(fā)色系酶或者發(fā)光系酶標(biāo)記本發(fā)明的核酸探針，可以通過(guò)光化學(xué)變化檢測(cè)探針聚合物是否存在。進(jìn)一步，預(yù)先用放射性同位素標(biāo)記本發(fā)明的核酸探針，可以通過(guò)放射性同位素測(cè)定探針聚合物是否存在。此外，對(duì)于上述形成的探針聚合物，可以通過(guò)標(biāo)識(shí)探針與探針聚合物進(jìn)行雜化檢測(cè)探針聚合物是否存在。標(biāo)識(shí)探針可以使用發(fā)色系酶，發(fā)光系酶或者放射性同位素等進(jìn)行標(biāo)記。此外，對(duì)于上述形成的探針聚合物，加入具有與核酸相結(jié)合性質(zhì)的熒光物質(zhì)，可以通過(guò)這個(gè)熒光物質(zhì)的光化學(xué)變化檢測(cè)上述探針聚合物是否存在。熒光物質(zhì)優(yōu)選具有能插入到雙鏈的堿基對(duì)間的性質(zhì)的熒光物質(zhì)。此外，本發(fā)明的探針聚合物在260nm下極大地顯現(xiàn)出紫外吸收帶的強(qiáng)度降低(減色特征)這個(gè)淡色效果，因此可以通過(guò)測(cè)定波長(zhǎng)260nm下的紫外吸收確認(rèn)聚合物的狀態(tài)。實(shí)施例以下列舉實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的說(shuō)明，實(shí)施例僅供參考，本發(fā)明不限于此。(實(shí)施例1)通過(guò)電泳確認(rèn)本發(fā)明的核酸探針有無(wú)生成探針聚合物。將含有下述堿基序列的核酸探針-1(序列號(hào)1)溶解于反應(yīng)溶液4XSSC，配制成2000pmol/mL的探針溶液。核酸探針-1的堿基序列(5'-XJ堿基數(shù)7)X/(堿基數(shù)7)_Yi(堿基數(shù)7)Y1'(堿基數(shù)7)-Z1(堿基數(shù)7)Z1'(堿基數(shù)7)_3')5，-CCTGTCTAGACAGGCTTCGGATCCGAAGGGTAGCATGCTACC-3，(序列號(hào)1)將上述配制的探針溶液在94°C下加熱1分鐘，立即用冰冷卻。接著，預(yù)熱軟管使其達(dá)到各個(gè)反應(yīng)溫度35，38，40，43，46，48，50，53，55，57，59，61，64，66，68或者70°C，反應(yīng)1小時(shí)。將反應(yīng)后的標(biāo)本置于0.25%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖4所示。圖4圖6中，M表示分子尺寸標(biāo)記，各個(gè)數(shù)字表示相應(yīng)的反應(yīng)溫度條件。如圖4所示，55°C61°C的反應(yīng)溫度中，確認(rèn)探針聚合物是否形成。(實(shí)施例2)使用含有下述堿基序列的核酸探針_2(序列號(hào)2)來(lái)替代核酸探針-1，除此之外，按照與實(shí)施例1同樣的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖5所示。核酸探針-2的堿基序列(5'_X2(堿基數(shù)6)X2'(堿基數(shù)6)-Υ2(堿基數(shù)6)Y2'(堿基數(shù)6)-Z2(堿基數(shù)6)Z2'(堿基數(shù)6)-3')5，-CCTGTCGACAGGCTCGGATCCGAGGGAGCATGCTCC-3，(序列號(hào)2)如圖5所示，53°C61°C的反應(yīng)溫度中，確認(rèn)探針聚合物是否形成。(實(shí)施例3)使用含有下述堿基序列的核酸探針_3(序列號(hào)3)，來(lái)替代核酸探針-1，除此之外，按照與實(shí)施例1同樣的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖6所示。核酸探針-3的堿基序列(5'_X3(堿基數(shù)5)X3'(堿基數(shù)5)-Υ3(堿基數(shù)5)Y3'(堿基數(shù)5)-Z3(堿基數(shù)5)Z3'(堿基數(shù)5)-3')5，-CCTGCGCAGGCTCGGCCGAGGGACGCGTCC-3，(序列號(hào)3)如圖6所示，50°C59°C的反應(yīng)溫度中，確認(rèn)探針聚合物是否形成。(實(shí)施例4)使用通過(guò)本發(fā)明的核酸探針形成的探針聚合物檢測(cè)目標(biāo)基因。使用與金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的rRNA含有相同的堿基序列的合成DNA(目標(biāo)低聚DNA)(序列號(hào)4)作為標(biāo)的分析物。目標(biāo)低聚DNA的堿基序列5’-TTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATATTTTGAACCGCATGGTTCAAAAGTGAAAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGATGGATCCGCGCTGCATTAGCTA-3，(序列號(hào)4)使用含有與上述目標(biāo)低聚DNA(序列號(hào)4)互補(bǔ)的序列的核酸探針(序列號(hào)5)作為捕捉探針。捕捉探針的堿基序列5，-CGTCTTTCACTTTTGAACCATGCGGTTCAAAATATTATCCGG-3，-氨基鍵(序列號(hào)5)將上述捕捉探針固定在各個(gè)條井型96井微量滴度酶標(biāo)板上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用吖啶鐺酯(AE)對(duì)實(shí)施例1中的核酸探針-1(序列號(hào)1)的5’末端進(jìn)行標(biāo)記，將其用作形成探針聚合物的核酸探針。將該AE標(biāo)記過(guò)的核酸探針-1溶解于溶液IOOmM-丁二酸鋰、600mM-氯化鋰、2mM-EDTA、5%-LDS、穩(wěn)定劑中，配制成濃度為50pmol/mL的第2雜化溶液。使用同時(shí)含有與上述核酸探針-1的一部分相同的堿基序列以及上述目標(biāo)低聚DNA互補(bǔ)的區(qū)域的核酸探針(輔助探針-1)(序列號(hào)6)作為輔助探針。輔助探針-1的堿基序列(5‘-Y1'-X1-PolyT-Y1'-X1-T'-3')5，-TCCGAAGCCTGTCTTTTTTTCCGAAGCCTGTCTATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3，(序列號(hào)6)將上述輔助探針溶解于溶液IOOmM-丁二酸鋰、600mM-氯化鈉、2mM_EDTA、1%-LDS]中，配制成濃度為25pmol/mL的第1雜化溶液。將50μL的0或者lOfmol/mL的目標(biāo)低聚DNA(序列號(hào)4)和50μL第1雜化溶液分別注入上述調(diào)制好的條井型96井微量滴度酶標(biāo)板中，用密封板密封封緊，設(shè)定標(biāo)板溫度上部為20°C，下部為55°C，在此條件下反應(yīng)45分鐘。反應(yīng)后，用洗凈液50mM-Tris、0.3M-NaCl、0.01%-TritonX-100、ρΗ7·0洗凈。洗凈后，將100μL第2雜化溶液注入充分洗凈的96井微量滴度酶標(biāo)板中，用密封板密封封緊。設(shè)定標(biāo)板溫度上部為20°C，下部為55°C，在此條件下反應(yīng)30分鐘后，用洗凈液洗凈。將標(biāo)板的井洗凈后，加入發(fā)光化學(xué)試劑-I，II(GenProbe公司制造)測(cè)定液_1各50μL，使用照度計(jì)(CentroLB960，Berthold制造)測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度(RLU)。發(fā)光強(qiáng)度(RLU)測(cè)定結(jié)果如表1所示。(實(shí)施例5)將條件作如下更改，方法參照實(shí)施例4進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表1所示。使用吖啶鐺酯(AE)對(duì)實(shí)施例3中的核酸探針_3(序列號(hào)3)的5’末端進(jìn)行標(biāo)記，將其用作形成探針聚合物的核酸探針。使用同時(shí)含有與上述核酸探針_3的一部分相同的堿基序列以及上述目標(biāo)低聚DNA互補(bǔ)的區(qū)域的核酸探針(輔助探針_2)(序列號(hào)7)作為輔助探針。輔助探針-2的堿基序列(5‘-Y3'-X3-X3'-Y3'-X3-X3'-T'-3')5，-CCGAGCCTGCGCAGGCCGAGCCTGCGCAGGATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3，(序列號(hào)7)(比較例1)通過(guò)使用2種核酸探針形成的探針聚合物檢測(cè)目標(biāo)基因。將條件作如下更改，方法參照實(shí)施例4進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表1所示。使用吖啶鐺酯(AE)對(duì)下述2種核酸探針(第1以及第2探針；序列號(hào)8和9)的5’末端進(jìn)行標(biāo)記，將其用作形成探針聚合物的核酸探針。分別將該AE標(biāo)記過(guò)的2種核酸探針溶解于溶液IOOmM-丁二酸鋰、600mM-氯化鋰、2mM_EDTA、5%-LDS、穩(wěn)定劑中，配制成濃度為25pmol/mL的第2雜化溶液。第1探針的堿基序列(5‘-X4-Y4-Z4-3')5，-GATGTCTCGGGATGGCTTCGGAGTTACGCTGGCGGTATCAAC-3，(序列號(hào)8)第2探針的堿基序列(5'-X4'-Y4'-Z4'-3')5，-CATCCCGAGACATCCGTAACTCCGAAGCGTTGATACCGCCAG-3，(序列號(hào)9)使用同時(shí)含有與上述第1探針的一部分相同的堿基序列以及上述目標(biāo)低聚DNA互補(bǔ)的區(qū)域的核酸探針(輔助探針_3)(序列號(hào)10)作為輔助探針。輔助探針-3的堿基序列(5‘-X4-Y4-X4-T'-3')5’-GATGTCTCGGGATGGCTTCGGAGTTACGGATGTCTCGGGATGATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3，(序列號(hào)10)[表1]<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>目標(biāo)低聚DNA濃度(fmol/mL)實(shí)施例4實(shí)施例5比較例110846323843082496如表1所示，使用1種核酸探針與使用2種核酸探針一樣，同樣能夠檢測(cè)出目標(biāo)。權(quán)利要求一種核酸探針，其特征是含有3個(gè)以上的核酸區(qū)域，同時(shí)該核酸探針的各個(gè)核酸區(qū)域含有第1區(qū)域以及與該第1區(qū)域鄰接且互補(bǔ)的第2區(qū)域。2.一種探針聚合物的形成方法，其特征是使權(quán)利要求1中所述的核酸探針發(fā)生反應(yīng)，形成該核酸探針的聚合物。3.一種探針聚合物，其特征是由權(quán)利要求2中所述的方法形成。4.一種標(biāo)的分析物的檢測(cè)方法，其特征是根據(jù)權(quán)利要求2中所述的方法形成探針聚合物，通過(guò)檢測(cè)該探針聚合物來(lái)檢測(cè)標(biāo)的分析物。5.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征是使用能與所述標(biāo)的分析物進(jìn)行特異結(jié)合并且具有與所述核酸探針的一部分或者全部相同的堿基序列的輔助探針，形成含有所述標(biāo)的分析物、所述輔助探針和所述探針聚合物的復(fù)合體，通過(guò)分析該復(fù)合體檢測(cè)所述標(biāo)的分析物。6.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征是所述標(biāo)的分析物為核酸，所述核酸探針含有與所述標(biāo)的核酸的一部分互補(bǔ)的序列。7.如權(quán)利要求4或者5所述的檢測(cè)方法，其特征是所述標(biāo)的分析物是選自核酸、抗原、抗體、受體、半抗原、酶、蛋白質(zhì)、肽、聚合物以及糖類所構(gòu)成的群中的至少一種。全文摘要本發(fā)明提供能夠簡(jiǎn)便且有效地形成核酸探針聚合物的核酸探針聚合物形成方法，由該方法形成的探針聚合物，使用該方法的新核酸探針以及高靈敏度且簡(jiǎn)便地檢測(cè)標(biāo)的分析物的標(biāo)的分析物檢測(cè)方法。所述核酸探針含有3個(gè)以上的核酸區(qū)域，同時(shí)該核酸探針的各個(gè)核酸區(qū)域含有第1區(qū)域以及與該第1區(qū)域互補(bǔ)且鄰接的第2區(qū)域。通過(guò)使該核酸探針?lè)磻?yīng)，形成該核酸探針的聚合物。文檔編號(hào)G01N33/53GK101835906SQ20088011334公開日2010年9月15日申請(qǐng)日期2008年10月17日優(yōu)先權(quán)日2007年10月24日發(fā)明者波木井千雅子,薄井貢申請(qǐng)人:衛(wèi)材R&D管理有限公司