專利名稱：生物傳感器的制作方法
生物傳感器本發(fā)明涉及電極組件，所述電極組件具有結(jié)合了模擬生物膜的磷脂層的電極，涉及結(jié)合了這種組件的電化學(xué)生物傳感器，并且涉及所述生物傳感器的用途。該傳感器可以 用于例如電化學(xué)分析樣品以確定具有生物膜活性的物種(例如毒素)的存在(或其它)，或 用于研究物種(例如潛在藥物)是否具有生物膜活性。電極上的表面層作為用于電化學(xué)詢問(electrochemical interrogation)的膜 模型1已被研究了一些時間。一種方法利用了如下事實，即長鏈烷烴硫醇可以使用硫醇鍵 結(jié)合到金屬表面如金或銀上以形成自組裝層(SAM)2。該體系被用作生物傳感器，例如通過 查看在膜表面上的分析物特定結(jié)合反應(yīng)3或通過研究與溶液中的感應(yīng)電流物種(faradaic species)的偶聯(lián)酶反應(yīng)4。此途徑用于傳感應(yīng)用的優(yōu)點在于體系的穩(wěn)定性。缺點在于結(jié)合 層不是流體并且不完全類似細胞膜。因為此缺點，該體系精心設(shè)計通過在束縛層上非共價 地沉積磷脂層而制備不對稱的雙層5。然而，所得到的模型膜體系的復(fù)雜性導(dǎo)致遠離了對于 耐用的分析器件所需要的簡單性。用于研究電極上的似表面膜的層的備選策略是表面活性 劑/磷脂膜在電極表面上的非共價沉積6_19。此途徑的優(yōu)點在于層是可移動的，發(fā)生作為施 加電勢的函數(shù)的可逆相轉(zhuǎn)變并且在極值電勢(> IV)下脫附1(1’17’18。這些方法成為在雙層 和生物膜的電穿孔19中涉及的機理的基礎(chǔ)。在此方面相關(guān)的是GB-A-2 193 326 (自然環(huán)境研究學(xué)會(NaturalEnvironment Research Council))，其公開了一種基于懸汞滴電極(HDME)的使用的生物傳感器，其中為 了用電極進行測量的目的，每一個連續(xù)的汞滴形成有磷脂層。更具體地，HMDE (其在還包含 輔助電極和參比電極的電化學(xué)池中起到工作電極的作用)具有毛細管尖端(在這里可以形 成連續(xù)的汞滴)，它可相反地移入電解質(zhì)液體中和從電解質(zhì)液體中移出，所述電解質(zhì)液體在 其表面上具有磷脂(例如，二油酰卵磷脂或蛋黃卵磷脂(egg lecithin))的膜。要通過生 物傳感器研究的物種包含在電解質(zhì)液體中。在一個操作循環(huán)中，當(dāng)尖端在液體中并且在脂 質(zhì)膜下方時，在尖端處形成汞滴。然后尖端向上通過膜取出，然后向下回到液體中。以此方 式，在汞滴的表面上形成脂質(zhì)膜，其具有與一半的生物膜非常類似的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。然后可以 通過快速循環(huán)伏安法使用處于快速變化速率(ramp rate)(例如40V s—1)的鋸齒波形，通 過監(jiān)測浸入電解質(zhì)液體中的汞電極上的磷脂層進行研究溶液中物種的測量。在低的電壓， 所得到的電流與電極表面的電容成比例，在高的電壓，電容顯示尖峰，表示對應(yīng)于其流動性 的磷脂層的相變，并且(考慮到電解質(zhì)液體不含有任何生物膜活性組分)非常體現(xiàn)純磷脂 的特征。對于二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)在伴隨的圖6a(參見以下)中顯示這些峰。然而， 具有生物膜活性的物種的存在改變流動性并且影響相變，因而影響峰的形式。因而生物傳 感器可以用于檢測樣品中生物膜活性組分的存在。檢測極限取決于樣品中特定化合物的本 性，但是對于一些聚芳族化合物為在水中Ippb左右。非共價地沉積在液態(tài)汞上的磷脂單層的體系由于流體磷脂與液態(tài)汞的相容性因 而代表獨特且生物相關(guān)的情況。由此性質(zhì)顯現(xiàn)三種特征(i)代表水的進入和隨后取向變化的相轉(zhuǎn)變是尖銳的并且由循環(huán)伏安法和交流伏 安法曲線中的不同電容峰表現(xiàn)9。
(ii)汞上的磷脂層對于與以選擇性方式改變層的結(jié)構(gòu)和流動性或組織的生物膜 活性物種的相互作用敏感。相互作用影響相轉(zhuǎn)變的本性和層的阻抗性質(zhì)14。這些相互作用 不同于通常用于膜基生物傳感器中的那些，它們依賴于分析物物種和連接到膜或單層/雙 層上的部分之間的結(jié)合反應(yīng)16。最近我們顯示了磷脂-Hg體系還可以用于篩選溶液中的肽，并且其選擇性地響應(yīng) 短肽的官能性14。最初研究了層與短桿菌肽衍生物之間的相互作用"’12，隨后的研究著眼于 通過抗微生物肽改變單層體系21’22，最后研究了短鏈十一殘基β “折疊自組裝肽的結(jié)構(gòu)和 單層活性之間的關(guān)系14。就一切情況而論，相互作用非常接近地反映肽的生物膜活性。除了以上討論的顯著優(yōu)點，磷脂/懸Hg滴電極(HMDE)體系具有許多顯著缺點。特 別是HMDE易碎因而HMDE體系最適于用于實驗室中，從而限制了“在現(xiàn)場(in the field)” 的應(yīng)用。另外，HMDE需要使用較大量的液態(tài)Hg，應(yīng)當(dāng)考慮作為結(jié)果的毒性因素。此外，HMDE 僅能困難地成像24。因而本發(fā)明的目的是排除或減輕上述缺點。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種電極組件，所述電極組件包括至少一個工作電 極，所述工作電極包括導(dǎo)電載體基底，所述導(dǎo)電載體基底的表面包覆有固定在所述基底的 表面上的汞，其中遠離所述金屬(metal)的汞的表面包覆有磷脂層。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種生物傳感器，其包括(i)如關(guān)于本發(fā)明的第一方面所定義的電極組件，(ii)至少一個用于所述工作電極的對電極，(iii)參比電極，(iv)用于向所述至少一個工作電極施加周期變化電壓的裝置，和(ν)用于確定相對于所述對電極的磷脂的微分電容(differentialcapacitance) 變化的裝置。因此，在本發(fā)明的第一方面的電極組件中，工作電極包括固定在導(dǎo)電基底上的 金屬(液態(tài))汞(其上設(shè)置磷脂層)。包括沉積在導(dǎo)電基底上的金屬汞的電極是本領(lǐng)域 已知的，并且通常稱為“薄膜汞電極”而有時稱為“汞齊電極”。因此，例如，銥上汞電極 (mercury-on-iridium electrodes)是己知的并且公開于例如US-A—5 378 343 (Kounaves) 中。此現(xiàn)有說明公開了一種電極組件形式，其包括安置在基底上的超微電極的陣列，每一個 超微電極包括銥上汞。在US-A-5 378 343中公開的電極是為了用于通過陽極溶出伏安法 的手段檢測水中的各種重金屬而提出的，其中，最初，向汞施加負電勢，使得溶液中的金屬 離子電化學(xué)還原并且集中到汞中，隨后，在正向上緩慢掃描施加的電勢，這產(chǎn)生在每一種金 屬的氧化電勢處與其濃度成比例的峰值電流。然而，在US-A-5 378 343中沒有為了研究具 有生物膜活性的物種的目的用磷脂包覆汞的公開內(nèi)容。根據(jù)本發(fā)明的第一方面的電極組件具有許多優(yōu)點。具體地，電極組件堅固(與懸 汞滴電極的略微易碎的本性相反)，因而允許結(jié)合了這種電極組件的生物傳感器具有許多 在實驗室外的用途。固定的磷脂層可以產(chǎn)生比懸滴汞電極體系更尖銳的峰，峰越尖銳越有 利于分析目的。另外，與懸滴汞電極相比，電極所需的汞的量可以顯著減少，從而顯著降低 毒性。此外，存在關(guān)于取決于邊緣與表面積的比率的磷脂層的穩(wěn)定性的優(yōu)點(與懸汞滴電 極相比)。在根據(jù)本發(fā)明的電極組件的情況下，工作電極的邊緣與表面積的比率可以遠大于在汞滴的情況下，從而表面上磷脂層的穩(wěn)定性更高。在這方面，本發(fā)明人顯示(參見下面的實施例6)，可以通過循環(huán)伏安法對根據(jù)本發(fā)明的電極組件(即具有沉積在汞覆層上的磷 脂)進行反復(fù)詢問并且在很長時間內(nèi)產(chǎn)生可重現(xiàn)的結(jié)果。此外，可以將磷脂層從汞覆層清 除，并且包覆新鮮的層。在一系列測試中(還參見下面的實施例6)，本發(fā)明人證實了(對于 特定的包括具有汞覆層的傳導(dǎo)基底的復(fù)合電極)依次沉積的磷脂層提供在通過循環(huán)伏安 法詢問層所得到的結(jié)果方面的高度再現(xiàn)性。方便地，從汞表面清除磷脂可以通過在陰極方向上掃描工作電極(例如在(-0. 2V 至-2. 625V)的范圍內(nèi)097VS-1)進行，其中電極浸入電解液中以便使任何污染有機物質(zhì)脫附 到本體溶液中。令人驚訝地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)類似的掃描條件當(dāng)施加比用于清潔短得多的時 間時，可以用于在汞膜上沉積磷脂層。為了此沉積的目的，電極將被浸入到結(jié)合了要沉積的 磷脂的電解液中?？梢砸苑稚Ⅲw的形式將磷脂加入水性電解液中，所述分散體通過將磷脂 在水性介質(zhì)中攪動(例如使用超聲)制備。在沉積程序的過程中，可以通過循環(huán)伏安法監(jiān)測 汞電極，并且層的沉積可以通過循環(huán)伏安圖中磷脂的徑跡(trace)特征的顯現(xiàn)來檢測。在 此徑跡顯現(xiàn)的情況下，沉積程序完成。根據(jù)本發(fā)明的電極組件提供與由現(xiàn)有技術(shù)的懸汞滴電極得到的結(jié)果非常類似的 結(jié)果。因此，HMDE廣泛記錄的數(shù)據(jù)中的許多可以應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的電極組件。然而，與 HMDE相反，復(fù)合電極(即電極包括導(dǎo)電基底和汞覆層)的汞表面可以在下面步驟(i)至 (iii)的重復(fù)循環(huán)中再次使用(i)沉積新鮮的磷脂層；(ii)對樣品進行測量；和(iii)清潔電極以移除“用過的”磷脂。因此，不需要為每一次測量再生汞覆層，對照HMDE，其為每一次連續(xù)測量原位產(chǎn)生汞滴。值得注意地，本發(fā)明人證實了汞層(即使其處于固定在表面上的液體的形式)具 有足夠的對在其上沉積的導(dǎo)電基底的附著力，從而允許將電極組件用于本文中更全面描述 的流動池中。與上述特征組合，這樣的流動池可以在包括下列各項的重復(fù)的一系列步驟中 運行(i)將磷脂沉積到汞覆層上(其中電解液流過所述池)；(ii)對通過所述池的樣品進行測量；和(iii)將磷脂層從汞覆層清除。應(yīng)當(dāng)理解，這種流動池的運行可以容易地自動化，并且提供非常方便的測量技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明的電極組件方便地設(shè)置在也結(jié)合了工作電極和參比電極的“芯片 (chip) ”組件上。這樣的芯片組件突出地適用于上述流動池中。因而本發(fā)明的實施方案能 夠提供功能上適用于在線測量目的的“芯片上實驗室(lab-on-a-chip) ”。用于在本發(fā)明中使用的導(dǎo)電基底(即在其上沉積汞的基底)優(yōu)選具有小于1歐姆 米、更優(yōu)選小于1X 10_2歐姆米并且理想地小于1X 10_3歐姆米的電阻率。載體基底可以為選自由銥、鉬、鈀和鉭組成的組的金屬，它們被選作“載體”的原 因在于它們的難熔惰性性質(zhì)和它們在汞中的低溶解度，還因為汞可以沉積在這樣的金屬上 (例如通過電沉積)以提供均勻的膜。平滑的汞表面允許無缺陷的磷脂層的形成。可以用于本發(fā)明中的其它導(dǎo)電載體基底為碳，例如以石墨或玻璃化炭黑的形式。銥是用于根據(jù)本發(fā)明使用的合適載體金屬，原因在于其在汞中的低溶解度，還因 為金屬的功函與汞的功函之間的差別較高，從而確保汞在金屬上的最大潤濕性。例如(并且不希望受理論所限)本發(fā)明人相信，鉬具有特別合適的對于汞的溶解 度，從而允許“汞齊樣”接合點的制備，其較牢固地將汞保持在鉬上，同時為汞提供良好的表 面以允許磷脂沉積，并且提供良好的膜活性。另外，在“芯片”(例如基于硅晶片)上的根據(jù) 本發(fā)明的電極組件的構(gòu)造中，鉬作為導(dǎo)電載體基底的使用允許將參比電極容易地結(jié)合到同 一芯片上。本發(fā)明的第二方面的生物傳感器通過監(jiān)測脂質(zhì)層特別是其由于具有生物膜活性 的物種在研究樣品中的存在的改變而起作用。以與在GB-B 2 193326中公開的方式類似 的方式，測量通過循環(huán)伏安法進行，以確定作為相對于參比電極的電壓的函數(shù)的磷脂的微 分電容的變化。最優(yōu)選地，測量通過快速循環(huán)伏安法，優(yōu)選使用變化速率> lVs—1(例如 40-100VS—1)的鋸齒波形。在快速循環(huán)伏安法中使用的電壓偏移可以為相對于Ag/AgCl 3. 5M KCl的-0.4V至-1.2V。如下列等式所示，輸出電流(i)與微分電容(Cd)成比例Cd = i/(vXA)，其中A為電極面積而ν為變化速率。用于RCV的試驗設(shè)置包括使用向電勢恒定器輸入的函數(shù)發(fā)生器施加鋸齒波形，所 述電勢恒定器向工作電極施加波形。所得到的電流響應(yīng)經(jīng)由采集板記錄并且相對于施加的 波形繪制。DC循環(huán)伏安法提供在對于磷脂單層的結(jié)構(gòu)和環(huán)境特定的限定的電勢窗口中對層 的電容的快速估計。備選地，測量可以通過交流伏安法進行，其使用例如約5mV s—1的電壓變化，頻率f 約75赫茲的疊加正弦電壓，和約0.005V的振幅ΔΕ。將輸出交流電流分成同相和異相分 量。如下列等式所表達，異相電流(i")與微分電容(Cd)成比例Cd = i " /(2 π XfX Δ EXA)用于交流循環(huán)伏安法的試驗設(shè)置包括向上述電壓變化增加正弦波形并且輸入到 向工作電極施加所得到的波形的電勢恒定器。交流電流響應(yīng)傳送到鎖定放大器，在所述 鎖定放大器，將與施加的電流的交流波形同相和異相的分量分離并且在數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)上記 錄。將異相電流相對于變化電壓繪制。本發(fā)明的第一方面的電極組件可以包含單個工作電極，但是更優(yōu)選包含多個工作 電極。對于工作電極或每一個工作電極，應(yīng)當(dāng)沒有暴露的自由的導(dǎo)電載體基底表面。這確 保通過由汞層提供的大的氫過電勢，防止與在循環(huán)伏安法測量過程中在工作電極與水性介 質(zhì)接觸的情況下經(jīng)由水還原產(chǎn)生氫氣相關(guān)的不穩(wěn)定性問題。工作電極可以例如為圓形和/或具有在任何方向上為2μπι至Imm的最大表面尺 寸，但不能排除在此范圍之外的尺寸。下面描述的實施例采用直徑為約960μπι的圓形電 極。備選地，工作電極可以為微電極并且優(yōu)選定尺寸為使得汞具有在任何方向上為2 μ m至 10 μ m的最大表面尺寸。工作電極或每一個工作電極可以例如為直徑2 μ m至10 μ m的圓 形。這樣的尺寸起到最大化邊緣比面積(edge-to area)的作用，從而提高磷脂層的穩(wěn)定性。優(yōu)選地，電極組件包括選自由鉬、鈀、鉭和銥組成的組的導(dǎo)電載體基底的層，所述 層夾在第一和第二絕緣基底層(優(yōu)選二氧化硅)之間，所述絕緣基底層中的一個(“第一”基底層)被至少一個貫穿孔穿透，其實際上限定所述載體金屬為其提供底表面的井(well)， 該井結(jié)合了汞覆層(對于所述載體金屬)，在所述汞覆層上設(shè)置磷脂層，從而形成所述工作 電極。在微電極的情況下，井或每一個井可以例如為圓形，并且具有在2 μ m至10 μ m的范圍 內(nèi)的選定直徑，并且(考慮到汞層為半球形)可以具有從而對應(yīng)于壁厚的約Iym的深度。 汞層及其磷脂覆層應(yīng)當(dāng)占據(jù)井的整個橫截面(因而沒有載體基底暴露)。在井的 底表面處載體基底的此完全覆蓋抑制在伏安法測量過程中通過載體基底的水還原。還理 想的是，汞層及其磷脂覆層的構(gòu)造使得磷脂覆層具有與第一絕緣基底層的表面齊平的平表 面。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選微電極陣列包括多個在第一絕緣體層中形成的所述井，在每一 個所述井的底部的載體基底包覆有汞，所述汞又設(shè)置有脂質(zhì)層。這樣的微電極陣列因而包 括設(shè)置在絕緣基底之間的載體金屬層，所述載體金屬層具有為各個井提供各自的底表面的 載體基底部分。方便地，電極組件可以結(jié)合被夾在第二絕緣基底和載體金屬層之間的傳導(dǎo)層(例 如金)，所述傳導(dǎo)層與所述載體金屬層處于電傳導(dǎo)關(guān)系，從而改善器件的傳導(dǎo)性。根據(jù)本發(fā)明的微電極陣列可以結(jié)合除“載體金屬上汞(mercury-on-carrier metal)”電極以外的電極。因此，例如，陣列可以結(jié)合設(shè)置在第一絕緣基底的外表面上的參 比電極(例如Ag/AgCl) /偽-參比(例如Pt)和/或?qū)﹄姌O(例如Pt)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的微電極陣列包括⑴第一和第二絕緣層，(ii)選自由鉬、鈀、鉭和銥組成的組的載體金屬的層，其設(shè)置在所述絕緣層之間，(iii)多個井，所述井形成在第一層中，使得載體金屬層為井提供各自的底表面， 所述不連續(xù)部分各自形成工作電極的一部分，所述工作電極包括所述不連續(xù)部分、其汞覆 層和汞表面上的磷脂層，(iv)任選地，傳導(dǎo)層，其設(shè)置在所述載體金屬層與第二基底之間并且與其處于電 傳導(dǎo)關(guān)系，(ν)對電極，其設(shè)置在第一絕緣層上，和(vi)參比電極，其設(shè)置在第一絕緣層上。第一絕緣層可以為例如二氧化硅或氮化硅。第二絕緣可以為二氧化硅并且可以形成在硅晶片上。在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選微電極陣列中，載體金屬為鉬，其除了提供汞在其上沉積的 表面以外，還起到提供將本發(fā)明的電極與設(shè)置在陣列上的電接觸裝置連接的傳導(dǎo)徑跡的作 用。在此實施方案中，可以省略分開的傳導(dǎo)層(iv)。優(yōu)選地，井為圓形，例如直徑為2-ΙΟμπι，但可以使用在此范圍以外的直徑，參比電 極為Ag/AgCl和/或?qū)﹄姌O為鉬。由以上定義的(i)-(vi)構(gòu)成的微電極陣列能夠提供適用于在線使用的所謂的 “芯片上實驗室”功能。根據(jù)本發(fā)明的電極組件可以用于靜態(tài)池或流動池中。這樣的流動池可以包括其中 工作電極被暴露的“測量池”(例如以室的形式)。流動池還包括與“測量池”連通的入口和 出口通道。在流動池的使用中，電解液和分析物經(jīng)由一個或多個入口通道供給到“測量池”，它們在那里在工作電極上流過，然后通過一個或多個出口通道流出。在“測量池”中可以有多于一種類型的工作電極(本發(fā)明的)，各種電極區(qū)別在于在汞表面上沉積的具體磷脂。流 動池的每一個電極可以連接(例如通過合適的機械或電子開關(guān)裝置)電勢恒定器，使得可 以個別地訪問(addressed)每一個工作電極。因此，可以對于各種不同磷脂得到個別的結(jié) 果。備選地，可以記錄來自各種電極組件(具有它們的不同磷脂)的組合信號。以這些方式， 可以確定同一分析物對多種不同磷脂的影響并且提供該分析物的“指紋(fingerprint) ”。作為汞表面上的層提供的磷脂可以是飽和的或可以具有一定程度的不飽 和。合適的磷脂的實例包括二肉豆蔻酰，磷脂酰膽堿(DMPC-飽和的)、二油酰磷脂酰 (phosphhtidyl)膽堿(D0PC-不飽和的)和蛋黃卵磷脂(蛋PC-飽和的/不飽和的)。這 樣的脂質(zhì)結(jié)合膽堿-基頭基，并且可以使用結(jié)合了此頭基的其它脂質(zhì)。然而，頭基可以為胺 基如在二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)中，或羥基如在1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸(乙 二醇)(鈉鹽)中，或含有化學(xué)官能團的組合如在1，2- 二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇 胺-N-(琥珀酰)(鈉鹽)中。這些官能團可以存在于‘天然’脂質(zhì)中或可以是合成的以給 予所需化學(xué)表面。作為均相單層存在或作為非均相單層的一部分存在的每一種脂質(zhì)給予該 層獨特的性質(zhì)，其可以通過詢問電勢窗口由層電容觀察。可以使用磷脂頭基的改性，并且它 在傳感器的操作中是重要的，因為這是直接為電解液提供的官能化表面。層性質(zhì)可以通過 改變碳鏈的長度和它們的飽和度或通過頭基的改性來調(diào)節(jié)。更具體地，具有兩個9-順式_十八碳烯酸鏈的磷脂在室溫是流體，并且能夠在汞 上形成不可滲透的單層。它們在通過快速循環(huán)伏安法詢問的電勢范圍內(nèi)顯示出尖銳的假電 容相變。通過比較，二肉豆蔻酰脂質(zhì)(結(jié)合了 C14飽和鏈)對于氧化具有比二油酰脂質(zhì)較不 敏感的優(yōu)點但是顯示出較不顯著的相轉(zhuǎn)變。如果需要，磷脂層可以與另外的組分締合以改變層的性質(zhì)。這些組分可以結(jié)合在 層中或共價地固定在層上，實例包括肽(以形成離子通道)、低聚核苷酸或補充靶分子的分 子。根據(jù)本發(fā)明的微電極陣列可以通過下列方法制備在沉積另外的絕緣層(上述第 一層)之前，將任選的傳導(dǎo)層(例如金)和載體金屬層依次沉積到絕緣基底(其最終提供 上述第二絕緣基底)上(例如均通過E-束蒸發(fā))以覆蓋載體金屬。第二絕緣層可以例如 為具有SiO2表面層的硅晶片。任選的傳導(dǎo)層(例如金)和載體金屬層的沉積可以例如為 E-束蒸發(fā)。如果需要，可以將鈦粘附層沉積在(i)第二基底和傳導(dǎo)層之間，(ii)傳導(dǎo)層和 載體金屬層之間，和(iii)載體金屬層上。第一絕緣層可以為例如SiO2或氮化硅并且通過 低溫等離子體增強化學(xué)氣相沉積(PECVD)沉積。隨后，第一絕緣層可以被蝕刻貫穿到達載 體金屬，使得形成上述井，并且為井的底表面提供銥層。如果需要，在將汞沉積在載體金屬上的制備程序的下一步驟之前，參比和/或?qū)?電極可以形成在第一層上。汞層可以通過電沉積形成。沉積的汞的量應(yīng)當(dāng)足以在導(dǎo)電載體基底上提供汞的連 續(xù)膜。增加汞層的厚度將提高該層的穩(wěn)定性并且允許重復(fù)汞層以允許重復(fù)的磷脂層沉積、 樣品測量和磷脂層移除的循環(huán)，因而一個電極可以在不破壞汞的情況下使用多次。此外，汞 層的厚度對于電極組件在流動池中的使用是一個考慮因素，在流動池中汞層需要承受與流 過池的液體相關(guān)的力。電沉積工藝所需的電荷的量取決于所需的汞層的厚度，而這進一步取決于諸如導(dǎo)電基底(汞將電沉積到其上)的表面積和汞沉積電解液中的汞離子濃度的因 素。通過實施例，實施例4在特定的沉積電解液中汞濃度下使用1庫侖的電荷將令人滿意 的汞層沉積到直徑960 μ m的圓形鉬基底上。下面的實施例7 (示出流動池的使用)采用通 過使用2庫侖的電荷將汞沉積到直徑960 μ nm的圓形鉬基底上所形成的電極。對于相同的 溶液濃度，較小直徑的鉬基底需要較少量的電荷。對于較大直徑的基底情況是相反的。從含有Hg2+離子(例如由Hg(NO3)2提供)的溶液的汞的控制電沉積可以在電化學(xué) 池中進行。汞沉積電解液可以含有防止Hg物種氧化的HC104。然而，脂質(zhì)詢問將不在此酸 性溶液中進行而是在更溫和的電解液如0. IMKCl中進行。備選地，汞的電沉積可以通過將 一滴基本電解液(baseelectrolyte)(例如HC104+Hg(II))移取到第一絕緣體的表面上而 進行。電沉積可以通過下列方法促進向沉積溶液中的工作電極表面施加相對于3. 5M KCl Ag/AgCl的 0. 4V的電勢并且記錄與沉積的汞的質(zhì)量直接成比例的通過的電荷，沉積可以 通過 斷開電路而停止。這允許精確控制沉積的Hg的量。一旦汞層被沉積，就可以將組件轉(zhuǎn)移到中性電解液如0. IM KCl中，并且通過施加 < "2V的極值負電勢來電化學(xué)地清潔電極表面，這釋放氫氣來‘擦洗(scrub)，沒有有機物 的表面。隨后可以將磷脂沉積在汞上。這可以通過許多方法進行，例如(a)沉積可以如之前使用HMDE所完成的進行，即通過將磷脂從作為液體上的膜提 供的過量磷脂轉(zhuǎn)移到陣列上。通過溶液氣體界面的垂直和水平插入均可以進行。此程序?qū)?致作為汞表面上單層的磷脂的形成。(b)控制沉積可以在郎繆爾布洛爾杰特(Langmuir Blodgett)槽中通過將陣列垂 直插入通過在溶液氣體界面處具有精確覆蓋率的磷脂單層而進行。通過用在氣體_溶液界 面處的磷脂覆蓋率校準磷脂層的性質(zhì)得到控制沉積的優(yōu)點。如(a)的情況，在汞表面上形 成磷脂的單層。(c)通過在將陣列浸入含有感興趣的磷脂的濃縮戊烷溶液中以后，允許溶液蒸發(fā)， 可以將磷脂層沉積到陣列表面上。然后可以通過將陣列淹沒在水性電解液如0. IM KCl中 并且快速從-0. 2至-1. 2V連續(xù)循環(huán)電勢使層均化。此方法通過經(jīng)過施加快速電勢變化促 進自組裝而提供磷脂單層的形成，所述自組裝導(dǎo)致表面上的磷脂連續(xù)自身重排成最低能量 構(gòu)造(即在接近汞的零電荷電勢(PZC)的相對于3. 5M KCl Ag/AgCl的-0. 4V的單層)。(d)可以將一滴磷脂在硅晶片上蒸發(fā)。當(dāng)不含溶劑時，將晶片轉(zhuǎn)移至電化學(xué)池中。 在此情況下，通過使用RCV的連續(xù)掃描在電極陣列上得到單層。這允許磷脂退火成單層。(e)可以允許囊泡或磷脂分散體在流動池內(nèi)流動的過程中吸附。如(d)的情況，通 過使用RCV在磷脂溶液在電極陣列上流過的同時連續(xù)掃描得到單層。使用上述沉積方法，可以使用RCV、ACV評價表面上的磷脂的構(gòu)造，并且與原子力 顯微鏡(AFM)研究一起評價阻抗。在RCV和ACV中，對應(yīng)于磷脂相轉(zhuǎn)變的兩種電容峰的特征 決定電極上的磷脂層的構(gòu)造和覆蓋率2°。可以檢查沉積的磷脂的伏安圖以檢測代表磷脂相 轉(zhuǎn)變的伏安峰(voltammometric peak)是否受電極尺寸的影響。實際上，不飽和的(例如 D0PC)、飽和的(例如DMPC)和飽和的/不飽和的(例如蛋黃卵磷脂(蛋PC))磷脂都可以 測試，以評價它們在空氣存在下的穩(wěn)定性。磷脂層可以在相對于3. 5M KCl Ag/AgCl的-2. 0 的極值電勢通過脫附從電極表面移除。用此方法常規(guī)地清潔汞表面。
本發(fā)明的生物傳感器可以用于例如確定(i)已知具有生物膜活性的物種在樣品 中的存在或其它情況或(ii)特定的物質(zhì)是否具有生物膜活性。測量可以通過伏安法進行 (例如快速循環(huán)伏安法或交流伏安法以常規(guī)方式進行，例如按照在GB-A-2 193 326中公開 的線路(參見例如其實施例1)。RCV用于傳感器表面的快速詢問，并且特別用于確定對相 互作用特別敏感的磷脂的兩種電容的相互作用的效果。通常，確定程序包括水性電解質(zhì)液體，電化學(xué)池中的電極組件將浸入在其中，如果 需要，可以向液體中加入電解質(zhì)(例如KCl)。然而，還預(yù)想為了測量的目的而無需將組件在 電化學(xué)池中定位，可以向電極組件施加一滴或多滴電解質(zhì)液體。在此情況下，必要的是使用 在空氣存在下穩(wěn)定的磷脂。飽和的二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)顯示為適于此并且還顯 示了可用于分析應(yīng)用的電勢誘導(dǎo)相轉(zhuǎn)變。也在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是對于存在于氣體或蒸氣 樣品中的具有生物膜活性的物種的氣體或蒸氣樣品的分析。在此情況下，必要的是將電解 質(zhì)液體設(shè)置在工作電極上。本發(fā)明在許多領(lǐng)域具有應(yīng)用。這些包括(a)對于可能為有毒試劑的生物膜活性化合物的存在的飲用水常規(guī)檢測；(b)對于潛在藥物產(chǎn)品的生物膜活性的潛在藥物產(chǎn)品檢測；(c)有毒氣體和爆炸性蒸氣的檢測，所述有毒氣體和爆炸性蒸氣(條件是它們與 單層表面相互作用)可以使用多變量分析途徑根據(jù)與各種化學(xué)官能性的單層的相互作用 的強度診斷；和(d)環(huán)境應(yīng)用，例如對于生物膜活性化合物的天然和海洋水的原位分析，所述生物 膜活性化合物例如(i)由藍細菌和溝鞭藻類的繁盛(blooms)產(chǎn)生的有毒生物膜活性肽，或 ( )污染物。應(yīng)當(dāng)理解，該體系可以用已知改變電極上的磷脂層的結(jié)構(gòu)的一系列化合物例如多 環(huán)芳族烴7、吩噻嗪藥物8和抗微生物肽23對傳感器應(yīng)用進行校準。在每一種情況下，磷脂 層的破壞/改變被良好地電化學(xué)表征。在微電極陣列的情況下，各個工作電極可以結(jié)合磷脂，所述磷脂在以特定但不同 的方式響應(yīng)于靶分析物的脂質(zhì)頭基的官能性方面變化。靶分析物的化學(xué)本性可以通過與陣 列單層表面提供的官能團的相互作用大小的多變量分析仔細分析(dissected)。具有兩個 9_順式-十八碳烯酸鏈的磷脂為18個碳原子長，是不飽和的，并且在室溫為流體，能夠在汞 上形成可半滲透的單層。它們在通過快速CV詢問的電勢區(qū)域內(nèi)顯示出尖銳的假電容相轉(zhuǎn) 變。還有興趣的是具有14個碳原子飽和鏈的二肉豆蔻酰脂質(zhì)，其具有對于氧化比二油酰脂 質(zhì)較不敏感的優(yōu)點，但是顯示出較不顯著的相轉(zhuǎn)變。傳感器可以采用這些具有變化的官能 頭基的脂質(zhì)的組合，因而每一個陣列具有單一的均相的磷脂群體，其提供分析物可以與其 相互作用的官能化的表面。起到對相互作用的轉(zhuǎn)換器(transducer)的作用的磷脂允許進 一步結(jié)合選擇性要素(elements)，其為基于肽的，如免疫球蛋白、低聚核苷酸或?qū)τ诮Y(jié)合在 層中或共價地固定到層上的靶分子的補充分子。通過實施例僅參照附圖進一步描述本發(fā)明，在附圖中

圖1是根據(jù)本發(fā)明的電極組件的一個實施方案的示意性橫截面(至放大許多的比 例)；圖2是根據(jù)本發(fā)明的電極組件的制備的中間結(jié)構(gòu)的透視圖3(a)_(i)示出在圖2顯示其中間結(jié)構(gòu)的類型的微電極陣列的制備中的步驟；圖4示出根據(jù)本發(fā)明的微電極陣列的另一個實施方案；圖5示意性示出結(jié)合了圖4的微電極陣列的測量系統(tǒng)的主要組件；圖6展示實施例1的結(jié)果，更具體地，與現(xiàn)有技術(shù)的懸滴汞電極 布置的結(jié)果相比的 根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器的試驗結(jié)果；圖7展示實施例2的結(jié)果，更具體地，根據(jù)本發(fā)明的微電極陣列的試驗結(jié)果；圖8是根據(jù)本發(fā)明的電極組件的另一個實施方案的示意性橫截面(至放大許多的 比例)；圖9是根據(jù)本發(fā)明的電極組件的另一個實施方案的示意性透視圖(至放大許多的 比例)；圖10(a)_(c)分別是根據(jù)本發(fā)明的流動池的一個實施方案的示意性截面視圖、端 視圖和俯視圖(至放大許多的比例)；圖11(a)和11(b)是對于具有汞覆層的包含鉬的復(fù)合電極得到的循環(huán)伏安法掃 描；圖13是對于懸汞滴電極的循環(huán)伏安法掃描；圖14示出各種磷脂的化學(xué)式；圖15(a)_(e)是結(jié)合了圖14中所示磷脂的根據(jù)本發(fā)明的電極組件的比電容曲 線.
一入 ， 圖16 (a) - (c)是顯示如實施例6中進行的根據(jù)本發(fā)明的電極組件的穩(wěn)定性的比電 容曲線；圖17和18示出使用根據(jù)實施例7的程序的流動池得到的結(jié)果；圖19 (a)和(b)是如按照實施例8的程序得到的對于懸汞滴電極和Pt/Hg電極的 比電容曲線；圖20 (a)和(b)顯示各自比較均結(jié)合了 DOPC的單層膜的HMDE電極和根據(jù)本發(fā)明 的電極的正向掃描和反向掃描；和圖21至28示出分別在實施例10至17中得到的結(jié)果，其中每一個比較HMDE和根 據(jù)本發(fā)明的電極組件對于特定分析物和/或其量的分析所得到的結(jié)果。首先參照圖1，根據(jù)本發(fā)明的電極組件1包括工作電極2，其包括具有汞的表面覆 層4的銥層3的組合，在所述汞的表面覆層4上沉積有磷脂單層5。如圖1中所示，汞層4位于形成在上部二氧化硅層6中的井結(jié)構(gòu)(銥層3為其提供 底表面)中，所述井為圓形，其選擇的直徑在2 μ m至10 μ m的范圍內(nèi)并且其深度為0. 5 μ m。 汞占據(jù)井結(jié)構(gòu)的整個橫截面，從而沒有暴露的自由的銥。示出的電極組件的另外的主要特征是具有二氧化硅表面的下部硅基底7和與銥 層3為電傳導(dǎo)關(guān)系的金傳導(dǎo)層8。在硅/ 二氧化硅層7與金層8之間設(shè)置鈦粘附層9，并且 分別設(shè)置類似的粘附層10和11(i)在銥層3和金層8之間，和(ii)在銥層3和上部絕緣層6之間。現(xiàn)在參照圖2，其為基于圖1中所示結(jié)構(gòu)微電極陣列但為了清晰目的省略鈦粘附 層9-11并且將井結(jié)構(gòu)(在圖2中表示為12)顯示為“空”(即沒有汞層4及其結(jié)合的磷脂單層5)的透視圖。然而，圖2也沒有示出設(shè)置在上部絕緣層6上的圓形和部分圓形的參比 電極13，每個電極13的半徑為50 μ m并且每個的中心為各個井12。
圖3示出用于制備圖2中示出的類型的電極組件的逐步程序。示出的程序以具有90nm 3丨02表面層的IOcmXlOcm硅晶片(例如可得自IDB Technologies)開始。這提供對于圖1和2中示出的結(jié)構(gòu)的層7。然后連續(xù)將下列各項沉積到SiO2表面層上(a)鈦粘附層9(30nm)，(b)金導(dǎo)電層 8 (IOOnm)，(c)鈦粘附層10 (30nm)，(d)銥層3 (30nm)和(e)鈦粘附層ll(30nm)。這些層都 可以通過E-束蒸發(fā)沉積。應(yīng)當(dāng)指出，在此階段，鈦粘附層11作為連續(xù)層沉積。所得到的結(jié) 構(gòu)顯示于圖3a中。在方法的下一步驟中，通過低溫等離子體增強化學(xué)氣相沉積(PECVD)將500nm SiO2層沉積在鈦粘附層11上以提供層6 (但在此階段沒有在其中形成的井12)。此階段的 產(chǎn)品顯示于圖3b中。對于方法的下一步驟，將正性抗蝕劑材料旋涂到SiO2層6上，然后在150°C烘烤并 且在氯苯中洗滌以提供由標記14(參見圖3c)示出的“硬化的”表面抗蝕劑層。將結(jié)合了用于銀環(huán)13的圖案的掩模15放置在抗蝕劑層14上，然后使用光/E-束 平版印刷術(shù)將抗蝕劑層14圖案化(圖3(d))?，F(xiàn)在移除掩模15，并且接著將抗蝕劑層14向下化學(xué)蝕刻至SiO2層6(圖3e)。在圖3(f)中示出的步驟中，將IOOnm銀層16蒸發(fā)到抗蝕劑層14的表面上，但是 更重要地，還在其中限定的圓圈和弧的圖案的通道中。隨后將抗蝕劑層14移除以留下如圖3(g)中所示的結(jié)構(gòu)，其中上表面具有圓形和 部分圓形的徑跡17。盡管沒有在圖中示出，程序通常可以沿對于圖3(c)_(f)描述的線路重復(fù)以在二 氧化硅層6上提供鉬對電極?，F(xiàn)在將能夠承受等離子蝕刻的另一抗蝕劑層18施加于二氧化硅層6 (并且覆蓋銀 徑跡17)并且等離子蝕刻以形成圓形孔19的圖案，其暴露銥層(圖3(h)。換言之，蝕刻貫 穿SiO2層6并且還貫穿鈦粘附層11。如果需要，可以在此階段在孔19的底部向暴露的銥表面沉積IOnm金潤濕層?？刮g劑層18的移除產(chǎn)生圖3 (i)中所示的結(jié)構(gòu)，其中形成了井12 (對應(yīng)于圖2中 的那些)。銀徑跡12可以在富氯化物溶液(chloride rich solution)中被陽極化，以制備 具有快速動力學(xué)和穩(wěn)定參比電勢的穩(wěn)定的Ag/Ag/Cl參比電極。汞層4(參照圖1描述)可以電沉積(如上所述)到在井的底部暴露的銥層3的 那些部分。隨后可以再次使用如上所述的技術(shù)沉積磷脂層。圖4示出根據(jù)本發(fā)明的微電極陣列的一個具體實施方案。示出的電極組件100包括以如以上參照圖3更全面描述的方法制備的10X10的 工作電極陣列101，并且因而包括在汞表面上具有磷脂層的汞包覆的銥，電極101與傳導(dǎo)徑 跡102連接。組件還包括與傳導(dǎo)徑跡103連接的Ag/Ag/Cl參比電極(沒有單獨提及但類似于 圖2中所示)。還設(shè)置與傳導(dǎo)徑跡105連接的鉬電極104。
傳導(dǎo)徑跡102、103和105與各個金接觸墊106、107和108連接，以各自連接到電
子控制/測量系統(tǒng)，例如在圖5中示意性顯示的。盡管特別參照銥作為載體金屬描述了傳感器的結(jié)構(gòu)，但是應(yīng)當(dāng)理解，相同的構(gòu)造 原理可以用于可以根據(jù)本發(fā)明使用的其它載體金屬(即，鈀、鉬和鉭)。參照圖8，其為在其上可以沉積磷脂層的復(fù)合Pt/Hg電極組件200的按放大許多的 比例的示意性橫截面視圖。電極組件200包括其上沉積碳化硅的層202 (例如厚度為500nm)的硅晶片201。 在氮化硅中形成至少一個井，在其底部上為鈦粘附層203 (例如30nm)，其上沉積IOOnm厚的 鉬層204。填充井的是設(shè)置在其上表面上的具有磷脂單層206的汞層205 (如圖8中所見)。 圖8中的標記207表示電解質(zhì)溶液，使用中的電極將浸入其中。盡管沒有在圖8中示出，鉬 層204與用于連接到電勢恒定器的導(dǎo)電徑跡相連。圖9示出根據(jù)在以上圖8中顯示的一般原理構(gòu)造并且參照以上圖8描述的電極組 件 300。電極組件300基本上是矩形并且朝向其一個末端形成兩個工作電極301和302，其 各自在氮化硅層303的井中。朝向電極組件301的相反末端是兩個接觸墊304和305。電 極301通過導(dǎo)電徑跡306連接到接觸墊304，而電極302通過導(dǎo)電徑跡307連接到接觸墊 305?，F(xiàn)在參照圖10(a)_(c)，其示出了為了證明原理的目的”而構(gòu)造的(參見下面的實 施例7)并且結(jié)合了參照圖9描述的類型的電極組件300的流動池400的一個實施方案的 示例性示意圖。10 (a)-(c)的示意圖分別示出流動池400的側(cè)視圖、端視圖和俯視圖，將看到該流 動池400(特別從圖10(a)和(b))包括均以下面更全面地描述的方式形成的底部部分401 和頂部部分402。底部部分401的上表面形成有凹部(rebate)使得電極組件300可以安置在其中， 從而其末端具有從流動池伸出的接觸墊304和305(特別參見圖10(b))。從圖10(b)應(yīng)當(dāng) 理解，在電極組件300的示出的位置中，電極301和302以及接觸墊304和305是最上的。上部部分402的下表面具有中心凹口其(上部部分401和下部部分402以圖10(a) 中示出的方式組裝到一起)形成電極301和302對著的“測量池” 403。(如圖(a)中看到 的，從測量池403通往左邊的是電解液進入通道404，而通往右邊的是電解液出口通道405。 與電解液入口通道404連通的是用于待分析樣品的注射口 406，而從電解液入口通道404 引導(dǎo)的是鉆孔407和408，一個用于結(jié)合Ag/AgCl參比電極，而另一個用于結(jié)合與電機組件 401分離的Pt輔助電極(均未顯示)。在流動池400的上部部分402的下表面中形成環(huán)形槽并且接收密封0_環(huán)409。盡管沒有在附圖中示出，設(shè)置螺絲孔用于容納螺絲以將上部部分和下部部分41 和42組裝到一起。電極301和302中的每一個可以具有沉積在其中的不同磷脂。為了測量目的，將工作電極301和302以及輔助和參比電極以圖5中示出的方式 連接到電勢恒定器。布置使得電極301和302可以個別地訪問。在流動池的使用中，電解液進入入口 404并且可以流動通過“測量井” 403然后通過出口通道405。可以將要分析的樣品注射到部分406中。然后可以進行樣品對電極301和302上的不同磷脂的影響的單獨測量。通過下列非限制性實施例示出本發(fā)明。實施例1為了建立原理的證明，將汞電沉積在被作為絕緣體的玻璃圍繞的Ir圓盤上。用去 離子水洗滌電極，然后通過將汞包覆的電極穿過在電解液-氣體界面處的二油酰磷脂酰膽 堿(DOPC)在戊烷中的溶液的膜而在汞層上沉積磷脂。隨后將戊烷揮發(fā)，以在汞表面上留下 DOPC。通過快速循環(huán)伏安法(RCV)在80V s—1監(jiān)測磷脂層。在懸滴汞電極(現(xiàn)有技術(shù))上使用DOPC進行比較試驗。結(jié)果顯示在圖6(a)中，其中較輕的徑跡顯示汞包覆銥電極的結(jié)果，而較深的徑跡 用于HMDE電極。從圖6(a)看到，兩種徑跡基本上相同并且均顯示了特征峰(1和2)。圖6(b)顯示在100V s—1掃描的汞包覆的銥電極的結(jié)果。再次可以清楚地看到兩 個特征峰(1和2)。結(jié)果顯示汞包覆的電極在快速掃描速率下顯示了較尖銳的伏安峰(voltammetric peaks) 0此發(fā)現(xiàn)表明相轉(zhuǎn)變的發(fā)生是電極尺寸的函數(shù)。較尖銳的伏安峰更適于分析目的并 且有利于微電極作為磷脂的載體(support)。本發(fā)明已經(jīng)顯示，磷脂從微電極表面的移除可 以通過施加相對于Ag/AgCl的-3. OV極端電勢來實現(xiàn)。在圖6(a)和(b)中在RCV中顯示 的伏安峰可以用于許多在非常低的(毫微至ymol dm-3)水平溶解的有機物種的選擇性分 析識別。這些結(jié)果顯示可以將穩(wěn)定的有序磷脂層沉積到Hg/Ir微電極上。實施例2將汞電沉積在緊密堆積的1800個鉬微電極的六邊形陣列上(在2mm直徑的Pt基 體上)，微電極尺寸為ΙΟμπι直徑并且中心至中心間距為20μπι。通過在陣列的表面上蒸發(fā) 磷脂的溶液將磷脂DOPC沉積在此微電極的陣列上。將陣列引入電解質(zhì)溶液，將陣列在該溶液中在相對于Ag/AgCl的-0. 2和_2. OV的 電勢之間伏安法循環(huán)。這將DOPC單層退火以形成穩(wěn)定的有組織的層，如由圖7的在30V S"1 下從-0.2V至-1.0V的循環(huán)伏安法圖所示。此圖顯示了特征相轉(zhuǎn)變。這些層顯示為穩(wěn)定歷 時至少1小時。實施例3使用下面描述的程序制備在圖9中示出的類型的電極組件，以制備其中在氮化硅 層303中的井的直徑在960 μ m的組件。用piranha溶液(硫酸與過氧化氫的2 1 (體積體積)混合物)洗滌IOOmm 厚的硅晶片基底并且對其進行熱氧化，以在晶片表面上生長致密氧化物的層。使用標準UV 照相平版印刷術(shù)技術(shù)在晶片上制備多個各自對應(yīng)于一個電池組件的相同的抗蝕劑圖案。各 個抗蝕劑圖案在對應(yīng)于工作電極301和302、接觸墊304和305以及導(dǎo)電徑跡306和307的 區(qū)域具有顯影的(developed)正性抗蝕劑(沒有抗蝕劑)。使用常規(guī)熱蒸發(fā)技術(shù)將30nm厚的鈦粘附層和然后IOOnm厚的鉬層施加于基底 (參見圖8中的層203和204)上。使用“金屬搬離(metal lift-off) ”的標準實施通過將光致抗蝕劑溶解于丙酮中顯露圖案。然后使用等離子體增強化學(xué)氣相沉積(PECVD)沉積約500nm厚的氮化硅的層(參 見圖8中的層202)。然后使用第二光掩模(蝕刻掩模)使用進一步UV照相平版印刷術(shù)將電極區(qū)域301 和302以及接觸墊304和305圖案化(在這些區(qū)域中選擇地顯影抗蝕劑)。然后使用氫氟 酸基濕蝕刻劑將下面的氮化硅向下蝕刻至鉬層的表面，使得后者在氮化硅中的井的底部處 暴露并且提供接觸墊304和305。
然后將剩余的抗蝕劑移除并且用piranha溶液洗滌器件。隨后通過使用晶片鋸切割晶片將各個電極組件與形成在晶片上的其它電極組件 分離。汞向鉬盤工作電極上的電沉積在標準的三電極池中進行，所述三電極池含有均由 Metrohm供給的雙接頭參比電極(3. 5mol dm_3KCl，Ag/AgCl內(nèi)填充，0. Imol dm_3高氯酸外 填充)和鉬棒輔助電極。通過顯微操縱器將工作電極引入池中并且經(jīng)由連接到鉬結(jié)合墊的 鱷魚嘴夾連接。使用通過AUT0LAB軟件控制的PGSTAT 12 (Ecochemie，Utrecht，荷蘭)電 勢恒定器設(shè)定在工作電極的表面處的電勢。在電沉積之前，將硅晶片基工作電極在比例為 約3 1的硫酸(Fisher Scientific)和30%過氧化氫(Fluka)的熱溶液中清洗，之后在 氮氣下干燥。電沉積在相對于3. 5mol dm_3KCL Ag/AgCl參比的-0. 4V進行并且通過計時庫 侖分析法監(jiān)測。沉積通過打開電路終止，并且一旦通過了 1庫侖的電荷就立即將電極從沉 積溶液移出。沉積在鉬上的液態(tài)汞處于“變平的半球”的形式。汞被充分固定在鉬上以允許在 不損失汞的條件下將電極組件“顛倒”轉(zhuǎn)動。實施例4此實施例示出根據(jù)實施例3的程序制備的電極組件的穩(wěn)定性。電極組件在三電極池中測試，所述三電極池控制在25°C的溫度并且容納了在pH 7. 4緩沖的0. Imol dnr3KCl磷酸鹽。在引入電極組件之前，通過將氬氣經(jīng)過攪拌的溶液鼓 泡而將溶液除氣。使用顯微操縱器將電極組件下降到池中，并且用與電極接觸墊中的一個 連接的鱷魚嘴夾連接到外部電勢恒定器。工作電極電勢相對于通過多孔玻璃料與池分離的 Ag/AgCl 3. 5mol dm_3KCl參比電極設(shè)定。鉬棒對電極完成電路。使用通過Scope 軟件控 制的與Powerlab 4/25信號發(fā)生器和ADC(AD Instruments，Oxfordshire，英國)界面連接 的ACM研究電勢恒定器(ACM instruments，Cumbria，英國)進行快速循環(huán)伏安法測量。電極組件在引入池中之前用Mili Q水的噴射流(jet)洗滌。然后使用在下一段 中描述的程序?qū)⑵潆娀瘜W(xué)清洗30秒。對于清潔程序，使用下列條件在陰極方向上掃描工作電極的電勢，從而將任何污 染有機物質(zhì)快速脫附到本體溶液中 范圍(-0. 2V 至-2. 625V) §97V · S-1然后記錄以下I/V曲線 范圍(-0. 2V 至-2V) §40V · S-1(記錄5次單一連續(xù)掃描+—旦徑跡可見地穩(wěn)定_在 2秒之后在重復(fù)循環(huán)之后 記錄掃描)
隨后連續(xù)運行上述清潔程序30分鐘。然后再次記錄以下I/V曲線 范圍(-0. 2V 至-2V) §40V · S-1(記錄5次單一連續(xù)掃描+—旦徑跡可見地穩(wěn)定_在 2秒之后在重復(fù)循環(huán)之后 記錄掃描)結(jié)果提供在圖11 (a)和11 (b)中，它們分別顯示在初始清潔30秒之后和在30分 鐘清潔之后得到的曲線。為了比較，圖12顯示對于鉬電極(更具體地，根據(jù)以上實施例3所制備的類型的 電極組件但沒有沉積汞)在與以上所述條件相同的條件下得到的Ι/ν曲線。圖13顯示使 用以上對于懸汞滴電極所述的條件得到的用表面積歸一化的I/V曲線。首先參照圖13，應(yīng)當(dāng)看到HMDE的I/V曲線顯示特征的“水駝峰(waterhump) ”(參 見圖13中示出的曲線的左手部分)。在圖12中示出的鉬的I/V曲線中沒有看到此“水駝 峰”。現(xiàn)在參照圖11(a)和11(b)，首先應(yīng)當(dāng)指出，曲線均顯示了由汞顯示的特征“水駝 峰”(參見圖13)。因此根據(jù)實施例3制備的電極組件顯示汞電極而非鉬電極的特征。另 夕卜，分別為30分鐘的清潔時期之前和之后的圖11(a)和11(b)的比較顯示曲線是相同的， 從而表明表面積沒有顯著損失并且表面特征保持相同。電極的表面積可以根據(jù)等式(1)從電容電流使用作為 40 μ F cm-2的在 _0. 3V 處的水駝峰測量的汞的比電容的值來精確計算[27])。
面積=(wk)⑴對于在以上試驗中使用的Pe/Hg復(fù)合電極，這得到 0. 744mm2的電極表面積的 值。使用光學(xué)顯微鏡測量的鉬盤電極(在汞沉積之前)的表面積為 0.724mm2。對于復(fù)合 電極(即在鉬上沉積的汞)的計算值略微高于平盤的計算值，從而為變平的半球提供合理 的結(jié)果，因為其處于完全平坦的膜與半球的界限之間。用此方式計算的表面積值用于產(chǎn)生 在隨后的實施例中用磷脂單層包覆的復(fù)合電極的比電容曲線。實施例5此實施例示出根據(jù)實施例3的程序制備的電極組件支撐磷脂單層的能力。下列5種磷脂被選擇并且僅在它們的頭基區(qū)域的化學(xué)官能性方面變化(a) 1，2- 二油酰-sn-甘油基_3_磷酸膽堿(DOPC)(b)l，2 二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)(c)l，2_ 二油酰-sn-甘油基-3-[磷酸-rac-(l-甘油)](鈉鹽)(DOPG)(d) 1，2- 二油酰-sn-甘油基_3_ [磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)(DOPS)(e) 1，2- 二油酰-sn-甘油基_3_磷酸(乙二醇)(鈉鹽)(DOPEG)磷脂(a)-(e)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式顯示在圖12中。分別制備重量濃度2mg -πιΓ1的溶解于1 4氯仿戊烷中的每一種脂質(zhì)的溶液， 從而得到在2. 5mmol - dm"3至3mmol - dm"3的范圍內(nèi)的摩爾濃度。如實施例4中所述安裝電 化學(xué)池，其容納在0. Olmol · dm_3的濃度緩沖至pH7. 4的0. Imol · dm_3KCl磷酸鹽，并且在引入工作電極之前用氬氣除氣30分鐘。通過注射器將12. 5μ 1的每一種脂質(zhì)溶液加入電解 液中，然后將工作電極降低通過溶液/氬氣界面。使用實施例4中描述的原位電化學(xué)清潔 方法將電極清潔30秒，之后將電極升起短暫地通過溶液界面并且將其再次淹沒以形成均 勻包覆的層。對于在開路包覆的電極在-0. 2V至-1. 2V的電勢范圍內(nèi)、在電勢保持在恒定-0. 2V 的情況下或在上述范圍內(nèi)重復(fù)循環(huán)的同時在40V s—1的重復(fù)掃描中沒有觀察到可辨別的差 異(數(shù)據(jù)未示出)。將在40V s—1記錄的循環(huán)伏安圖的陰極掃描轉(zhuǎn)化成磷脂(a)DOPC，(b)DOPE, (c) DOPG，(d)DOPS和(e)DOPEG的比電容曲線。結(jié)果分別標示在圖15 (a) - (e)中，其中粗線為 比電容曲線而細線用于電化學(xué)清潔的在實施例3中制備的類型的電極組件(即沒有沉積的 磷脂)。從圖15中提供的數(shù)據(jù)看到，磷脂在汞的零電荷電勢(p.z.c.)和層的脫附電勢之 間的電勢范圍內(nèi)起到可變電介質(zhì)的作用。磷脂向表面給予選擇性化學(xué)官能性并且極大地影 響表面電勢和電容曲線，從而產(chǎn)生與吸收層(absorbed layer)的復(fù)雜相轉(zhuǎn)變相關(guān)的獨特的 指紋峰。實施例6此實施例顯示磷脂單層的穩(wěn)定性。使用實施例5的程序，根據(jù)實施例4制備的電極組件的汞表面各自用磷脂D0PC、 DOPS 禾口 DOPG 包覆。對于DOPC包覆的電極，在-0. 2V至-1. 2V的電勢范圍內(nèi)在40V. s—1記錄循環(huán)伏安 圖。然后使用實施例4中描述的清潔技術(shù)將電極原位電化學(xué)清潔30秒并且重復(fù)該程序6 次。將伏安圖轉(zhuǎn)化成比電容曲線并且標示平均徑跡。結(jié)果顯示在圖16(a)中，其中窄的誤 差棒(error bars)(誤差棒=士 1SD)提供關(guān)于覆層之間的高水平測量再現(xiàn)性的良好指示。 因此，磷脂單層沉積顯示出試驗之間的高度類似性。對于DOPS包覆的電極，-0. 2V至-1. 2V的電勢范圍的初始掃描在40V. s—1記錄。對 于連續(xù)的30分鐘每隔1分鐘的時間間隔重復(fù)和記錄掃描。將循環(huán)伏安圖轉(zhuǎn)化成比電容曲 線，并且標示平均徑跡。結(jié)果顯示在圖16(b)中，其中窄的誤差棒(士 1SD)顯示出在試驗過 程中電容最小值和電流峰值保持穩(wěn)定，因而表明單層完整性類似地保持穩(wěn)定和可重現(xiàn)。為了測試在測量之間連續(xù)循環(huán)電勢的情況下的穩(wěn)定性和再現(xiàn)性，在-0. 2V 至-1. 2V的電勢范圍內(nèi)在40V. s—1連續(xù)循環(huán)DOPG包覆的電極，從而導(dǎo)致對于變化+40ms軟 件強制延遲，每秒詢問 15次，循環(huán)持續(xù)50ms。初始地以及在5，15和25分鐘之后記錄掃 描。將循環(huán)伏安圖轉(zhuǎn)化成比電容曲線并且重疊徑跡，以查看單層的電容的任何顯著變化。結(jié) 果顯示在圖16(c)中，從其可以看到徑跡幾乎完全重疊，從而表明單層完整性在測量的時 期中足夠穩(wěn)定。實施例7此實施例示出在圖10中示出的類型的原型流動池400的用途，構(gòu)造該流動池以建立為了將根據(jù)本發(fā)明的電極組件用于流動池中的“原理的證明”。該流動池具有5cm的總長 度，3cm的高度(上部部分和下部部分401的402各自的高度為1. 5cm)和2cm的寬度。注 射部分406以及進入和離開通道404和405直徑為4mm。鉆孔407和408具有2mm的直徑并且與離開通道405成45度角。根據(jù)實施例3的程序但是通過2C的電荷(而非1C)制備 電極組件300。電極組件300具有Icm的長度，5mm的寬度和0. 5mm的厚度。在鉆孔407中設(shè)置Ag/AgCl微電極而在鉆孔408中設(shè)置鉬對電極。電極組件上的接觸墊304和305各自連接到電勢恒定器并且可以通過 雙路開關(guān)獨 立地訪問。通過下列方法制備DOPC和DOPS的脂質(zhì)囊泡沉積分散體將25mg的粉末狀純磷脂 溶解于50 50氯仿/甲醇中，并且在玻璃圓底燒瓶中在25°C在輕微真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直至 干燥。然后將殘余物在12. 5ml的磷酸鹽緩沖鹽水(0. lmol. dm_3KCl，pH 7. 4)中再次懸浮以 制備Zmg.mr1分散體，然后將其尖端超聲化(tip sonicated) 20分鐘以制備囊泡。 通過下列方法沉積脂質(zhì)層將 100 μ L的2mg. mL^DOPC或DOPS囊泡分散體注射 到電極上游的注射部分406中，同時電解液(緩沖(IOmM)至pH 7. 4的0. Im KCl磷酸鹽) 組合物，流量？)以5ml/分鐘的速率進入入口通道404并且沿入口通道404通過，通過測 量池403并且通過通道405流出。據(jù)發(fā)現(xiàn)，可以使用如對于在實施例4中描述的清潔程序所采用的相同的條件但是 施加約2秒沉積DOPC層。當(dāng)完全覆蓋的層變薄得足以顯示出圖17中所示的尖銳的相轉(zhuǎn)變 峰時，通過打開電路停止電勢循環(huán)，圖17為用試驗流動池測量的包覆有DOPC的電極(粗 線)在36V S—1的快速循環(huán)伏安圖。為了比較的目的，圖17還結(jié)合了沒有脂質(zhì)的Pt/Hg電 極(細線)的對應(yīng)的徑跡。在與DOPC不同的電勢條件下沉積DOPS層，因為DOPS層在< -1. 4V的電勢迅速 鋪展。初始試驗表明DOPS可以在較低電勢范圍中的陰極頂點為-1.1V的掃描沉積。允許 DOPS層隨時間緩慢構(gòu)造并且連續(xù)添加以產(chǎn)生如圖18中看到的I/V曲線(粗線)，所述圖18 為在試驗流動池中測量的包覆有DOPS的電極在38V s—1的快速循環(huán)伏安圖(粗線)。為了 比較目的，圖18還結(jié)合了沒有脂質(zhì)的Pt/Hg電極在36V s—1的快速循環(huán)伏安圖的徑跡(細 線)。電極上的兩種脂質(zhì)層(D0PC和D0PS)證明為在電解液以 4. SmLmirT1流動的情 況下，在> 10分鐘的時期內(nèi)是穩(wěn)定的，并且分別可以在原位清潔電極并且重復(fù)所述程序之 后，以合理的再現(xiàn)程度沉積。原型流動池的一個特征是當(dāng)與在靜態(tài)池中使用的Ag/AgCl (3. 5mol. dm_3)參比電 極相比時測量為+260mV的微參比電極電勢的不穩(wěn)定性。因此所有從流動池中的數(shù)據(jù)引用 的電勢均相對于漂移的Ag/AgCl參比。精確的漂移可以通過比較在Hg表面上在確定電勢 處發(fā)生的DOPC的第一或第二相轉(zhuǎn)變峰的位置來評價。從圖17和18可以觀察到清楚的向徑跡的傾斜以及電流峰的變寬。這可以歸因于 三個影響因素。首先，發(fā)現(xiàn)池由于0-環(huán)的不完全密封而不是不漏水的。(任何小的電解液 泄露都可能在其發(fā)生與鱷魚嘴夾和接觸墊的接觸時產(chǎn)生干擾的法拉第電流。)第二，電解液 含有比更有效地除氣的靜態(tài)池更大量的溶解氧。第三，參比電極距工作電極的距離略微更 大，并且在流動池中存在較高的溶液電阻，原因在于可能變得較容易被磷脂流阻塞的較小 的參比電極玻璃料(fritt)，較大的溶液電阻通過電阻電壓降(Ohmic drop)的現(xiàn)象影響施 加于工作電極的電勢。不論原型流動池的“不足”，此實施例清楚地示出許多有效點。首先，汞層在電解液流中是穩(wěn)定的。第二，磷脂可以沉積到汞層上并且(當(dāng)通過循環(huán)伏安法詢問時)給出對應(yīng)于在靜態(tài)池中得到的那些的峰，從而慮及了原型流動池的“不足”。第三，脂質(zhì)層在電解液流 中是穩(wěn)定的。第四，通過向電極組件300的電極組件301和302施加合適的電勢，可以方便 地從電解液流沉積脂質(zhì)層。實施例8此實施例示出懸汞滴電極(HMDE)與如通過實施例3的程序制備的Pt/Hg電極的 性質(zhì)的類似性。HMDE基于使用直徑為0. Imm的毛細管，因而為汞滴提供與根據(jù)本發(fā)明的電極中的 汞的表面積大約相同的表面積。在靜態(tài)池構(gòu)造中并排比較HMDE和本發(fā)明的電極。所有試驗在0. IM氯化鉀溶液中 進行。測量在75Hz在-0. 4至-1. 15V之間用4. 95mV rms以5mV s"1的掃描速率進行。對于HMDE和復(fù)合Pt/Hg電極的電容-電勢掃描分別顯示在圖19(a)和(b)中。盡 管在圖19(a)和(b)中顯示的電容值有輕微的差異，曲線的形狀表明兩種電極的性質(zhì)的接 近的類似性。實施例9此實施例比較HMDE電極與如根據(jù)實施例3中制備的電極，二者均包覆有1，2_ 二 油酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DOPC)的單層膜，在連續(xù)掃描之間沉積新的1，2_ 二油 酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DOPC)的層。試驗在0. IM Kcl中進行。用4. 95mV rms以 SmVs"1的掃描速率在-0. 4V和-1. 15V之間進行負程(negative going) ‘正向，電勢掃描， 然后立即接著從-1. 15V至-0. 4V進行正程(positive going) ‘反向’掃描。對于HMDE和 本發(fā)明的電極的結(jié)果分別顯示在圖20(a)和(b)中。對于在電解質(zhì)溶液中的“裸露”電極的掃描(結(jié)果顯示在圖19中)，兩種電極均顯 示出可比較的結(jié)果?！聪颉妱輶呙栾@示了本發(fā)明的電極比HMDE電極略微更穩(wěn)定。實施例10重復(fù)實施例9的程序，但是以0. 5 μ mo 1 dm—3的濃度在電解液中結(jié)合氯丙嗪。氯丙
嗪的結(jié)構(gòu)顯示在下面
<formula>formula see original document page 21</formula>對于HMDE和本發(fā)明的電極的結(jié)果分別由圖21(a)和21(b)中的暗線表示。為了 比較的目的，這些圖還結(jié)合了在實施例9中得到的結(jié)果。再次，兩種電極顯示出非常類似的電容-電勢掃描。實施例11重復(fù)實施例9的程序，但是以0. 5 μ mol dm—3的濃度在電解液中結(jié)合異丙嗪。異丙
嗪的結(jié)構(gòu)顯示在下面<formula>formula see original document page 22</formula>對于HMDE和本發(fā)明的電極的結(jié)果分別由圖22(a)和22(b)中的暗線表示。為了 比較的目的，這些圖還結(jié)合了在實施例9中得到的結(jié)果。在此情況下，兩種電極均顯示出對于測試化合物的響應(yīng)，但是本發(fā)明的電極顯示 比HMDE更強的響應(yīng)(峰的較大降低)。實施例12重復(fù)實施例9的程序，但是以0. 5 μ mol dm_3的濃度在電解液中結(jié)合H16。H16的
結(jié)構(gòu)顯示在下面。<formula>formula see original document page 22</formula>對于HMDE和本發(fā)明的電極的結(jié)果分別由圖23(a)和23(b)中的暗線表示。為了 比較的目的，這些圖還結(jié)合了在實施例9中得到的結(jié)果。在此情況下，本發(fā)明的電極顯示比在HMDE的情況下看到的響應(yīng)遠遠更大的響應(yīng)， 從而表明前者比后者更大的靈敏度。實施例13重復(fù)實施例12但是使用5 μ mol dm_3的H16。對于HMDE和本發(fā)明的電極的結(jié)果分別由圖24(a)和(b)中的暗線表示。為了比 較的目的，這些圖還結(jié)合在實施例9中得到的結(jié)果。圖24(a)和(b)顯示在兩種電極上均容易可見的對測試化合物的大的響應(yīng)，其中 本發(fā)明的電極仍顯示略微更大的響應(yīng)。實施例14按照實施例9的程序，評價根據(jù)實施例3的程序制備并且分別設(shè)置有DOPC、DOPE 和DOPS的單層的Pt/Hg復(fù)合電極。結(jié)果顯示在圖25 (a)-(c)中，圖25 (a)-(c)分別顯示對于D0PC、D0PE和DOPS的結(jié) 果(注意DOPS與顯示的其它兩種脂質(zhì)相比在垂直比例上的差別)。結(jié)果顯示所有三種類型的脂質(zhì)的單層都可以形成在電極上并且在AC伏安法試驗 中分別產(chǎn)生不同的特征徑跡。實施例15重復(fù)實施例14的程序，但是將0. 5 μ mol dm—3氯丙嗪結(jié)合在電解質(zhì)溶液中。結(jié)果由圖26(a)_(c)中的暗線示出，圖26 (a) - (c)分別顯示對于DOPC、DOPE和 DOPS的結(jié)果。為了比較的目的，圖26(a)-(c)還結(jié)合了顯示在圖25中的結(jié)果。圖26清楚地示出氯丙嗪與脂質(zhì)單層的相互作用(參見重疊的來自圖25的對于 “非相互作用”單層的結(jié)果)。
實施例16對于根據(jù)實施例3制備并且結(jié)合了 DOPC單層的電極重復(fù)實施例10的程序以對下 列化合物評價該體系，所有化合物均以0. 5 μ mol dm—3的濃度提供在電解液中，除以5 μ mol dm-3的濃度使用的(f)苧烯以外(a)氯丙嗪
(b)異丙嗪(C)HI6(d)MB327(e)熒蒽(f)苧烯結(jié)果分別通過顯示在圖27 (a)-(f)中的暗線表示，圖27 (a) - (f)還結(jié)合了測試的 化合物的結(jié)構(gòu)式和對于在電解液中沒有測試化合物的DOPC包覆電極得到的結(jié)果。結(jié)果顯示所有六種化合物均可以通過該體系檢測。另外，可以在可比的濃度在它 們之間進行區(qū)別。實施例17使用下列濃度的氯丙嗪重復(fù)實施例10的程序(a)0. 05 μ mol dnT3(b)0. 1 μ mol dnT3(c)0. 2 μ mol dnT3(d)0. 5 μ mol dnT3結(jié)果分別通過顯示在圖28(a)_(d)中的暗線表示，圖28(a)_(d)還結(jié)合了對于沒 有在電解液中結(jié)合氯丙嗪的DOPC電極得到的結(jié)果。如可以從圖28(a)_(d)看到的，即使在測試的最低氯丙嗪濃度，即0.05μπιΟ1 dm—3，也存在來自體系的響應(yīng)。 使用對于ppb的下列公式
每十億的份數(shù)=
(溶液的質(zhì)量J V !并且假設(shè)使用的溶液的密度為lg/ml，則0.05μπιΟ1 dm_3的靈敏度轉(zhuǎn)化為約 18ppb。參考文獻[1], Sackmann E；Science 1996,271,43.[2], ffanunu, Μ. ；Vaskevich, Α. ；Rubinstein, I. ;J. Am. Chem. Soc. 2004,126, 5569.[3], Heyse, S. ；Vogel, H. ；Sanger, Μ. ；Sigrist, H. ；Protein Sci. 1995,4,2532.[4]. Shumyantseva, V. V. ；Ivanov, Y. D. ；Bistolas, N. ；Scheller, F. W.； Archakov, Α. I. ；Wollenberger, U. ；Anal. Chem. 2004，76，6046.[5]. Becucci, L. ；Leon, R. R. ；Moncelli, MR, ；Rovero,P. ；Guidelli, R. ；Langmuir 2006，22，6644.
[6], Nelson. Α. ；Anal. Chim. Acta 1987，194，139.[7], Nelson, Α. ；Auffret, N. ；Readman, J. ；Anal. Chim. Acta 1988，207，45.[8], Nelson, A. ；Auffret, N. ；Borlakoglu, J. ；Biochim. Biophys. Acta 1990, 1021,205.[9]. Bizzotto, D ；Nelson, A ；Langmuir 1998，14，6269.[10], Monne J ；Galceran J ；Puy J ；Nelson A ；Langmuir 2003，19,4694.[11], ffhitehouse, C；0 ‘ Flanagan, R；Lindholm-Sethson, B ；Movaghar, B ； Nelson, A ；Langmuir 2004，20，136.[12]. ffhitehouse, C ；Gidalevitz, D ；Cahuzac, M ；Koeppe, R. E II ；Nelson, A ； Langmuir 2004，20，9291[13], Nelson, A ；Biophys. J. 2001，80，2694.[14]. Protopapa, Ε. P. ；Aggeli, Α. ；Boden, N. ；Knowles, P. F. ；Salay, L. C ； Nelson, Α, ；Medical Engineering and Physics 2006,25,944.[15] . MerrifielcLJ. ；Tattersall, J. E. H. ；Bird, M. ；Nelson, A.； Electroanalysisin press[16], Weiss, S ；Millner, P. ；Nelson, Α. ；Electrochimica Acta 2005,50,4248.[17]. Burgess, I. ；Li, Μ. ；Horswell, S. L. ；Szymanski, G. ；Lipkowski, J.； Satija, S. ；Majewski, J. ；Colloids and Surfaces B-Biointerfaces 2005,40,117.[18]. Bin, X. M. ；Zawisza, I. ；Goddard, J. D. ；. lipkowski, J. ；Langmuir 2005, 27,330.[19]. Nelson, A. ;J. Electroanal. Chem. 2006 in press.[20]· Willmann，S. et al. J. Med. Chem. 2004,47,4022.[21]. F. Neville, M. Cahuzac, A. Nelson, D. Gidalevitz, 2004, Journal ofPhysics-Condensed Matter 16(26) :S2413_S2420.[22] · F. Neville,D. Gidalevitz,G. Kale,A.Nelson,2006，Bioelectrochemistry. in press.[23]. Ringstad, L. ；Nelson, A. ；Malmsten, Μ. ；in preparation.[24], Stoodley. R. ；Bizzotto, D. ；Analyst 2003，128，552.[25]. Kounaves, S. P. ；Deng, W. ；Anal. Chem. 1993，65，375.[26]· Nolan，Μ· Α· ；Kounaves, S. P. ；Anal. Chem. 1999,71,3567.[27]· D. C. Grahame，Journal Of The American Chemical Society,1949,71(9), 2975-2978.
權(quán)利要求
一種電極組件，所述電極組件包括至少一個工作電極，所述工作電極包括導(dǎo)電載體基底，所述導(dǎo)電載體基底的表面包覆有固定在所述基底的所述表面上的汞，其中遠離所述基底的所述汞的表面包覆有磷脂層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組件，其中所述載體基底為選自由銥、鉬、鈀和鉭組成的組的金屬。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組件，其中所述載體基底為碳。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的組件，所述組件包括多個工作電極。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的組件，其中對于所述工作電極或每一個工作電 極，沒有暴露的自由的導(dǎo)電載體基底表面。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的組件，其中所述工作電極或每一個工作電極為 微電極。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組件，其中所述汞具有在任何方向上為2μ m至1000 μ m的最 大表面尺寸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組件，其中所述工作電極或每一個工作電極是直徑為2μ m至 1000 μ m的圓形。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的組件，所述組件包括所述載體基底的層，所述層 夾在第一和第二絕緣基底層之間，所述絕緣基底層中的第一個被至少一個貫穿孔穿透，所 述貫穿孔限定所述載體金屬為其提供底表面的井，所述井結(jié)合了汞覆層(對于所述載體金 屬)，在所述汞覆層上設(shè)置所述磷脂層，從而形成所述工作電極。
10.根據(jù)權(quán)利要求9中所述的組件，所述組件還包括夾在所述第二絕緣基底與所述載 體金屬層之間的傳導(dǎo)層，所述傳導(dǎo)層與所述載體金屬層處于電傳導(dǎo)關(guān)系。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的組件，其中所述導(dǎo)電載體基底為鉬。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的組件，其中所述磷脂選自由DOPC、DOPE、 DOPG、DOPS和DOPEG組成的組。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的組件，所述組件還包括參比電極和/或?qū)﹄姌O。
14.一種微電極陣列形式的電極組件，所述電極組件包括 (i)第一和第二絕緣層，( )選自由銥、鉬、鈀和鉭組成的組的導(dǎo)電載體基底金屬的層，其設(shè)置在所述絕緣層之間，(iii)多個井，所述井形成在所述第一層中，使得所述金屬層為所述井提供各自的底表 面，所述不連續(xù)部分各自形成工作電極的一部分，所述工作電極包括所述不連續(xù)部分、其汞 覆層和所述汞的表面上的磷脂層，(iv)任選地，傳導(dǎo)層，其設(shè)置在所述金屬層和所述第二基底之間并且與其處于電傳導(dǎo) 關(guān)系，(ν)對電極，其設(shè)置在所述第一基底上， (vi)參比電極，其設(shè)置在所述第一基底上。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的電極組件，其中所述導(dǎo)電基底為鉬。
16.一種生物傳感器，所述生物傳感器包括(i)根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的電極組件， ( )至少一個用于一個或多個所述工作電極的對電極，(iii)參比電極，(iv)用于向所述至少一個工作電極施加周期變化電壓的裝置，和(ν)用于確定作為相對于所述對電極的電勢的函數(shù)的所述磷脂的微分電容變化的裝置。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的生物傳感器，其中所述用于施加周期變化電壓的裝置適于 提供鋸齒波形。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的生物傳感器，其中所述鋸齒波形具有>IVs-1的用于通過 循環(huán)伏安法進行測量的變化速率。
19.根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一項所述的生物傳感器，其中所述參比電極和所述工作 電極結(jié)合在所述電極組件中。
20.一種生物傳感器，所述生物傳感器包括 (i)如權(quán)利要求14或15中所述的電極組件，( )用于向所述至少一個工作電極施加周期變化電壓的裝置，和 (iii)用于確定相對于所述對電極的所述磷脂的微分電容變化的裝置。
21.一種使用根據(jù)權(quán)利要求16或20所述的生物傳感器分析樣品以確定其中的生物膜 活性的方法，所述方法包括下列步驟(b)將所述樣品暴露于所述電極組件的一個或多個所述工作電極和(c)使用伏安法技術(shù)確定所述生物膜活性。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述伏安法技術(shù)為快速循環(huán)伏安法。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述變化速率為≥lVs—1。
24.根據(jù)權(quán)利要求21至23中任一項所述的方法，所述方法包括以下順序的至少一次重復(fù)(a)通過在復(fù)合電極的汞覆層上沉積磷脂制備所述工作電極，所述復(fù)合電極包括所述 導(dǎo)電基底及其汞覆層；(b)將所述樣品暴露于所述電極組件的一個或多個所述工作電極；(c)使用伏安法技術(shù)確定所述生物膜活性；和(d)從所述工作電極移除所述磷脂以留下所述復(fù)合電極。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中步驟(a)通過在陰極方向上掃描所述復(fù)合電極 進行。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的方法，其中(d)通過在陰極方向上掃描所述工作電極 進行。
27.一種在流動池中進行的根據(jù)權(quán)利要求21至26中任一項所述的方法。
28.一種流動池，所述流動池包括 ⑴測量池；( )至少一個根據(jù)本發(fā)明的工作電極，所述工作電極暴露在所述測量池中；(iii)通往所述測量池的電解液入口；(iv)離開所述測量池的電解液出口；(ν)參比電極；和 (Vi)對電極。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的流動池，其中所述工作電極、參比電極和對電極設(shè)置在芯 片上。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的流動池，其中所述芯片由根據(jù)權(quán)利要求14所述的電極組件提供。
全文摘要
一種可以用于例如電化學(xué)分析樣品以確定具有生物膜活性的物種的存在(或其它情況)的電極組件，所述電極組件包括至少一個工作電極，所述工作電極包括導(dǎo)電載體基底，所述導(dǎo)電載體基底的表面包覆有固定在所述基底的表面上的汞。遠離所述基底的所述汞的表面包覆有磷脂層。優(yōu)選的載體基底為鉑。所述電極組件可以結(jié)合在流動池中。
文檔編號G01N33/487GK101809438SQ200880109572
公開日2010年8月18日 申請日期2008年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月31日
發(fā)明者勞倫斯·安德魯·尼爾森, 扎卡里·科爾德里克 申請人:利茲大學(xué)