專利名稱：微波腔中的熒光顯微鏡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種光學(xué)成像系統(tǒng)，其提供化學(xué)反應(yīng)時(shí)間的提高以及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的
能力，并且具有足夠的分辨率來觀察用發(fā)光分子標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)組分的位置、以及多種生物
分子之間的相互作用和對(duì)活細(xì)胞和組織中的局部化環(huán)境變化的響應(yīng)。 在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及微波/光學(xué)成像系統(tǒng)，其包括 a)被封閉的容器，其包括微波腔并且在其中具有至少一個(gè)開口 ； b)設(shè)置于微波腔中用于保持至少一個(gè)樣品的樣品板，其中樣品包括檢測(cè)劑分子或
進(jìn)行能夠被檢測(cè)的反應(yīng)的組分； c)通信連接于微波腔用于將微波能量遞送進(jìn)微波腔中并朝向樣品引導(dǎo)的微波能
4量產(chǎn)生源； d)設(shè)置用于向樣品遞送能量的電磁能量產(chǎn)生源；禾口 e)通信連接于微波腔的光學(xué)成像裝置，其設(shè)置為用于將來自電磁能量產(chǎn)生源的光 引導(dǎo)到樣品并且捕獲由樣品發(fā)射的發(fā)光發(fā)射。 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及微波/顯微鏡系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括 a)被密封的容器，其包括微波腔并且在其中具有預(yù)定尺寸的開口，其中微波腔的
內(nèi)部包括用于放置至少一個(gè)樣品板的平臺(tái)，所述樣品板用于保持至少一個(gè)樣品，其中所述
樣品包括作為額外的標(biāo)記分子而被包括在內(nèi)的信號(hào)產(chǎn)生試劑或由于樣品中的化學(xué)反應(yīng)而
形成的試劑； b)通信連接于微波腔用于將微波能量遞送進(jìn)微波腔中的微波能量產(chǎn)生源；禾口
c)通信連接于微波腔的熒光顯微鏡系統(tǒng)，其設(shè)置為用于向樣品遞送激發(fā)能并且捕 獲來自樣品的發(fā)射，其中所述熒光顯微鏡系統(tǒng)包括
用于以一定頻率產(chǎn)生能量來激發(fā)樣品的電磁能量產(chǎn)生源； 設(shè)置為用于從所述電磁能量產(chǎn)生源接受電磁能量并將其聚焦在樣品上的物鏡；
設(shè)置在激光器和物鏡之間的二向色鏡，用于將來自能量源的電磁能量反射到物鏡 以及用于引導(dǎo)來自樣品的發(fā)射信號(hào)；禾口 設(shè)置在二向色鏡后面的管透鏡，用于收集來自樣品的發(fā)射并將其引導(dǎo)到檢測(cè)器裝置。 所述樣品板可以包括沉積在樣品板表面上的至少一層金屬材料，包括銀、金、銅、 鋅、鋁或鉑，其中所述金屬材料形成為帶圖案的形狀。優(yōu)選地，所述帶圖案的形狀包括具有 至少一個(gè)頂端的幾何形狀，幾何形狀為例如三角形、正方形、矩形、梯形、多邊形、拋物線形、 橢圓形、圓的扇形、長橢圓形和/或其組合，其中所述多個(gè)頂端彼此相鄰，從而在其中產(chǎn)生 反應(yīng)性區(qū)域。所述其中的反應(yīng)性區(qū)域可以另外準(zhǔn)備用于放置被固定的與檢測(cè)劑分子互補(bǔ)的 捕獲分子、用于與其它化學(xué)品反應(yīng)的化學(xué)品、或用于與其它生物分子反應(yīng)的生物分子。所述 反應(yīng)性區(qū)域可具有的直徑或在相鄰和/或相對(duì)頂端之間的距離為約0. Olmm到5mm、更優(yōu)選 2mm到約3mm。另外，所述反應(yīng)性區(qū)域可以被設(shè)置在具有多個(gè)孔的試驗(yàn)系統(tǒng)上，其中所述反 應(yīng)性區(qū)域位于所述孔內(nèi)并且暴露于微波能量下增強(qiáng)其中的反應(yīng)。 樣品板可以由聚合物材料、玻璃、紙、硝化纖維素、其組合或?yàn)樵O(shè)置金屬材料提供 足夠穩(wěn)定性的任何材料制成。 所述頂端區(qū)域/反應(yīng)性區(qū)域暴露于一定量的微波能量下，用于提高生物學(xué)相互作 用的反應(yīng)速率，用于提高感測(cè)技術(shù)中的來自化學(xué)發(fā)光反應(yīng)、熒光、磷光或熒光標(biāo)記的發(fā)射強(qiáng) 度；用于通過將電磁場(chǎng)聚焦在反應(yīng)性區(qū)域內(nèi)而增強(qiáng)電場(chǎng)，和/或用于增強(qiáng)反應(yīng)性區(qū)域內(nèi)所 含分子的布朗運(yùn)動(dòng)。 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及制備樣品板的方法，所述方法包括 a)向襯底表面施加至少一個(gè)金屬結(jié)構(gòu)，所述襯底表面包括但不限于玻璃、聚合物、 紙、硝化纖維素，其中所述金屬結(jié)構(gòu)由銀、金、鋁、鋅、鉬、銅或其組合物制成，其中所述金屬 結(jié)構(gòu)具有成形的圖案，并且其中成形圖案的區(qū)域包括設(shè)置為鄰近另一個(gè)成形圖案頂端的頂 端區(qū)域，從而提供處于至少兩個(gè)頂端區(qū)域之間的反應(yīng)性區(qū)域；禾口 b)引入包含至少一種生物分子的溶液，用于設(shè)置在所述相鄰的頂端區(qū)域之間的反
5應(yīng)性區(qū)域。 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及使由微波誘導(dǎo)的生物分子的反應(yīng)或相互作用實(shí)時(shí)數(shù)據(jù) 成像的方法，所述方法包括 a)提供包括至少一種生物分子和檢測(cè)劑分子的樣品，其中將所述樣品設(shè)置在樣品 板上； b)將樣品置于微波腔中，其中所述微波腔通信連接于微波產(chǎn)生源并且還通信連接 于光學(xué)成像系統(tǒng)，其中所述光學(xué)成像系統(tǒng)包括 i.用于以一定頻率產(chǎn)生能量來激發(fā)樣品的電磁能量產(chǎn)生源；
ii.設(shè)置用于接受激發(fā)電磁能量并將其聚焦在樣品上的物鏡； iii.設(shè)置在激光器和物鏡之間的二向色鏡，用于將來自能量源的電磁能量反射到 物鏡以及用于引導(dǎo)來自樣品的發(fā)射信號(hào)；禾口 iv.設(shè)置在二向色鏡后面的管透鏡，用于收集來自樣品的發(fā)射并將其引導(dǎo)到檢測(cè) 器裝置； c)用一定量的低功率微波能量輻射樣品以增加樣品中的相互作用或反應(yīng)；禾口
d)用步驟b)的光學(xué)成像系統(tǒng)將檢測(cè)劑分子的發(fā)射信號(hào)成像。 使用被引導(dǎo)給置于由相鄰的金屬圖案形成的反應(yīng)性區(qū)域中的樣品的低功率微波 能量提高在樣品內(nèi)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)的速度。 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)通過以下發(fā)明詳述、附圖和權(quán)利要求而變得顯而易見。


圖1表示本發(fā)明的微波/顯微鏡的實(shí)施方案。 圖2表示用于制備在本文所述系統(tǒng)中使用的樣品板的樣品幾何結(jié)構(gòu)方案。 圖3顯示10 MRu(by)2Cl2在不同溫度下的歸一化強(qiáng)度譜。玻璃幾何結(jié)構(gòu)(插圖，
樣品幾何結(jié)構(gòu))的10iiM Ru(by)^l2溶液的歸一化強(qiáng)度比用箭頭標(biāo)記，"蝶形領(lǐng)結(jié)"樣品幾
何結(jié)構(gòu)(插圖，樣品幾何結(jié)構(gòu))的10iiMRu(by)^^溶液的歸一化強(qiáng)度比用虛線標(biāo)記。歸一
化強(qiáng)度比計(jì)算為暴露于短微波脈沖過程中的時(shí)間依賴性發(fā)射強(qiáng)度與暴露于短微波脈沖之
前的最大發(fā)射強(qiáng)度的比值。 圖4表示'蝶形領(lǐng)結(jié)'(一 ---')和玻璃載片(--)樣品幾何結(jié)構(gòu)在施加
低功率微波脈沖之前(大的破折號(hào)——)和過程中的Ru(by)2Cl2發(fā)射(沒有二向色鏡)的 歸一化光譜。疊加了二向色透射曲線來顯示二向色鏡對(duì)Ru(by)^l2發(fā)射的過濾作用。
圖5示出了得自CCD圖像的在IOO像素2區(qū)域內(nèi)的歸一化的平均熒光強(qiáng)度(由 方框法估計(jì)的所選區(qū)域)的時(shí)間描圖，所述描圖是在施加5秒低功率微波脈沖(Mw脈 沖)過程中在不相交的'蝶形領(lǐng)結(jié)'接合點(diǎn)處以及在普通(plain)玻璃載片(對(duì)照)上的 10i!MRu(by)2Cl2溶液的描圖。樣品構(gòu)造顯示在CCD圖像的右側(cè)(插圖)。
圖6顯示在A)普通玻璃襯底、B)用氣相淀積的金'蝶形領(lǐng)結(jié)'結(jié)構(gòu)75nm改性的玻 璃襯底上的在暴露于五秒微波脈沖過程中10i!MRU(by)2Cl2的熒光強(qiáng)度降低的實(shí)時(shí)電影記 錄，顯示了在微波腔中的熒光顯微鏡的功能性。 圖7顯示了在普通玻璃載片(對(duì)照)上以及在75nm厚的不相交的'蝶形領(lǐng)結(jié)'幾 何結(jié)構(gòu)的間隙中的得自化學(xué)發(fā)光溶液的最大像素強(qiáng)度時(shí)間描圖。以10Hz的速率收集CCD圖像大約10秒。樣品暴露于五秒微波脈沖(Mw脈沖)，所述脈沖在數(shù)據(jù)收集之后大約2秒 開始。離散的時(shí)間間隔被標(biāo)記為a)0秒或穩(wěn)態(tài)發(fā)射、b)在初始暴露于微波脈沖時(shí)的發(fā)射、 c)在施加微波脈沖過程中和d)最大'觸發(fā)'發(fā)射、e)最終的發(fā)射。 圖8顯示了在普通玻璃載片(對(duì)照)上的不相交處的化學(xué)發(fā)光溶液在離散的時(shí)間 間隔處的CCD圖像。以10Hz的速率收集CCD圖像大約10秒。樣品暴露于五秒微波脈沖 (Mw脈沖)，所述脈沖在數(shù)據(jù)收集之后大約2秒開始。離散的時(shí)間間隔被標(biāo)記為a) 0秒或穩(wěn) 態(tài)發(fā)射、b)在初始暴露于微波脈沖時(shí)的發(fā)射、c)在施加微波脈沖過程中和d)最大'觸發(fā)' 發(fā)射、e)最終的發(fā)射。 圖9顯示了在不相交的'蝶形領(lǐng)結(jié)'接合點(diǎn)上在不相交處的化學(xué)發(fā)光溶液在離散 的時(shí)間間隔的CCD圖像。以10Hz的速率收集CCD圖像大約10秒。樣品暴露于五秒微波脈 沖(Mw脈沖)，所述脈沖在數(shù)據(jù)收集之后大約2秒開始。離散的時(shí)間間隔被標(biāo)記為a)O秒 或穩(wěn)態(tài)發(fā)射、b)在初始暴露于微波脈沖時(shí)的發(fā)射、c)在施加微波脈沖過程中和d)最大'觸 發(fā)'發(fā)射、e)最終的發(fā)射。 圖10顯示了 6 的化學(xué)發(fā)光溶液的綠色CCD電影記錄圖像，A)在玻璃襯底上， B)在不相交的'蝶形領(lǐng)結(jié)'幾何結(jié)構(gòu)(破折號(hào)輪廓表示三角形的'蝶形領(lǐng)結(jié)'端部)的間隙中。 發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及通信連接于微波能量產(chǎn)生源的實(shí)時(shí)光學(xué)成像系統(tǒng)，從而提供用于在施
加微波場(chǎng)過程中記錄生物分子相互作用的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)和生物系統(tǒng)中的反應(yīng)的手段。 本發(fā)明的系統(tǒng)可以為微波或射頻驅(qū)動(dòng)的在表面處、溶液中、在包括原核生物和真
核生物在內(nèi)的活生物體中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、DNA-蛋白質(zhì)、RNA-蛋白質(zhì)、DNA-RNA、化學(xué)
品_蛋白質(zhì)、化學(xué)品-DNA、和化學(xué)品-蛋白質(zhì)之間的相互作用提供實(shí)時(shí)成像。此外，本發(fā)明
為由微波誘導(dǎo)的對(duì)生物系統(tǒng)的影響提供實(shí)時(shí)成像，為原核生物和真核生物體中、在界面處、
表面處和溶液中的由微波誘導(dǎo)的生物分子反應(yīng)提供實(shí)時(shí)成像。另外，本發(fā)明為由微波誘導(dǎo)
的將小生物分子轉(zhuǎn)染到活生物體、原核生物和真核生物中提供實(shí)時(shí)成像。 本文中使用的術(shù)語"生物分子"是指在自然界中存在的任何分子或這種分子的衍
生物。所述生物分子可以是活性的或無活性的形式。"活性形式"是指該生物分子處于可以
執(zhí)行生物學(xué)功能的形式。"無活性形式"是指該生物分子必需在其執(zhí)行生物學(xué)功能之前經(jīng)過
天然或合成的處理。示例性的生物分子包括核酸、芳香碳環(huán)結(jié)構(gòu)、NADH、 FAD、氨基酸、蛋白
質(zhì)、肽、碳水化合物、甾族化合物、核黃素、DNA、RNA、寡核苷酸、核酸、脂肪酸、肌紅蛋白、糖類
例如葡萄糖等、維生素、輔助因子、嘌呤、嘧啶、間型霉素、脂質(zhì)、植物光敏色素、phytofluor、
肽、脂質(zhì)、抗體和藻膽蛋白。 本文中使用的術(shù)語"受體-配體"是指其中各組分彼此具有親合力的任何天然存 在的或非天然存在的結(jié)合對(duì)。例如，所述結(jié)合對(duì)可以包括抗體/抗原復(fù)合物、病毒包衣配體 /蛋白質(zhì)細(xì)胞受體或探針和結(jié)合配對(duì)體的任何組合。術(shù)語"受體"是指對(duì)于樣品中的特定的 化學(xué)基團(tuán)、分子、病毒、探針或任何生物制劑靶標(biāo)具有親和力的天然存在的或合成的化學(xué)基 團(tuán)、分子、生物試劑。用于本發(fā)明的受體-配體的選擇可以由疾病、病況或要檢測(cè)的感染來 決定。 本發(fā)明的系統(tǒng)包括檢測(cè)劑分子或?qū)﹄姶偶ぐl(fā)、化學(xué)激發(fā)、光源激發(fā)、或連續(xù)或脈沖激發(fā)的激光束有響應(yīng)以產(chǎn)生熒光的可檢測(cè)的化學(xué)反應(yīng)，所述響應(yīng)包括化學(xué)發(fā)光、熒光或磷 光發(fā)射。 檢測(cè)劑分子包括在該物質(zhì)被不同波長(激發(fā)波長)的輻射照射時(shí)發(fā)射電磁能量的 熒光團(tuán)，所述電磁能量例如為某一波長(發(fā)射波長)的光，并且意在包括能夠與樣品中的所 關(guān)心的被分析物特異性地相互作用或反應(yīng)以提供一種或多種光信號(hào)的化學(xué)或生物化學(xué)分 子或其片段。另外，熒光團(tuán)包括非固有熒光團(tuán)(extrinsic fluorophore)和固有熒光團(tuán)。非 固有熒光團(tuán)是指結(jié)合于另一種物質(zhì)的熒光團(tuán)。固有熒光團(tuán)是指自身是熒光團(tuán)的物質(zhì)。示例 性的熒光團(tuán)包括但不限于在Molecular Probes Catalogue中列舉的那些，所述文獻(xiàn)被并入 本文作為參考。 代表性的熒光團(tuán)包括但不限于Alexa Fluor⑧350、 DansylChloride (DNS-C1)、 5-(碘代乙酰胺基)熒光素(5-IAF)凍光素5-異硫氰酸酯(FITC)、四甲基羅丹明5-(和 6_)異硫氰酸酯(TRITC)、6-丙烯酰基-2-二甲氨基萘(acrylodan)、7-硝基苯并-2-氧 雜-1， 3- 二唑-4-基氯化物(NBD-C1)、溴化乙錠、螢光黃、5-羧基羅丹明6G鹽酸鹽、麗絲胺 羅丹明B磺酰氯、Texas RecTM、磺酰氯、B0DIPYTM、萘磺酸類(包括但不限于1_苯胺萘_8_磺 酸(ANS)和6-(對(duì)甲苯胺基)萘-2-磺酸(TNS))、蒽基脂肪酸(Anthroyl fatty acid)、 DPH、十八碳四烯酸、TMA-Dra、芴基脂肪酸、熒光素-磷脂酰乙醇胺、德克薩斯紅-磷脂酰 乙醇胺、芘基_磷脂酰膽堿、芴基_磷脂酰膽堿、部花青540、1-(3-硫酸根合(sulfonate) 丙基)-4-[-e-[2[(二正丁基氨基)-6萘基]乙烯基]吡啶鎗甜菜堿(N即htylStyryl)、 3，3' 二丙基硫雜二碳花青((115-03-(5))、4-(對(duì)-二戊基氨基苯乙烯基)-1-甲基妣啶 鎗(di-5-ASP) 、 Cy-3碘乙酰胺、Cy-5-N-羥基琥珀酰亞胺、Cy_7_異硫氰酸酯、羅丹明800、 IR-125、噻唑橙、Azure B、尼羅藍(lán)、A1酞菁、0xaxine 1，4' ，6-二脒基-2-苯基n引哚(DAPI)、 Hoechst 33342、 T0T0、吖啶橙、乙菲啶同二聚體(Ethidium Homodimer) 、 N(乙氧羰基甲 基)-6_甲氧基喹啉(MQAE) 、Fura-2、鈣綠(Calcium Green) 、 CarboxySNARF-6、 BAPTA、香豆 素、phytof luors、六苯并苯和金屬-配體復(fù)合物。 代表性的固有熒光團(tuán)包括但不限于具有芳族環(huán)結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物，包括但不限于 NADH、 FAD、酪氨酸、色氨酸、嘌呤、嘧啶、脂質(zhì)、脂肪酸、核酸、核苷酸、核苷、氨基酸、蛋白質(zhì)、 肽、DNA、RNA、糖和維生素。另外的適合的熒光團(tuán)包括酶-輔助因子；鑭系元素、綠色熒光蛋 白、黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、或其突變體和衍生物。 可以將提供化學(xué)反應(yīng)的任何化學(xué)發(fā)光物質(zhì)用于本發(fā)明，所述化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生可檢測(cè) 的反應(yīng)(被觀察到的發(fā)射)，其中引起被觀察到的發(fā)射的被激發(fā)的狀態(tài)包括但不限于以下 激發(fā)機(jī)理 R +R' — R-R+hv (單鍵形成(自由基_自由基反應(yīng)))
.R. + .R.' — R = R+hv(雙鍵形成(自由基-自由基反應(yīng)))
R02 — R +02 — R+hv
R++e— — R+hv (電子捕獲)。 適合的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)劑分子的實(shí)例包括但不限于過氧化物酶、細(xì)菌熒光素 酶、熒光蟲熒光素酶、官能化的鐵卟啉衍生物、苯巴比妥、異氨基苯二酰一肼、吖啶鎗值 (acridinium esters)、磺酰胺以及其它。最近的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物包括以次黃嘌呤作為底物 的黃嘌呤氧化酶。觸發(fā)試劑包含過硼酸鹽Fe-EDTA復(fù)合物和氨基苯二酰一肼。特定的化學(xué)
8發(fā)光標(biāo)記物的選擇取決于若干因素，包括制備被標(biāo)記成員的成本、用于與檢測(cè)劑分子共價(jià) 連接的方法、檢測(cè)劑分子和/或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的大小。相應(yīng)地，化學(xué)發(fā)光觸發(fā)試劑的選擇 取決于所用的特定的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)已經(jīng)得到充分研究，并且在文獻(xiàn)中有充分記載。例如，過氧化物酶最 適合用于連接于用作化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)劑分子。在第一反應(yīng)中有效誘導(dǎo)光發(fā)射的觸發(fā)試劑包 括過氧化氫和氨基苯二酰一肼。也可以用于在過氧化物酶的存在下誘導(dǎo)光響應(yīng)的其它觸發(fā) 試劑包括異丁醛和氧氣。用過氧化物酶標(biāo)記檢測(cè)劑分子(例如抗體或抗原)的方法為本領(lǐng) 域中已知的。例如，為了制備用過氧化物酶標(biāo)記的抗體或抗原，分別使過氧化物酶和抗原或 抗體各自與N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基硫)丙酸酯(以下稱為SPDP)反應(yīng)。然后使被 SPDP標(biāo)記的過氧化物酶、或被SPDP標(biāo)記的抗原或抗體與二硫蘇糖醇反應(yīng)，以產(chǎn)生被硫醇標(biāo) 記的過氧化物酶、或被硫醇標(biāo)記的抗原或抗體。然后使硫醇衍生物與被SPDP標(biāo)記的抗原或 抗體、或被SPDP標(biāo)記的過氧化物酶偶聯(lián)。 通常，可以將光學(xué)成像系統(tǒng)和基于微波的技術(shù)的任何組合用于本發(fā)明中。如圖1 中所示，所述系統(tǒng)包括用于放置樣品的微波腔和用于產(chǎn)生電磁能量的源，所述電磁能量的 波長和頻率處于微波范圍或射頻范圍內(nèi)，更優(yōu)選處于微波范圍內(nèi)。 施加低水平的微波能量來加熱樣品可用于加速系統(tǒng)內(nèi)的任何生物學(xué)/生物化學(xué) 動(dòng)力學(xué)。值得注意的是，低水平的微波不使蛋白質(zhì)、DNA、或RNA破壞或變性，而是將樣品加 熱到足以加速動(dòng)力學(xué)，例如結(jié)合、雜交或化學(xué)相互作用。 微波(約0. 3到約300GHz)位于紅外線和射頻電磁輻射之間。普遍認(rèn)為微波通過 加熱作用加速化學(xué)和生物化學(xué)反應(yīng)，其中所述加熱基本上遵循微波介電損耗的原理。極性 分子通過偶極旋轉(zhuǎn)吸收微波輻射，并由此被加熱，而非極性分子由于介電常數(shù)較低而不吸 收微波輻射，并因此不被加熱。極性分子在外部施加的場(chǎng)的作用下自身對(duì)準(zhǔn)。在本項(xiàng)工作 中所使用的常規(guī)的微波爐腔中，輻射頻率(2450MHz)每秒改變符號(hào)2.45X10"欠。隨著極 性分子來回旋轉(zhuǎn)、隨著變化的場(chǎng)連續(xù)地重新排列的扭轉(zhuǎn)作用(tortional effect)而發(fā)生加 熱，其中分子旋轉(zhuǎn)慢于電場(chǎng)變化。作為分子被電場(chǎng)極化的能力的介電常數(shù)是指介質(zhì)被微波 加熱的能力。因此，諸如水、甲醇和二甲基甲酰胺的溶劑容易被加熱，而微波實(shí)際上可穿透 己烷、甲苯和二乙醚。 在本發(fā)明中，微波輻射可以由頻率介于0. 3-10GHz、更優(yōu)選約lGHz-5GHz、更優(yōu)選 2GZ-3GZ，功率大小為約10毫瓦特-700瓦特、優(yōu)選30毫瓦特-約500瓦特、更優(yōu)選約50瓦 特-300瓦特的電磁源來提供?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何源，例如到能夠發(fā)射在 微波范圍內(nèi)的能量的激光器。根據(jù)需要，微波輻射可以連續(xù)或間歇(脈沖)發(fā)射。
在可供選擇的方案中，微波能量可以通過用于輸送來自適當(dāng)?shù)拇趴毓艿奈⒉芰?的空腔波導(dǎo)管來提供。優(yōu)選微波能量經(jīng)過調(diào)節(jié)，以引起金屬材料內(nèi)的熱增加，而不對(duì)試驗(yàn)系 統(tǒng)中的任何生物材料造成損害。 在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品板通過附著金屬表面而進(jìn)行改性，所述金屬表面被制造 為用于形成諸如三角形、正方形、長橢圓形、橢圓形、矩形、或提供至少一個(gè)金屬表面頂端區(qū) 域的任何形狀的幾何形狀。另外的多種金屬幾何形狀可以附著于所述圖案形式的表面，來 提供處于頂端區(qū)域之間的至少一個(gè)反應(yīng)性區(qū)域?？梢灶A(yù)見，所述頂端區(qū)域不僅包括尖頂區(qū) 域，而且包括具有圓邊的區(qū)域，例如在長橢圓形或橢圓形中所見的。優(yōu)選頂端區(qū)域設(shè)置為使
9得一個(gè)頂端區(qū)域與另一個(gè)頂端區(qū)域相對(duì)或?qū)?zhǔn)，以便使反應(yīng)性區(qū)域被設(shè)置于其間。頂端區(qū) 域之間的距離可以為0. 01mm-5mm，更優(yōu)選為2mm-約3mm，取決于所需的反應(yīng)性區(qū)域的大小。 金屬幾何形狀的厚度為25nm-約1000nm，更優(yōu)選為約45nm_約250nm。
所述幾何形狀可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何手段形成在表面襯底上，包括 掩蔽表面襯底并隨后沉積金屬材料、將預(yù)先形成的金屬幾何形狀直接固定在襯底表面上、 或用金屬材料灌注表面襯底中的幾何形狀凹陷并在襯底上形成連續(xù)的平坦表面。另外，所 述幾何形狀可以包括多種材料，包括介電材料。例如，可以將一層金屬材料淀積在襯底表面 上，在其上面淀積一層SiOp 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明使用金屬化的橢圓形、球形、三角形或桿形式的島來 提供增強(qiáng)的發(fā)射。另外，金屬材料可以是多孔性三維基質(zhì)的形式。所述三維基質(zhì)可以是納 米孔性的三維基質(zhì)。所述金屬材料可以包括金屬膠體粒子和/或被嵌入到大分子聚合物基 質(zhì)的玻璃表面中的成形粒子。 如圖1中進(jìn)一步所示，所述系統(tǒng)包括電磁能量源，其通信連接于微波腔，用于向樣 品和檢測(cè)劑材料傳遞輻射能量，從而誘導(dǎo)化學(xué)激發(fā)、電激發(fā)、或單光子或多光子激發(fā)，以便 在檢測(cè)劑材料中產(chǎn)生特征性熒光。值得注意的是，用于施加電磁能量的所述源可以包括施 加必需的頻率或波長的任何裝置，例如弧光燈，包括水銀或氙；能夠以連續(xù)或脈沖模式產(chǎn)生 單光子或多光子的激光二極管和LED光源，其中所述電磁能量的強(qiáng)度與所述檢測(cè)劑分子或 可檢測(cè)反應(yīng)的吸收和隨后的熒光相對(duì)應(yīng)。通常使用的激光器是高強(qiáng)度單色光源，然而，需要 指出的是，還考慮了多點(diǎn)激光器。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用在700-1000nm的2-光子激發(fā)以及使用短脈沖寬度 (< 50pi)、高重復(fù)率(l-80MHz)、激光二極管和LED(lns， l-10MHz)源提供與1-光子激發(fā)相 比被加強(qiáng)的敏感性。如果熒光團(tuán)同時(shí)吸收兩個(gè)光子，其會(huì)吸收足夠的能量來提升到激發(fā)態(tài)。 然后所述熒光團(tuán)會(huì)發(fā)射具有一定波長的單光子，所述波長取決于所用的熒光團(tuán)并且典型地 處于可見光譜內(nèi)。 本發(fā)明的光學(xué)成像/微波系統(tǒng)不僅包括本文中上述討論的光源，而且包括用于觀 察所發(fā)射的激發(fā)信號(hào)(例如熒光)的光學(xué)器件。光源發(fā)光，所述光可能在紫外范圍內(nèi)，并且 擊中反射一定范圍的波長并允許另一范圍透過的二向色鏡。所述二向色鏡將光反射到樣品 用于激發(fā)樣品和/或檢測(cè)劑分子中的分子內(nèi)熒光。物鏡收集所產(chǎn)生的熒光波長的光。這個(gè) 熒光透過二向色鏡，并且優(yōu)選透過消除波長與熒光不同的波長，并使熒光通往成像設(shè)備。優(yōu) 選地，熒光顯微鏡使用落射熒光設(shè)置，其中物鏡即用于將輻射光聚焦在樣品/檢測(cè)劑分子 上，又用于收集從樣品/檢測(cè)劑分子發(fā)射的熒光。 包括微波腔的結(jié)構(gòu)構(gòu)建為用于與光學(xué)成像系統(tǒng)連通，其中在微波腔中制作一個(gè)開 口，用于將聚焦的光引導(dǎo)到樣品上，以及用于所發(fā)射的熒光波長的光離開。光源產(chǎn)生光束， 所述光束被引導(dǎo)到物鏡中，優(yōu)選所述光束通過光束擴(kuò)束鏡而使光束充分?jǐn)U展以提供經(jīng)過擴(kuò) 展的激發(fā)光的光束，其進(jìn)入微波腔用于聚焦在樣品上。 可以使用光檢測(cè)器檢測(cè)離開微波腔并通過物鏡的激發(fā)發(fā)射?？梢允褂枚喾N光檢測(cè) 器，例如光電二極管、電荷耦合器件(CCD)、光電倍增管(PMT)、或光子計(jì)數(shù)檢測(cè)器，其中各 自具有不同的靈敏度。PMT和光子計(jì)數(shù)檢測(cè)器可以實(shí)現(xiàn)高達(dá)10e-108的電子放大因子。常 規(guī)的PMT需要 lkV電源，但是新的小型化檢測(cè)器僅需要5V。大部分化學(xué)發(fā)光發(fā)射波長處于可見區(qū)內(nèi)?？梢允褂谜瓗V光器來確保檢測(cè)熒光波長。所述系統(tǒng)可以另外包括微驅(qū)動(dòng)器(microactuator)、檢測(cè)器、微處理器、電子設(shè)備、顯示器、和轉(zhuǎn)化平臺(tái)。檢測(cè)器的輸出可以連接于模_數(shù)轉(zhuǎn)換器和微處理器，以便計(jì)算被分析物濃度。 另外，本發(fā)明的系統(tǒng)可以包括在xy和z方向上可以移動(dòng)的樣品平臺(tái)。另外，考慮了使用多點(diǎn)激光器來產(chǎn)生點(diǎn)激發(fā)陣列，其被引導(dǎo)到物鏡以便聚焦在樣品上，從而產(chǎn)生多個(gè)聚焦斑點(diǎn)的陣列。另外，所述系統(tǒng)可以包括用于調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的透鏡的設(shè)備，以選擇樣品內(nèi)不同深度的聚焦點(diǎn)，以便入射在物體平面處的檢測(cè)劑分子或可檢測(cè)反應(yīng)上。值得注意的是，所述系統(tǒng)可以包括用于遞送同時(shí)或順序的、空間上和/或暫時(shí)受控的電磁輻射的多組件的組合，用于控制生物學(xué)或化學(xué)反應(yīng)的活性，所述生物學(xué)或化學(xué)反應(yīng)與任何小生物分子、化學(xué)分子、由任何介電材料(包括任何納米粒子或碳納米管)組成的粒子的任何大小或粒子集合、原核生物體、真核生物體和/或其組合直接或間接有關(guān)。 另外，本發(fā)明的組合的光學(xué)成像和微波系統(tǒng)可以包括如下的光學(xué)成像系統(tǒng)，包括但不限于熒光、發(fā)光、寬場(chǎng)、共聚焦反射的、共聚焦的、雙光子、多光子、寬場(chǎng)、旋轉(zhuǎn)圓盤、Nipkow旋轉(zhuǎn)圓盤、4-pi共聚焦的、用于將分子間相互作用成像的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、用于將分子與表面的相互作用成像的全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)(TIRFM)、多聚焦、多聚焦多光子、近場(chǎng)、單分子、光譜成像、壽命成像(lifetime imaging)、熒光成像、熒光相關(guān)光譜學(xué)、光柵成像相關(guān)光譜學(xué)(RICS)、和圖像相關(guān)光譜學(xué)(ICS)。
實(shí)施例 方法和材料優(yōu)質(zhì)的APS-涂層玻璃載片(75X25mm)得自Sigma-Aldrich。具有粘合劑的CoverWell成像室墊圈(2. 5mm直徑，2mm深和5mm直徑，2mm深，用于溫度測(cè)量)得自Molecular Probes (Eugene, OR) 。 Ru (by) 2C12鹽得自Sigma-Aldrich。市售的化學(xué)發(fā)光材料購自Unique Industries, Inc。
在微波腔中的寬場(chǎng)顯微鏡的光學(xué)設(shè)置 在微波腔(0. 7立方英尺，GE Compact Microwave型號(hào)JES735BF，最大功率700W)的底部鉆1英寸的孔，并將隨后暴露的金屬表面用白色瓷漆覆蓋，以防止產(chǎn)生火花和電弧。使用擴(kuò)束器，將473nm激光源的斑點(diǎn)尺寸擴(kuò)展到約l英寸并且使用在物鏡的后光圈處的175mm透鏡聚焦成斑點(diǎn)。用二向色鏡(z479/532rpc， Chroma, Brattleboro， VT)將入射的激發(fā)光束反射到無限遠(yuǎn)校正的明視野物鏡(LWD Plan Achromat物鏡-LPL10 x物鏡/NA =0.25)中。通過以落射熒光模式工作的寬場(chǎng)激發(fā)所產(chǎn)生的熒光發(fā)射強(qiáng)度通過無限遠(yuǎn)校正的光學(xué)器件收集并且成像到CCD攝像機(jī)上，使用488nm的峰口 (razor edge)和570LP濾波器來阻擋激發(fā)光的任何滲透，如圖l所示?；瘜W(xué)發(fā)光強(qiáng)度圖像通過無限遠(yuǎn)校正的光學(xué)器件成像并在沒有任何光學(xué)過濾器的存在下成像在CCD攝像機(jī)上。用基于4X4面元?jiǎng)澐值腞etiga-SRV CCD Camera (Qlmaging， Burnaby， B.C.)以10fps拍取CCD圖像。使用連接于NA為0. 22的Ocean OpticslOOO ii m直徑纖維(Dunedin， FL)的Ocean Optics光譜儀SD2000型(Dunedin，F(xiàn)L)收集發(fā)射光譜。準(zhǔn)直儀連接于纖維的末端并定位為使熒光發(fā)射進(jìn)入光譜儀的偶聯(lián)最大化。以100毫秒的積分時(shí)間收集Ru(by)2Cl2時(shí)間依賴性發(fā)射光譜。物鏡和適配的光學(xué)器件的所有暴露的金屬表面都用白色反射性涂漆覆蓋，以防止在施加微波脈沖過程中產(chǎn)生火花和電弧。 在APS覆層的玻璃襯底上形成連續(xù)的金屬薄膜 由'蝶形領(lǐng)結(jié)'結(jié)構(gòu)改性的玻璃載片的制備以前已有描述[23]。簡(jiǎn)而言之，由粘合劑掩模制成不相交的'蝶形領(lǐng)結(jié)'等邊2. 5mm三角形模板(stencil)。由兩個(gè)5mm倒三角形形成不相交的'蝶形領(lǐng)結(jié)'結(jié)構(gòu)，使得頂端之間的距離或間隙尺寸為約2-3mm，如圖2中所示。將三角形膠帶掩模附著于普通玻璃載片并通過使用EMF Corp. (Ithaca， NY)汽相淀積儀器氣相淀積75nm的Au薄膜產(chǎn)生用Ag三角形結(jié)構(gòu)改性的玻璃載片。在淀積工藝過程中使用Edwards FTM6膜厚監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)薄膜厚度。
樣品制備 將經(jīng)過改性或者未經(jīng)改性的'蝶形領(lǐng)結(jié)'金屬結(jié)構(gòu)的玻璃襯底切成lOXlOmm樣品大小。將成像孔置于兩個(gè)淀積的75nm厚的Au三角形之間或'蝶形領(lǐng)結(jié)'間隙處和未改性的普通玻璃襯底上。隨后為樣品填充20 ill的10 M Ru(by)2Cl2溶液或6 y 1的化學(xué)發(fā)光材料(圖2)。 化學(xué)發(fā)光試劑(化學(xué)反應(yīng)試驗(yàn)) 市售的輝光條(glow stick)包含苯基草酸酯、熒光探針和包含活性劑(過氧化氫)的玻璃包膜。通過將被密封的包含過氧化物的玻璃包膜破壞、隨后將化學(xué)品混合以開始化學(xué)發(fā)光反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)化學(xué)品的活化。過氧化氫將苯基草酸酯氧化為過氧酸酯和苯酚[24]。不穩(wěn)定的過氧酸酯分解為過氧化合物和苯酚，這是一個(gè)化學(xué)上誘導(dǎo)電子受激發(fā)狀態(tài)的過程[24]。 Ru(by)2Cl2溫度測(cè)量 預(yù)先地，已經(jīng)使用氯化釕水溶液來校準(zhǔn)具有CCD傳感器的溫度成像系統(tǒng)[25]。已知的是，這種溶液的發(fā)射強(qiáng)度隨溫度而降低。氯化釕水溶液的光物理學(xué)和光化學(xué)性質(zhì)的溫度依賴性已經(jīng)在其它地方有所詳述[26，27]。隨后，使用帶有溫度控制器的Cary Eclipse熒光分光計(jì)記錄10 ii M的Ru (by)2Cl2水溶液的預(yù)先校準(zhǔn)的強(qiáng)度_溫度曲線。校準(zhǔn)溫度為10、20、30、40、50、60和70°C ，所述溫度處于相對(duì)熒光與溫度之間的線性關(guān)系范圍內(nèi)，如圖3中所示[25]。 對(duì)于微波成像實(shí)驗(yàn)，在有和沒有薄的連續(xù)金屬膜三角形幾何結(jié)構(gòu)(75nm厚)的存在下測(cè)量在玻璃襯底上的10 ii M的Ru(by)2Cl2水溶液的熒光發(fā)射強(qiáng)度。Ru(by)2Cl2水溶液用473nm激光源激發(fā)。在施加5秒的低功率2. 45GHz微波脈沖(10%功率)之前和過程中，使用圖1的纖維檢測(cè)和光譜儀光學(xué)構(gòu)型以100毫秒時(shí)間間隔記錄Ru(by)^l2水溶液的光譜發(fā)射歷時(shí)20秒。將在施加微波脈沖之前和施加過程中在玻璃襯底和'蝶形領(lǐng)結(jié)'改性襯底上記錄的Ru(by)2Cl2水溶液的熒光光譜強(qiáng)度歸一化，如圖3中所示。 將經(jīng)過歸一化的光譜疊加，以確定微波場(chǎng)是否誘導(dǎo)Ru(by)2Cl2發(fā)射的任何光譜變化，如圖4中所示。將CCD時(shí)間依賴性強(qiáng)度相對(duì)于最大發(fā)射強(qiáng)度(時(shí)間=0)歸一化。歸一化強(qiáng)度比計(jì)算為在暴露于短微波脈沖過程中的時(shí)間依賴性發(fā)射強(qiáng)度與暴露于短微波脈沖之前的最大發(fā)射強(qiáng)度的比值。隨后，將這些比值乘以0.9的系數(shù)(圖3，RT)，以反映在室溫下的lOyM Ru(by)^l2水溶液的經(jīng)過歸一化的強(qiáng)度比值(圖4)。隨后，可以從相同濃度的Ru(by)2Cl2樣品的經(jīng)過預(yù)先校準(zhǔn)的強(qiáng)度-溫度曲線估算在玻璃襯底和在具有蝶形領(lǐng)結(jié)幾何結(jié)構(gòu)的襯底上的經(jīng)過微波加熱的溶液的相應(yīng)溫度值(圖3，箭頭和虛線)。
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使用CCD攝像機(jī)以10Hz的幀頻捕獲Ru(by)2Cl2水溶液和化學(xué)發(fā)光樣品的總發(fā)射強(qiáng)度圖像(圖6-10)。為了獲得對(duì)于所有測(cè)量是相同的初始化學(xué)發(fā)光發(fā)射，將大約6iU的化學(xué)發(fā)光溶液置于成像室內(nèi)。數(shù)據(jù)收集在施加五秒微波脈沖之前io秒開始并且持續(xù)到微波暴露之后的20秒。
結(jié)果和討論 因?yàn)楣J(rèn)的是Ru(by)^l2溶液的發(fā)射強(qiáng)度與溫度成反比，所以在一定的溫度范圍內(nèi)記錄Ru(by)2Cl2的發(fā)射光譜[28]。從這些光譜，對(duì)于10°C _701:之間的10 y M的Ru(by)2Cl2溶液，觀察到在發(fā)射強(qiáng)度和溫度之間存在線性關(guān)系，這與以前發(fā)表的結(jié)果一致[23]。使用光學(xué)方案的纖維檢測(cè)構(gòu)造(圖1)，以100毫秒的時(shí)間間隔記錄Ru(by)2Cl2水溶液的熒光強(qiáng)度，持續(xù)大約60秒。在60秒記錄過程中，施加了五秒的2. 45GHz脈沖微波脈沖。將相同濃度的Ru(by)^l2樣品的經(jīng)過歸一化的強(qiáng)度-溫度曲線擬合到線性函數(shù)(數(shù)據(jù)未示出)。分別用箭頭和虛線標(biāo)記近似的由微波誘導(dǎo)的對(duì)玻璃和'蝶形領(lǐng)結(jié)'樣品幾何結(jié)構(gòu)上的溶液產(chǎn)生的最大溫度升高，如圖3中所示。 盡管在二向色鏡的存在下僅一部分Ru(by)2Cl2光譜被透射，但是在施加微波脈沖之前的疊加的經(jīng)過歸一化的Ru(by)2Cl2強(qiáng)度譜表示在圖4中。典型地，發(fā)色團(tuán)發(fā)射的光譜移動(dòng)歸因于電子躍遷能量的電子分布變化[29]。因?yàn)樵谑┘游⒉}沖(圖4，黑線)之前的Ru(by)2Cl2溶液的經(jīng)過歸一化的強(qiáng)度譜在施加低功率微波脈沖過程中(圖4，點(diǎn)劃線)沒有改變，推斷微波加熱沒有引起Ru(by)2Cl2溶液的光物理學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生任何值得注意的變化[29]。 使用CCD成像構(gòu)造，在有和沒有'蝶形領(lǐng)結(jié)'結(jié)構(gòu)的情況下以10Hz的幀頻記錄在微波腔中的玻璃襯底上的Ru(by)2Cl2水溶液的熒光強(qiáng)度圖像，持續(xù)10秒(圖5)。
在圖像收集過程中，樣品暴露于五秒的微波脈沖。在100像素2區(qū)域上求取微波處理前的熒光強(qiáng)度的平均值，所述區(qū)域選自圖像中心(圖5，插圖，方框輪廓)。將在不相交的'蝶形領(lǐng)結(jié)'接合點(diǎn)處和在普通玻璃載片(對(duì)照)上的10iiM Ru(by)^l2溶液的CCD圖像的平均強(qiáng)度_時(shí)間數(shù)據(jù)相對(duì)于微波處理前的最大熒光強(qiáng)度歸一化(圖5)并且按比例縮放為預(yù)經(jīng)過先校準(zhǔn)的室溫下的歸一化強(qiáng)度(圖3和9，室溫)。在暴露于微波脈沖過程中，觀察到玻璃襯底上的10y M Ru(by)2Cl2的熒光強(qiáng)度略有降低，對(duì)應(yīng)于約5-8t:的溫度升高(圖5-右上插圖)。另一方面，在暴露于微波脈沖過程中觀察到在'蝶形領(lǐng)結(jié)'幾何結(jié)構(gòu)的間隙中10iiMRu(by)2Cl2溶液的熒光強(qiáng)度有顯著降低(圖5-右下插圖)，使人想到發(fā)射與溫度成反比。 相對(duì)于10iiM Ru(by)^l2溶液強(qiáng)度-溫度的校準(zhǔn)曲線，玻璃襯底上的溶液溫度升高，略高于室溫(圖3，玻璃)，而在'蝶形領(lǐng)結(jié)'幾何結(jié)構(gòu)的間隙中的10iiM Ru(by)^^溶液的強(qiáng)度變化符合溫度-強(qiáng)度曲線的線性范圍以外的顯著的溫度下降(圖3，虛線)。本文中顯示了這些溶液在暴露于低功率微波脈沖過程中的熒光強(qiáng)度降低的實(shí)時(shí)電影記錄，以證明微波腔中的熒光顯微鏡的功能性，如圖6A， B中所示。 除了溫度依賴性的Ru(by)2Cl2溶液的實(shí)時(shí)成像之外，化學(xué)發(fā)光溶液的局部'觸發(fā)'也被成像，以便進(jìn)一步驗(yàn)證顯微鏡在微波原理中的有效性。將6iU的藍(lán)色化學(xué)發(fā)光溶液置于被附著到普通玻璃襯底的成像孔中以及位于連續(xù)的金薄膜'蝶形領(lǐng)結(jié)'幾何結(jié)構(gòu)的2mm間隙中[23,30]。以10Hz的幀頻記錄化學(xué)發(fā)光發(fā)射歷時(shí)10秒(圖7)。在10秒的時(shí)間間隔期間，樣品暴露于五秒的微波脈沖下，這誘導(dǎo)'被觸發(fā)的'發(fā)射或最大光子通量的顯著增 加，如圖7中所示。 在圖7中標(biāo)記離散的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)應(yīng)于a)穩(wěn)態(tài)發(fā)射、b)在初始暴露于微波脈沖時(shí)的 發(fā)射、c)在微波脈沖開始過程中和d)在脈沖過程中的最大'觸發(fā)'發(fā)射、e)最終的微波發(fā) 射。在記錄不相交的'蝶形領(lǐng)結(jié)'幾何結(jié)構(gòu)強(qiáng)度圖像過程中，以約4. 5的系數(shù)降低CCD攝像 機(jī)增益，以防止飽和。隨后，相應(yīng)地將得到的'蝶形領(lǐng)結(jié)'幾何結(jié)構(gòu)的CCD像素強(qiáng)度等級(jí)，以 得到與從玻璃襯底記錄的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的絕對(duì)對(duì)比。示出了在這些離散的時(shí)間點(diǎn)的對(duì)于普 通玻璃襯底(圖8)以及在不相交的'蝶形領(lǐng)結(jié)'接合點(diǎn)處(圖9)的化學(xué)發(fā)光發(fā)射的CCD圖 像。 玻璃和'蝶形領(lǐng)結(jié)'圖像二者的像素強(qiáng)度等級(jí)是相等的，以便精確地反映得自化學(xué) 發(fā)光反應(yīng)的'按需'光子通量的顯著增加。此外，本文中顯示了在暴露于低功率微波脈沖過 程中由化學(xué)發(fā)光溶液產(chǎn)生的'光子通量'增加的實(shí)時(shí)電影記錄，以便證明熒光顯微鏡在微波 中的功能性，如圖IOA， B中所示。 本文中已經(jīng)證明了在微波腔中構(gòu)建熒光顯微鏡的可行性。使用這種光學(xué)構(gòu)造，在 普通玻璃襯底上以及在接近離散的平坦構(gòu)造幾何結(jié)構(gòu)附近觀察到10 ii M Ru(by、Cl2溶液的 由微波誘導(dǎo)的實(shí)時(shí)溫度降低?；瘜W(xué)發(fā)光發(fā)射結(jié)果顯示'蝶形領(lǐng)結(jié)'幾何結(jié)構(gòu)的化學(xué)發(fā)光發(fā)射 有大約100倍的增加。關(guān)于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的'觸發(fā)'，所述'觸發(fā)'的發(fā)射從由磁控管產(chǎn)生的 入射微波場(chǎng)最近的一側(cè)開始?；瘜W(xué)發(fā)光溶液的CCD圖像描述了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)由于化學(xué)發(fā)光 溶液的微波加熱或介電損耗而得以促進(jìn)。因?yàn)閳D像(圖9B)的右側(cè)定向?yàn)樽羁拷趴毓埽?可以看到'觸發(fā)'的發(fā)射從最靠近微波源的一側(cè)開始。在隨后的圖像(圖9C)中，觀察到由 微波腔的遠(yuǎn)側(cè)壁反射的波引起的觸發(fā)發(fā)射(注釋在微波腔中產(chǎn)生駐波)。重要的是，'蝶 形領(lǐng)結(jié)'端部略加偏移，以便于觀察微波腔中的由反射波引起的'觸發(fā)'發(fā)射。
使用本文中所述的微波聚焦和觸發(fā)技術(shù)，證明了捕獲由微波誘導(dǎo)的溶液加熱和被 加速的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的實(shí)時(shí)圖像的可行性。
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權(quán)利要求
微波/光學(xué)成像系統(tǒng)，包括a)被封閉的容器，其包括微波腔并且在其中具有至少一個(gè)開口；b)設(shè)置于微波腔中用于保持至少一個(gè)樣品的樣品板，其中樣品包括檢測(cè)劑分子或進(jìn)行能夠被檢測(cè)的反應(yīng)的組分；c)通信連接于微波腔用于將微波能量遞送進(jìn)微波腔中并朝向樣品引導(dǎo)的微波能量產(chǎn)生源；和d)通信連接于微波腔的光學(xué)成像裝置，其設(shè)置為用于將來自電磁能量產(chǎn)生源的激發(fā)光引導(dǎo)到樣品并且捕獲由樣品發(fā)射的發(fā)光發(fā)射。
2. 權(quán)利要求l的系統(tǒng)，其中所述微波腔包括用于保持樣品板的平臺(tái)。
3. 權(quán)利要求l的系統(tǒng)，其中所述檢測(cè)劑分子是熒光團(tuán)。
4. 權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中被遞送的微波能量具有2GZ-3GZ的頻率和約10毫瓦特-700 瓦特的功率水平。
5. 權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中樣品包括至少一種生物分子，其中所述生物分子選自核酸、 芳香碳環(huán)結(jié)構(gòu)、NADH、 FAD、氨基酸、蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物、甾族化合物、核黃素、DNA、 RNA、 寡核苷酸、核酸、脂肪酸、肌紅蛋白、糖類例如葡萄糖等、維生素、輔助因子、嘌呤、嘧啶、間型 霉素、脂質(zhì)、植物光敏色素、phytofluor、肽、脂質(zhì)、抗體和藻膽蛋白。
6. 權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述光學(xué)成像裝置包括 用于以一定頻率產(chǎn)生能量來激發(fā)樣品的電磁能量產(chǎn)生源； 設(shè)置用于將電磁能量聚焦在樣品上的物鏡；設(shè)置在激光器和物鏡之間的二向色鏡，用于將來自能量源的電磁能量反射到物鏡以及 用于引導(dǎo)來自受激發(fā)的樣品的發(fā)射信號(hào)；設(shè)置在二向色鏡后面的管透鏡，用于收集來自樣品的發(fā)射并將其引導(dǎo)到檢測(cè)器裝置。
7. 權(quán)利要求6的系統(tǒng)，其中所述物鏡捕獲由受激發(fā)的樣品發(fā)射的信號(hào)。
8. 權(quán)利要求l的系統(tǒng)，其中所述樣品板包括沉積在樣品板表面上的至少一層金屬材 料，其中所述金屬材料包括銀、金、銅、鋅、鋁或鉑。
9. 權(quán)利要求8的系統(tǒng)，其中所述金屬材料形成為帶圖案的形狀。
10. 權(quán)利要求9的系統(tǒng)，其中所述帶圖案的形狀包括具有至少一個(gè)頂端的幾何形狀并 且其中多個(gè)頂端彼此相鄰或相對(duì)從而在其之間產(chǎn)生反應(yīng)性區(qū)域。
11. 權(quán)利要求10的系統(tǒng)，其中所述幾何形狀選自三角形、正方形、矩形、梯形、多邊形、 拋物線形、橢圓形、圓的扇形，及其組合。
12. 權(quán)利要求10的系統(tǒng)，其中將至少一個(gè)樣品置于反應(yīng)性區(qū)域中并接觸微波能量且受 激發(fā)能量輻射。
13. 權(quán)利要求12的系統(tǒng)，其中所述樣品板包括多個(gè)孔，其中所述反應(yīng)性區(qū)域位于所述 孔內(nèi)并且暴露于微波能量下增強(qiáng)其中的反應(yīng)。
14. 權(quán)利要求12的系統(tǒng)，其中所述反應(yīng)性區(qū)域具有的在相鄰和相對(duì)頂端之間的距離為 2mm到約3mm。
15. 權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述樣品板由玻璃或聚合材料制成。
16. 使由微波誘導(dǎo)的生物分子的反應(yīng)或相互作用實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)成像的方法，所述方法包括a) 提供包括至少一種生物分子和檢測(cè)劑分子的樣品，其中將所述樣品設(shè)置在樣品板上；b) 將樣品置于微波腔中，其中所述微波腔通信連接于微波產(chǎn)生源并且還通信連接于光學(xué)成像系統(tǒng)，其中所述光學(xué)成像系統(tǒng)包括用于以一定頻率產(chǎn)生能量來激發(fā)樣品的電磁能量產(chǎn)生源；設(shè)置用于從所述電磁能量產(chǎn)生源接受激發(fā)電磁能量并將其聚焦在樣品上的物鏡；設(shè)置在激光器和物鏡之間的二向色鏡，用于將來自能量源的電磁能量反射到物鏡以及用于引導(dǎo)來自樣品的發(fā)射信號(hào)；設(shè)置在二向色鏡后面的管透鏡，用于收集來自樣品的發(fā)射并將其引導(dǎo)到檢測(cè)器裝置；c) 用一定量的低功率微波能量輻射樣品以增加樣品中的相互作用或反應(yīng)；禾口d) 用步驟b)的光學(xué)成像系統(tǒng)將檢測(cè)劑分子的發(fā)射信號(hào)成像。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中生物分子的相互作用包括在表面處、在溶液中以及在活生物體中的蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)、DNA-蛋白質(zhì)、RNA-蛋白質(zhì)、DNA-RNA、化學(xué)品_蛋白質(zhì)、化學(xué)品-DNA相互作用。
18. 權(quán)利要求16的方法，其中所述反應(yīng)包括產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)的化學(xué)反應(yīng)。
19. 權(quán)利要求16的方法，其中所述微波腔包括用于保持樣品板的平臺(tái)。
20. 權(quán)利要求16的方法，其中所述低功率微波能量具有2GZ-3GZ的頻率和約10毫瓦特-700瓦特的功率水平。
21. 權(quán)利要求16的方法，其中所述樣品包括至少一種生物分子，其中所述生物分子選自核酸、芳香碳環(huán)結(jié)構(gòu)、NADH、 FAD、氨基酸、蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物、甾族化合物、核黃素、DNA、 RNA、寡核苷酸、核酸、脂肪酸、肌紅蛋白、糖類例如葡萄糖等、維生素、輔助因子、嘌呤、嘧啶、間型霉素、脂質(zhì)、植物光敏色素、phytofluor、肽、脂質(zhì)、抗體和藻膽蛋白。
22. 權(quán)利要求16的方法，其中所述樣品板包括沉積在樣品板表面上的至少一層金屬材料，其中所述金屬材料包括銀、金、銅、鋅、鋁或鉑。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中所述金屬材料形成為帶圖案的形狀。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述帶圖案的形狀包括具有至少一個(gè)頂端的幾何形狀并且其中多個(gè)頂端彼此相鄰或相對(duì)從而在其之間產(chǎn)生反應(yīng)性區(qū)域。
25. 權(quán)利要求24的方法，其中所述幾何形狀選自三角形、正方形、矩形、梯形、多邊形、拋物線形、橢圓形、圓的扇形及其組合。
26. 權(quán)利要求24的方法，其中將至少一個(gè)樣品置于反應(yīng)性區(qū)域中并接觸微波能量且受激發(fā)能量輻射。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述樣品板包括多個(gè)孔，其中所述反應(yīng)性區(qū)域位于所述孔內(nèi)并且暴露于微波能量下增強(qiáng)其中的反應(yīng)。
28. 權(quán)利要求26的方法，其中所述反應(yīng)性區(qū)域具有的在相鄰和相對(duì)頂端之間的距離為2mm到約3mm。
29. 權(quán)利要求16的方法，其中所述樣品板由玻璃或聚合材料制成。
全文摘要
本發(fā)明涉及通信連接于微波能量產(chǎn)生源的光學(xué)成像系統(tǒng)，其中該組合提供化學(xué)反應(yīng)時(shí)間的提高以及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的能力，并且具有足夠的分辨率以便在施加微波場(chǎng)的過程中觀察活細(xì)胞和組織中的用熒光分子標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)組分的位置以及與其它生物分子之間的相互作用和對(duì)局部化環(huán)境變化的響應(yīng)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101743467SQ200880024921
公開日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2008年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月4日
發(fā)明者克里斯·D·格迪斯, 邁克爾·J·R·普雷維特 申請(qǐng)人:馬里蘭大學(xué)生物技術(shù)研究所